ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación

ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e
identificación en el laboratorio
Loretta Durán
Esther Damiani
Christian Trigoso
Resumen
Los diferentes miembros del género estafilococos juegan un papel muy importante
como causas de infecciones intrahospitalarias. Se observan elevadas tasas de
resistencia a la meticilina tanto entre cepas de estafilocos coagulasa negativos
como coagulasa positivos de origen intrahospitalario. Tradicionalmente, las
infecciones estafilococcicas de origen comunitario son causadas por cepas de
Staphylococcus aureus susceptibles a la meticilina. En la actualidad, sobre todo
en los países industrializados, se observa el desarrollo de carácter epidémico de
infecciones causadas por Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina de origen
comunitario.
Dicho fenómeno cambia dramáticamente la selección de antimicrobianos
requeridos para su tratamiento. El creciente número de infecciones causadas por
los estafilococos coagulasa negativos y coagulasa positivos y el progresivo desarrollo
de resistencia antimicrobiana hacen que su precisa identificación hasta el nivel de
especie y la determinación de su perfil de susceptibilidad antimicrobiana sean de
alta importancia para el laboratorio de bacteriología. El presente estudio resume los
procedimientos recomendados para el aislamiento, identificación y determinación
de la susceptibilidad antimicrobiana de estos patógenos en laboratorios clínicos de
bacteriología.
Correspondencia:
Dra. “Loretta Ivana Duran Arias”
<loretta.ivana@gmail.com>
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
INTRODUCCIÓN
Los estafilococos son patógenos humanos muy importantes. Se encuentran
ampliamente distribuidos en el medio ambiente. En los seres humanos son parte
de la flora normal de la piel y de la faringe. Producen una gran variedad de
infecciones cuya frecuencia e importancia continúan a acrecentarse.
El género Staphylococcus pertenece a la familia Micrococcaceae. Se
distinguen cerca de 31 especies diferentes. Clínicamente se dividen a los
organismos en dos grupos: los estafilococos coagulasa positivas (S. aureus) y los
estafilococos coagulasa negativas (S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis,
S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, etc.). Las especies más frecuentes y de
mayor importancia clínica son: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y S.
hominis.
TOMA DE MUESTRA
Se recuperan principalmente en casos de infección de piel y tejidos blandos,
heridas quirúrgicas, neumonía, bacteriemia, infecciones asociadas a catéter
intravascular, endocarditis, e infecciones de articulaciones y huesos. Por lo tanto,
en el laboratorio los aislamientos provienen principalmente de tres tipos de
muestras: esputo, sangre y cultivos de abscesos y heridas quirúrgicas.
Las características de estos procesos se resumen en la Guía Para la Toma
de Muestras de Laboratorio descrita en otro lugar en esta monografía. (1)
MICROBIOLOGÍA
Morfología
Su morfología microscópica muestra cocos Gram positivos agrupados en pares y
en forma de racimos de uvas, lo que ayuda a diferenciarlos de los estreptococos
que forman cadenas de cocos. Son inmóviles y no esporulados.
La morfología macroscópica de S. aureus muestra colonias pigmentadas
(que varían desde color amarillo claro hasta amarillo-naranja oscuro), lo que
las distingue rápidamente de las colonias blancas brillantes formadas por los
estafilococos coagulasa negativos.
Los S. aureus crecen rápidamente bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas
en agar sangre, y muchos otros medios especializados. Las colonias individuales
278
ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
tienden a ser bien definidas y lisas. Aunque su nombre (estafilococo dorado)
refleja su tendencia de adquirir una pigmentación amarilla, tal fenómeno ocurre
solo bajo determinadas condiciones de crecimiento. Por ejemplo, las colonias
pequeñas y las colonias que crecen en ambiente anaeróbico no desarrollan dicha
pigmentación.
Son bastante resistentes a cambios ambientales, a la desecación y a
incrementos de la temperatura de hasta 50ºC, lo que les permite sobrevivir por
largo tiempo en el polvo, suelo, fomites y la ropa. Tales características facilitan
su transmisión intrahospitalaria.
Identificación
En el laboratorio es crítico poder diferenciar entre las tres especies de estafilococos
que causan el mayor número de infecciones humanas: S. aureus, estafilococos
coagulasa negativas, y S. saprophyticus. La prueba más frecuentemente utilizada
para dicho propósito es la prueba de la coagulasa. Las cepas de S. aureus son
coagulasa positivas mientras que las otras especies son coagulasa negativas.
El S. saprophyticus pertenece al grupo de estafilococos coagulasa
negativas. Se diferencia de los otros miembros del grupo por su fermentación del
manitol y su resistencia a la novobiocina.
Resistencia a los antibióticos
En este respecto se destacan dos procesos muy importantes:
1. La evolución de la resistencia a los betalactámicos puesto que dichos
fármacos son los fármacos más eficaces contra los estafilococos. En
situaciones donde la resistencia a la meticilina es elevada se requiere el
uso de los glicopéptidos.
2. El desarrollo de cepas con resistencia intermedia o de alto nivel a la
vancomicina; proceso que igualmente afecta a otros glicopéptidos.
Producción de enzimas
El S. aureus produce muchas enzimas, algunas de las cuales afectan la patogénesis
del proceso de infección. Las enzimas más importantes son las siguientes:
1. Catalasa: Convierte al peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno dentro
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
del S. aureus. Durante el proceso de fagocitosis puede reducir la capacidad
de los leucocitos polimorfonucleares de matar al S. aureus.
2. Coagulasa: Su presencia permite distinguir entre el S. aureus y otros
estafilococos. Juega un menor papel en la patogénesis de infección.
3. Hialuronidasa: Contribuye a la formación de abscesos y a la difusión de
la infección a través de los tejidos.
4. Beta-lactamasa: Inactiva a los antibióticos betalactámicos.
Toxinas
El S. aureus produce varias toxinas. Aquellas de importancia clínica incluyen:
1. Toxina exfoliativa: Grupo constituido por lo menos por dos toxinas (eta
y etb) que separan las células del estrato córneo y la capa granulosa de la
epidermis. Los síntomas incluyen una eritrodermia generalizada y dolorosa
que es acompañada por el desprendimiento de las capas superficiales de la
epidermis. Este lugar de separación permite su distinción de la necrólisis
epidérmica tóxica o síndrome de Lyell, causada por reacción a un fármaco,
donde la separación ocurre en la capa basal.
2. Hemolisinas: La toxina hly (hemolisina) tiene un extenso campo de
actividad lítica celular que incluye los fagocitos del hospedero. Es la
mayor hemolisina del S. aureus. Su ausencia reduce dramáticamente
la virulencia del S. aureus en modelos en animales. También produce
hemolisina ß que contribuyen a su patogenicidad pero que son factores de
virulencia de menor potencia.
3. Toxinas asociadas con el síndrome de choque toxico (SCT): Este
síndrome fue descrito inicialmente en niños pero luego recibió mayor
atención cuando ocurrió un brote epidémico en mujeres jóvenes durante
sus reglas. Posteriormente se determinó la relación del SCT con el uso
de tampones intravaginales hiper absorbentes. Subsiguientemente se ha
observado el mismo síndrome en otros tipos de infecciones causadas por
S. aureus, incluyendo infecciones de heridas quirúrgicas, operaciones
del tabique nasal e inserción de prótesis mamarias. El SCT ocurre en
personas que albergan cepas de S. aureus productoras de toxinas. La
presentación clínica es aguda con fiebre, vómitos, diarrea y progresión al
choque y desarrollo de disfunción de múltiples órganos. Se reconoce la
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ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
presencia de eritrodermia generalizada, hiperemia conjuntival y faringea.
La eritrodermia produce descamación extensa. El tratamiento principal
se dirige al manejo del choque y a la administración de antimicrobianos
contra S. aureus.
4. Enterotoxinas: El S. aureus produce por lo menos once enterotoxinas
serologicamente distintas (Enterotoxinas estafilococcicas A a Q) que son
la segunda causa más común de contaminación alimenticia en los EE.UU,
particularmente de comidas basadas en productos lácteos. La falta de
refrigeración adecuada o la presencia de comida no bien cocida permite
la multiplicación del organismo y la producción de enterotoxinas. Dichas
toxinas carecen de sabor y son relativamente estables frente al calor, lo
que les permite producir enfermedad en comida parcialmente recalentada.
Después de un corto periodo de incubación (1 a 6 horas) se manifiestan los
síntomas de estímulo vagál, vómitos, retorcijones abdominales, cólicos y
diarrea. La deshidratación, si severa, puede complicar la evolución clínica.
No se observa fiebre. Por lo general, los síntomas duran menos de 24
horas. El diagnóstico requiere el aislamiento del S. aureus y/o su toxina
del alimento contaminado. El tratamiento es sintomático, particularmente
con rehidratación.
Moléculas adherentes reconocedoras de componentes de la superficie
Son proteínas en la superficie del organismo que le permiten adherirse a los
tejidos del hospedero, por lo que se las ha denominado receptores. Aquellas
cepas del S. aureus con elevados números de receptores para los huesos o para las
proteínas que se encuentran en válvulas cardiacas dañadas tienen mayor chance
de causar osteomielitis o endocarditis, respectivamente.
Métodos especiales para distinguir cepas diferentes
Durante un brote epidémico o una investigación epidemiológica nosocomial, es a
veces importante poder diferenciar entre cepas de S. aureus. Los procedimientos
de biotipificación y la comparación de los patrones de susceptibilidad
antimicrobiana muchas veces proporcionan pautas o indicios acerca de la
identidad de las cepas. Sin embargo, el S. aureus puede demostrar muy poca
variabilidad en las reacciones bioquímicas de biotipificación o en sus patrones
de susceptibilidad lo que complica los esfuerzos de diferenciación entre cepas.
Por tal razón, se ha desarrollado otros métodos para poder distinguir una cepa de
otra:
281
Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
1. Tipificación del bacteriófago. Es el método tradicional utilizado para
distinguir cepas diferentes del S. aureus durante la investigación de brotes
epidémicos. Sin embargo, su uso es limitado por los siguientes factores:
elevado costo, necesidad de utilizar un laboratorio de referencia, pobre
poder discriminativo, pobre reproducibilidad y elevada complejidad. Por
encima, algunas cepas del S. aureus no son susceptibles a la fagolisis lo
que hace que no se las pueda tipificar por este método (especialmente
cepas SAMR).
2. Técnicas de tipificación epidemiológica por métodos de biología
molecular. Cada grupo de organismos posee un patrón de ADN
plasmídico o genómico que lo caracteriza. Cuando se identifica cepas
con el mismo patrón de ADN en diferentes pacientes eso sugiere que los
patógenos provienen de un mismo clono. El encontrar el mismo clono en
diferentes pacientes que tienen una relación geográfica o de tiempo sugiere
transmisión del patógeno de paciente a paciente a partir de una fuente
común. Los métodos de biología molecular ayudan investigar brotes de
infecciones nosocomiales, sobre todo por SAMR donde se ha acumulado
bastante experiencia con esta técnica.
Se recomienda utilizar el siguiente protocolo para identificar y separar a
los diferentes miembros, clínicamente significativos, del género Staphylococcus
y para establecer el antibiograma.
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ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
Protocolo para Género: Staphylococcus
(*)Depende del medio utilizado para esta prueba de acidificación de
azucares, si se utiliza púrpura de bromocresol la interpretación será:
•
Violeta a Vino: Negativo
•
Amarillo: Positivo
II.Pero si se utilizase el indicador azul de bromotimol la interpretación será
como esta en EL cuadro.
283
284
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
Flujograma de interpretación de pruebas bioquímicas para SCN
ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
ESQUEMA DE TRABAJO
1. Mètodo simlificado de identificación
Tabla 1. Apertura para identificación de especies
Staphylococcus novobiocina S.
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(+) 90 % o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (+) 90 % o más reacción devilmente positiva
(-) 50 % o más de los atendidos reacción negativa,(V) 11-29 % de los atendidos reacción pacífica ND no
determinada: () reacción tardía
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
GRUPO S. epidermis:
S. epidermis, S. lugdunensis
(TABLA 1.1)
GRUPO 1.a:
S. warneri, S. hominis subespecie hominis,
S. lugdunensis, S. simulans (TABLA 1.2)
GRUPO 1.b:
S. capitis subespecie urealyticus,
S. hominis subespecie hominis,
S. simulans (tabla 1.3)
GRUPO 1.c:
S. haemolyticus, S. lugdunensis,
S. auricularis (TABLA 1.4)
GRUPO 1.d:
S. achleiferi subespecie schleiferi,
S. auricularis (TABLA 1.5)
Tabla 1.1. Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO S. epidermis
�����������
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva: (±) 90% o más reacción
dévilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa: (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva:
ND no determinada; () reacción tardía
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ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
Tabla 1.2. Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 1.a
β
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva: (±) 90% o más reacción
dévilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa: (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva:
ND no determinada; () reacción tardía
Tabla 1.3. Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 1.b
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva: (±) 90% o más reacción
dévilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa: (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva:
ND no determinada; () reacción tardía
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
Tabla 1.4.
Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 1.c
-
+
+
+
+
+
-
-
-
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva: (±) 90% o más reacción
dévilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa: (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva:
ND no determinada; () reacción tardía
Tabla 1.5.
Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 1.d
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (±) 90% o más reacción
débilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa; (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva;
ND no determinada; ( ) reacción tardía
288
ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
Tabla 2. Apertura para la identificación de las especies de
Staphylococcus novobiocina resistente
β
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (±) 90% o más reacción
débilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa; (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva;
ND no determinada; ( ) reacción tardía
GRUPO 2.a: S. kloosii, S. equorum, S. xylosus
S. cohnii subespecie urealyticus,
GRUPO 2.b: S. hominis subespecie novobiosepticus,
S. saprophyticus subespecie saprophyticus,
S. kloosii
GRUPO 2.c: S. cohnii subespecie cohnii,
S. kloosii, S. grupo sciuri
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
Tabla 2. 1.
Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 2.a
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (±) 90% o más reacción
débilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa; (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva;
ND no determinada; ( ) reacción tardía
Tabla 2. 2.
Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 2.b
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (±) 90% o más reacción
débilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa; (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva;
ND no determinada; ( ) reacción tardía
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ESTAFILOCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
Tabla 2. 3.
Esquema de diferenciación de las especies del
GRUPO 2.c
β
β
(+) 90% o más de los aislamientos estudiados reacción positiva; (±) 90% o más reacción
débilmente positiva;
(-) 90% o más de los aislamientos reacción negativa; (V) 11-89% de los aislamientos reacción
positiva;
ND no determinada; ( ) reacción tardía
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