Alérgenos recombinantes: puntos fuertes en el 2006

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INFORME CIENTiFICO
Alérgenos recombinantes:
puntos fuertes en el 2006
Hasta la fecha se han identificado y caracterizado más de 500 alérgenos gracias a las técnicas
de la biología molecular (clonación y secuenciación). Desde entonces, ha sido posible
reemplazar los extractos biológicos naturales mediante alérgenos recombinantes producidos
por ingeniería genética, utilizables para fines diagnósticos y terapéuticos.
De los extractos naturales a las
vacunas recombinantes
La producción de alérgenos
recombinantes mediante técnicas biotecnológicas abre la
puerta a nuevos tratamientos de
desensibilización.
a inmunoterapia específica es el
único tratamiento curativo específico de las alergias IgE mediadas
(tipo I). Este método es particularmente beneficioso en la rinitis alérgica, el
asma de leve a moderada y la hipersensibilidad a los venenos de himenópteros.
L
Los extractos naturales son mezclas
protéicas complejas
Actualmente, la ITE consiste en administrar por vía subcutánea o sublingual extractos solubles preparados a partir de una
fuente natural de alérgenos (cultivos de
ácaros, pólenes, hongos, epitelios, etc.).
Estos extractos alergénicos son en realidad mezclas protéicas complejas formadas por una par te por alérgenos
mayoritarios y minoritarios y, por otra parte,
por compuestos biológicos inactivos como
proteínas, glucoproteínas e hidratos de
carbono.
Esta heterogeneidad comporta la aplicación de procedimientos de estandarización
específicos que garanticen la uniformidad de la producción lote a lote.
La estandarización se basa principalmente
en la capacidad global de fijación del
extracto a las IgE (es decir, en la actividad
alergénica total). Hoy en día se utilizan
nuevas tecnologías (SELDITOF, electroforesis 2D y
PF2D) para obtener un perfil preciso de las proteínas
presentes en el extracto. No
obstante, estos métodos no
son cuantitativos y no pueden servir de base para el
calibrado o el control de
calidad de los lotes farmacéuticos [1].
Principales
características
de los alérgenos
recombinantes
Propiedades
Contribución de los alérgenos
recombinantes a las futuras terapias
con alérgenos
Un estudio multicentro europeo que utiliza la vía
subcutánea ha mostrado por primera vez que los
alérgenos recombinantes (en particular Bet v 1) son tan
eficaces como los alérgenos naturales [2]. Actualmente
están en curso ensayos clínicos con comprimidos
sublinguales de Bet v 1.
A largo plazo, la optimización de los adyuvantes y de la
formulación debería permitir una mejora sustancial en
el tratamiento de las alergias respiratorias. Con esta
idea se han desarrollado los alérgenos mejorados
(Enhanced Allergens) con el fin de definir un prototipo
de tratamiento sublingual recombinante.
Comparados con los
extractos alergénicos, los
alérgenos recombinantes
presentan múltiples ventajas [1]:
- están perfectamente
caracterizados a nivel
molecular e inmunoquímico;
- están altamente purificados;
- son fáciles de estandarizar;
- permiten un diagnóstico y un tratamiento
más preciso.
¿Naturales o hipoalergénicos?
Los alérgenos recombinantes denominados de “tipo natural” se producen
para imitar a los alérgenos naturales
hasta el mínimo detalle. El término “natural” se utiliza por contraposición al término “hipoalergénico” que caracteriza a los
Las ventajas de
los alérgenos
recombinantes
se expresan
en términos
de pureza,
reproducibilidad,
trazabilidad y
rendimiento.
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INFORME CIENTiFICO
La estrategia en
ITSL se basa
en utilizar
alérgenos
recombinantes
de configuración
natural para que
las células
dendríticas
de tipo
Langerhans de
la mucosa oral
los reconozcan y
los capturen.
alérgenos modificados mediante mutagenia dirigida o alteración de la estructura
tridimensional, para reducir su capacidad de fijación a las IgE.
En teoría, las formas hipoalergénicas
deberían producir vacunas más seguras
por vía subcutánea, pero su interés en
inmunoterapia sublingual (ITSL) está poco
definido. De hecho, parece preferible la
presentación de los alérgenos recombinantes en su configuración natural en la
medida en que hay pocos mastocitos a
nivel de la mucosa sublingual por una
parte y, por otra, la identificación por parte
de las IgE permite localizar a las células
dendríticas de tipo Langerhans FcεRI+
capaces de producir TGF-β e IL-10 [3].
Métodos de producción
A partir de una fuente de alérgenos, el
ARN mensajero (ARNm) se aísla y se utiliza de matriz para la síntesis del ADN
complementario (ADNc) correspondiente
(Figura 1). La etapa siguiente es la amplificación mediante la técnica de PCR (polymerase chain reaction) del gen codificante
para el alérgeno identificado (lista de consulta en www.allergome.com). El gen se
inserta seguidamente en el vector apropiado, generalmente un plásmido, para
facilitar su expresión en un organismo
anfitrión.
Los diferentes sistemas anfitrión
Los sistemas de expresión procariota
como las bacterias (Escherichia coli) producen las proteínas recombinantes sin
ninguna modificación postraduccional.
Así, es posible obtener, en la mayoría de
los casos y de manera fácil, rápida y a
bajo coste, alérgenos con una reactividad
comparable a aquella de la forma natural. Sin embargo, si se necesita una configuración espacial par ticular o
modificaciones postraduccionales como
la glucosilación, se puede recurrir a un
sistema de expresión eucariota como
las levaduras ( P i c h i a p a s t o r i s ,
Saccharomyces cerevisiae), los baculovirus de insectos y diferentes vegetales
como las plantas del tabaco (Nicotiana
tabacum) de la cebada. Estos sistemas
no inducen necesariamente una glucosilación idéntica a aquella de la glucoproteína natural.
La elección del sistema de expresión
depende por consiguiente del carácter de
la proteína que hay que expresar y de su
ulterior utilización.
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La depuración
Al final del proceso de fermentación y de
inducción de la expresión del gen, la proteína recombinante se depura mediante
métodos cromatográficos apropiados. Los
niveles de caracterización y de estandarización obtenidos con los alérgenos
recombinantes serán, en principio, muy
superiores a los que se puedan obtener
con los extractos alergénicos: homología,
pureza, concentración alergénica, actividad y posibles niveles de contaminación.
Adyuvantes y galénica
Las proteínas altamente depuradas
o recombinantes son poco inmunogénicas, por lo que resulta necesario un adyuvante para inducir las respuestas inmunes
adeduadas enviando una señal conjunta
a las células inmunitarias [1,4].
En latín, adjuvare significa “ayudar”, de
manera que un adyuvante se puede definir como la molécula biológica o sintética
que ayuda a modular la respuesta inmunitaria cuando se asocia a un antígeno.
¿Qué interés tienen los
adyuvantes?
Se utilizan adyuvantes con distintos objetivos:
- para aumentar la eficacia de la vacuna;
- para reducir las dosis conservando la eficacia;
- para simplificar su administración.
¿Qué adyuvante elegir?
Se conoce bien el papel de mediación
de los linfocitos T reguladores y de las
citocinas inmunosupresoras (IL-10 y
TGF-β) en la ITE y en la respuesta
inmune normal a los alérgenos [5].
Por ello, los adyuvantes capaces de
inducir células dendríticas tolerógenas
y/o linfocitos T reguladores podrían ser
buenos candidatos [1, 4]. Se establecieron modelos humanos (cultivo de
células dendríticas derivadas de monocitos y de linfocitos T) y modelos animales (ratones Balb/c sensibilizados a
la albúmina de huevo) para seleccionar adyuvantes candidatos (Figura 2).
Los resultados de nuestros trabajos
sugieren que la combinación de 1α,25dihidroxivitamina D3 y de dexametasona o de bacterias lácticas como el
Lactobacillus plantarum, puede inducir a
que los linfocitos T humanos tengan una
elevada producción de IL-10 y aumente
la eficacia de la ITSL en los ratones
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Figura 1: Principales etapas en la producción de
alérgenos recombinantes
sensibilizados tras coadministrarles albúmina de huevo.
Presentaciones galénicas
Fuente de alérgenos
Las presentaciones galénicas innovadoras
en forma de comprimidos, biofilms o polvos mucoadhesivos también se pueden
utilizar para aumentar el tiempo de contacto
con la mucosa sublingual y facilitar la estimulación de las células dendríticas locales [1, 4]. Nuestro trabajos muestran que
esta presentación mucoadhesiva de la
albúmina de huevo aumenta la eficacia
de la ITSL en los ratones sensibilizados a
ésta.
Aislamiento/depuración de ARNm
Transcripción inversa en ADNc
Sonda = cebador oligonucleótido
Amplificación del gen con PCR
Dr. L. Van Overtvelt
Antony (Francia)
Vectores
Inserción en el vector (clonación)
Conclusión
La producción de alérgenos recombinantes abre las puertas al desarrollo
de pruebas diagnósticas y de nuevos
tratamientos de desensibilización.
Ya existen alérgenos recombinantes
para las pruebas diagnósticas in vitro y
representan una ayuda para los pacientes con sensibilizaciones múltiples, ya
que permiten identificar mejor las alergias cruzadas y así orientar la ITE.
También se podrían utilizar en el futuro
para las pruebas diagnósticas in vivo:
cutáneas y de provocación.
Los tratamientos con alérgenos recombinantes seguramente marcarán un hito
durante los próximos años en el tratamiento de las patologías alérgicas.
Vectores recombinados
Transformación del anfitrión
P. pastoris
E. coli
Producción y selección de
los transformados, y posterior purificación
Proteína recombinante
Figura 2: Selección de adyuvantes candidatos
IL-12R
Modelo humano in vitro
CD4+
Tbet
IFN-γ
Th1
Adyuvantes
iDC
1- Moingeon P. Sublingual immunotherapy: from biological
extracts to recombinant allergens. Allergy 2006; 61
(Suppl. 81): 15-9.
2- Pauli G, Mallin H, Rak S et al. Clinical efficacy of
subcutaneous immunotherapy in birch pollen allergic
patients: a randomized, double-blind, placebo-controlled
study with recombinant Bet v 1 versus natural Bet v 1 or
standardized birch extract. XXVe EAACI, Vienna, 10-14
june 2006 [Abstract 83].
3- Novak N. Targeting dendritic cells in allergen
immunotherapy. Immunol Allergy Clin North Am 2006;
26: 307-19.
4- Mascarell L, Van Overtvelt L, Moingeon P. Novel ways for
immune intervention in immunotherapy: Mucosal allergy
vaccines. Immunol Allergy Clin North Am 2006; 26: 283306.
5- Moingeon P, Batard T, Fadel R, Frati F, Sieber J,
Van Overtvelt L. Immune mechanisms of allergen-specific
sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61: 151-65.
DC
+
24 h
Linfocito
CD4+Th0
indiferenciado 7 días
CD4+
GATA 3
IL-4
Th2
ICOS
CD inmadura
CD modulada
CD4+
Treg
Análisis del fenotipo y de la
producción en las citocinas
Foxp3
TGF-β
IL-10
Análisis de la expresión de los genes
Modelo murino in vivo
Análisis de las
funciones
respiratorias,
respuestas humorales,
celulares
e inflamación
0 14
i.p.
OVA+Alum
21 22 23 24 25
Aerosol
OVA
Sensibilización
28
88
93
Tratamiento sublingual
Sacrificio
2 veces/semana durante 2 meses
OVA +/- adyuvante o formulación
Desensibilización
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INFORME CIENTiFICO
Los alérgenos recombinantes: nuevos
instrumentos biológicos
Debido a sus características, y en particular a su pureza, los alérgenos recombinantes
son instrumentos muy útiles para el estudio
de los extractos alergénicos y su etiología,
para el diagnóstico y para el tratamiento de
la enfermedad alérgica.
n alérgeno recombinante es una
molécula producida mediante
técnicas de ingeniería genética que
permiten identificar y posteriormente reproducir determinadas proteínas de
un extracto de alérgenos. La mayor parte de
los alérgenos recombinantes existentes se
expresa en Escherichia coli y generalmente
son comparables a las moléculas naturales,
tanto desde el punto de vista estructural como
de su secuencia de aminoácidos.
Su designación se establece según una
nomenclatura oficial (www.allergen.org). Se
asocian según sus funciones bioquímicas,
por lo que encontramos grupos de proteínas
estructurales, de regulación, de reserva, de
tipo PR (pathogenesis-related), etc.
geográfica, así como reacciones cruzadas
entre fuentes de alérgenos aparentemente
alejadas. En concreto, la posibilidad que
ofrece la cuantificación de IgE específica de
alérgenos recombinantes de poner de manifiesto perfiles de sensibilización, ha permitido
explicar por qué en el norte de Europa los síntomas característicos de la alergia a la fruta
y a la verdura suelen ser de tipo oral, mientras que en el sur de Europa los pacientes
suelen presentar síntomas sistémicos.
Efectivamente, el estudio de estos perfiles
muestra que en el norte de Europa domina la
sensibilización al Bet v 1 (alérgeno mayoritario del abedul), orientando las sensibilizaciones hacia reacciones homólogas de esta
proteína presente en otras especies. Por el
contrario, en la zona mediterránea domina la
sensibilización a las proteínas de transferencia de lípidos (LTP), lo que induce la predominancia de una verdadera alergia
alimentaria.
Comprender mejor la epidemiología
de las alergias
Determinar perfiles de reactividad y
analizar las reacciones cruzadas
Las pruebas in vitro con alérgenos recombinantes permiten estudiar fenómenos complejos como, por ejemplo, diferencias de
reactividad clínica en función de la ubicación
Los alérgenos recombinantes han abierto un
nuevo campo de investigación que ya aporta
información antes inaccesible. Por ejemplo, en
una fuente de alérgeno como el polen de
U
Los alérgenos del abedul
Alérgeno
rBet v 1
rBet v 2
rBet v 3
rBet v 4
rBet v 6
rBet v 7
Peso molecular
17kDa
15kDa
23kDa
8kDa
34kDa
18kDa
Si
Si
No
Si
Si
No
PR-10
Profilina
CBP
Polcalcina
Polcalcina
Isoflavona
reductasa
Ciclofilina
Pólenes de árboles:
Orden Fagales,
roble, castaño
Alimentos de origen
vegetal: zanahoria,
apio, manzana,
pera, cereza,
avellana…
Numerosos
pólenes y
alimentos
de origen
vegetal
Únicamente
pólenes
Alimentos de
origen vegetal:
pera,
melocotón,
naranja, lichi,
calabacín,
zanahoria
InmunoCAP
disponible
Nombre
Reacciones
cruzadas
10
s
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abedul, permiten precisar la/s molécula/s (responsable/s) de los síntomas (Tabla pág. 10).
También permiten determinar, cuando las plantas son
taxonómicamente próximas y polinizan durante el
mismo periodo, qué fuente de alérgeno es realmente
responsable de los síntomas. Pronto, utilizando un análisis con alérgenos recombinantes, será posible comprender qué proteínas pueden inducir la reacción
clínica y cuales provocar las reaciones cruzadas, y
así deducir los pasos a seguir para ofrecer el mejor tratamiento posible al paciente. De todos modos, ya es
posible obtener perfiles de reactividad con dosis de IgE
específicas de alérgenos recombinantes complementadas con dosis tradicionales, lo que permite comprender el origen de las reacciones y analizar las
interacciones potenciales heteroespecíficas.
Ya se puede determinar también un perfil de sensibilización antes de un tratamiento con inmunoterapia
específica para evaluar si las reacciones alérgicas del
paciente están provocadas por la sensibilización al
alérgeno mayoritario de una materia prima alergénica
(por ejemplo, el Bet v 1 en el polen de abedul). En este
caso, el paciente responderá probablemente mejor a
la inmunoterapia porque los extractos contienen cantidades elevadas y controladas del alérgeno mayoritario.
Mejorar la sensibilidad de las pruebas
diagnósticas
Actualmente, los alérgenos recombinantes también se
utilizan para mejorar las pruebas in vitro. En algunos
casos, cuando la extracción no permite representar de
forma suficiente un compuesto alergénico específico,
el hecho de añadir al extracto esta proteína obtenida
por ingeniería genética mejora la sensibilidad clínica.
Dos ejemplos concretos de ello son la mejora del látex
mediante el alérgeno recombinante rHev b 5 y, más
recientemente, la mejora de la avellana enriquecida con
rCor a 1.
R. Carbonnel
Departamento médico y de desarrollo, Phadia,
St Quentin en Yvelines (Francia)
Conclusión
Hace 10 años, se presentó el primer alérgeno recombinante en InmunoCAP®. Desde entonces, se han
desarrollado estudios in vitro hasta disponer en la
actualidad de una gama de más de 30 alérgenos
recombinantes.
Nuestros científicos continúan sus investigaciones,
estudiando las consecuencias clínicas y explorando
la mejor forma de utilizar estos nuevos instrumentos.
Estamos convencidos de que los alérgenos recombinantes no sólo son elementos importantes para la
investigación, sino que también se pueden utilizar
en el diagnóstico in vitro de las manifestaciones
alérgicas, para beneficio de los alergólogos y sus
pacientes.
Glosario
● Alérgenos mayoritarios/minoritarios
En una materia prima alergénica (polen, alimento, etc.) se
distinguen:
- Los alérgenos mayoritarios ante los cuales al menos el 50%
de los sujetos sensibilizados a la sustancia ha creado
anticuerpos IgE específicas detectables en sangre.
Ejemplo: Bet v 1 es el alérgeno mayoritario del polen de abedul.
- Los alérgenos minoritarios aparecen en menos del 50% de los
sujetos.
● Citocinas
Son proteínas solubles que transmiten los mensajes entre las
células, actuando de mediadores intercelulares fijándose a
receptores específicos en las células diana. Las citocinas
comprenden las linfocinas, las monocinas, las interleucinas y los
interferones.
● Desensibilización, inmunoterapia
específica, vacunas con alérgenos
Son términos sinónimos que corresponden a un mismo
tratamiento que actúa directamente al nivel de los linfocitos T,
reorientando la respuesta inmunológica del paciente alérgico.
● IL-10
La interleucina-10 es una citocina que disminuye la respuesta
proinflamatoria.
● Mutagenia dirigida
Es la introducción de mutaciones en el ADN para inducir una
modificación localizada de aminoácidos en la secuencia de una
proteína.
● Plásmido
Es un pequeño fragmento circular de ADN extracromosómico
capaz de replicarse de forma autónoma en la célula originaria
y en la célula anfitriona. Los plásmidos son el principal vehículo
de inserción de información genética nueva en los
microorganismos o en las plantas.
● SELDI-TOF
La espectrometría de masa de tipo SELDI-TOF (Surface
Enhanced Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight) se
distingue de los demás tipos de espectrometría de masa por la
posibilidad de retener las proteínas de una muestra de manera
selectiva en diferentes superficies químicas.
● PF2D
Es un sistema de fraccionamiento bidimensional.
● TGF-β
La Transforming Growth Factor.beta es una citocina con
efectos pleótropos. Inhibe principalmente la proliferación de
células linfoides y tiene un efecto inmunodepresor.
● Trazabilidad
Es la posibilidad de seguir un producto en sus diferentes fases
de producción, transformación y comercialización.
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