ESTUDIO DEL EFECTO DE UN EXTRACTO DE Serenoa repens en

 Biópolis, S.L., C.I.F. B-­‐97332449, inscrita en el Registro Mercantil de Valencia, el 5 d e noviembre de 2003, en el Tomo 7606, Libro 4906, Folio 180, Hoja V-­‐92553, inscripción 1ª. ESTUDIO DEL EFECTO DE UN EXTRACTO DE Serenoa repens en la producción del enzima 5-­‐α reductasa 1) PAPEL DE LA 5-­‐ALFA-­‐REDUCTASA Las 5-­‐α reductasas (5-­‐α-­‐R) son una familia de enzimas implicadas en el metabolismo de esteroides. La inhibición de la síntesis de estos enzimas ha sido utilizada para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata, del cáncer de próstata o de la alopecia andrógina. En esta última aplicación, los fármacos más utilizados son los esteroideos como la Dutasterida y la Finasterida . El extracto de Serenoa repens se ha descrito en numerosas publicaciones como un inhibidor de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R que impide la conversión de testosterona en dihidrotestosterona, si bien hasta ahora no había podido demostrarse in vivo esta inhibición. Este extracto es la base del producto VR6 DEFINITIVE HAIR. 2) ESTUDIO SOBRE EL EXTRACTO DE Serenoa repens presente en el producto VR6 DEFINITIVE HAIR CNCE INNOVACIÓN y BIOPOLIS han llevado a cabo un proyecto conjunto para analizar el efecto inhibitorio de la síntesis del enzima 5-­‐α-­‐R de Caenorhabditis elegans del extracto de Serenoa repens utilizado en el producto VR6 DEFINITIVE HAIR. Este trabajo se ha dividido en tres hitos: i) diseñar un sistema de detección in vivo en C. elegans de la enzima 5-­‐α-­‐R; ii) llevar a cabo una prueba de concepto del efecto inhibidor in vivo de la síntesis de dicha enzima usando el fármaco habitual Dudasterida, y iii) estudiar el efecto inhibidor del extracto de Serenoa repens incluida en VR6 DEFINITIVE HAIR en dicho sistema de evaluación. Los resultados se comentan a continuación. 2.1. Desarrollo de un protocolo para la detección y cuantificación de la inhibición de la síntesis del enzima 5-­‐α-­‐R en C. elegans El primer objetivo de este hito fue desarrollar una metodología que permitiera detectar la presencia en C. elegans de la enzima objeto de estudio. Para ello, en un primer paso se realizó una búsqueda en las bases de datos y se determinó que C. elegans posee al menos tres posibles genes candidatos a codificar 5-­‐α-­‐R (F19H6.4, CELE-­‐ZK1251.3 y CELEF42F12.3). Se realizaron alineamientos de la secuencia de cada una de las proteínas con la proteína humana SRD5A2 que codifica la enzima 5-­‐α-­‐R, determinándose una homología de secuencia BIOPOLIS, S.L. Parc Científic de la Universitat de València, Edificio 2 , C/ Catedrático Agustín Escardino Benlloch, 9, 46980, Paterna, Valencia, España Tel. +34963160299, Fax +34963160367 – biopolis@biopolis.es www.biopolis.es Pág. 1 Biópolis, S.L., C.I.F. B-­‐97332449, inscrita en el Registro Mercantil de Valencia, el 5 d e noviembre de 2003, en el Tomo 7606, Libro 4906, Folio 180, Hoja V-­‐92553, inscripción 1ª. aproximada del 41% que debería permitir detectar la presencia de la enzima propia de C. elegans usando el anticuerpo frente a la enzima humana. Siguiendo este razonamiento, en un siguiente paso, se procedió a determinar por western blot la presencia de la proteína equivalente a SRD5A2 humana en cultivos de C. elegans crecidos en condiciones estándar (medio NG). Para ello, se seleccionaron gusanos en diferentes estadios de desarrollo: i) gusanos adultos jóvenes (adultos de 1 día), ii) adultos de 2 días y iii) adultos de 4 días. Como muestra la Figura 1, fue posible detectar la proteína en todos los estadios de desarrollo analizados. La proteína presentó un tamaño molecular próximo a los 75KDa. El mayor tamaño de banda observado correspondió con un mayor volumen de carga en el gel. Figura 1. Detección de la proteína 5-­‐α-­‐R de C. elegans en distintos estadios de desarrollo. En resumen, el desarrollo de este hito permitió disponer de una metodología válida para la detección y cuantificación de la enzima 5-­‐α-­‐R propia de C. elegans. 2.2. Evaluación del efecto inhibidor de 5-­‐α-­‐R del fármaco Dutasterida en C. elegans En este paso se determinó si el fármaco Duatasterida, utilizado para el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata y alopecia, produce una inhibición de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans evaluando dosis de 1, 10, 50 y 100 μg/mL en gusanos C. elegans adultos de 2 y 4 días. Como se puede observar en la Figura 2, la Dutasterida da lugar a una inhibición parcial de la síntesis de la 5-­‐α-­‐R de C. elegans a todas las dosis ensayadas en gusanos de 2 días. Pág. 2 Biópolis, S.L., C.I.F. B-­‐97332449, inscrita en el Registro Mercantil de Valencia, el 5 d e noviembre de 2003, en el Tomo 7606, Libro 4906, Folio 180, Hoja V-­‐92553, inscripción 1ª. Figura 2. Efecto inhibidor de la Dutasterida sobre la síntesis de 5-­‐α-­‐R de C. elegans en estadio de adulto de 2 días. El porcentaje de inhibición, calculado en base a la intensidad neta de la banda electroforética, fue de un 42,3% para dosis de Dutasterida de 1 y 10 μg/mL, y un 65,2% para dosis de 50 y 100 μg/mL (Figura 3) Esto indica un efecto inhibitorio dosis-­‐respuesta del fármaco. No se determinó efecto inhibitorio sobre adultos de 4 días. Figura 3. Cuantificación relativa de la intensidad de luminiscencia a partir de 10 μL de preparaciones de proteína de C. elegans (adultos de 2 días) tratados con Dutasterida. En resumen, para poder determinar el efecto inhibidor de un tratamiento, es necesario realizar el análisis en un estadio concreto de desarrollo del nematodo, el de adulto de 2 días. Además, el fármaco Dutasterida (dosis 1-­‐100 μg/mL) es válido como control positivo de ensayo. Pág. 3 Biópolis, S.L., C.I.F. B-­‐97332449, inscrita en el Registro Mercantil de Valencia, el 5 d e noviembre de 2003, en el Tomo 7606, Libro 4906, Folio 180, Hoja V-­‐92553, inscripción 1ª. 2.3. Evaluación del efecto inhibidor del extracto de Serenoa repens usada en VR6 DEFINITIVE HAIR sobre la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans. Existen diversas evidencias en la literatura que muestran el efecto inhibidor de este extracto sobre la síntesis de 5-­‐α-­‐R en líneas celulares prostáticas de humanos, así como su eficacia en la mejora de la alopecia. Los ensayos se llevaron a cabo en distintas condiciones experimentales. Se realizó el análisis en nematodos de 2 y 4 días, aplicando dosis de 5 y 10 mg/mL. Los resultados (Figura 4) indicaron un claro efecto inhibidor de la expresión de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R en nematodos adultos de 2 días alimentados con el extracto de Serenoa repens, no observándose dicho efecto en nematodos de 4 días. Figura 4. Efecto inhibidor del extracto de Serenoa repens sobre la síntesis del enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans en estadio de adulto de 2 días. El porcentaje de inhibición estimado fue de un 73,2% con la dosis de 5 mg/mL y un 86,5% con la dosis de 10 mg/mL (Figura5), mostrando así un efecto dosis-­‐dependiente. Pág. 4 Biópolis, S.L., C.I.F. B-­‐97332449, inscrita en el Registro Mercantil de Valencia, el 5 d e noviembre de 2003, en el Tomo 7606, Libro 4906, Folio 180, Hoja V-­‐92553, inscripción 1ª. Figura 5. Panel izquierdo. Cuantificación relativa de la intensidad de luminiscencia a partir de 10 μL de preparaciones de proteína de C. elegans (adultos de 2 días) tratados con extracto de Serenoa repens. Panel derecho. Confirmación del control de carga mediante detección del proteína de expresión constitutiva tubulina. En resumen, en el presente hito se ha determinado que el extracto de Serenoa repens presente en el producto VR6 DEFINITIVE HAIR tiene un efecto inhibitorio de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans a las dosis de 5 y 10 mg/mL. Dicho efecto se detecta concretamente en adultos de 2 días, al igual que ocurre con el fármaco Dutasterida. 3) CONCLUSIONES •
Se ha desarrollado un protocolo que permite detectar y cuantificar la expresión de la proteína 5-­‐α-­‐R de C. elegans en adultos de 2 días. El sistema resulta válido para el escrutinio de compuestos o extractos con posible efecto inhibidor de la síntesis de dicha proteína. •
Se ha determinado que el fármaco Dutasterida reduce la expresión de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans a las dosis de 1, 10, 50 y 100 μg/mL. Los porcentajes de inhibición varían entre un 42 y un 65%. •
El extracto de Serenoa repens reduce la expresión de la síntesis de la enzima 5-­‐α-­‐R de C. elegans a las dosis de 5 y 10 mg/mL en un 73 y 86%, respectivamente. •
Dada la presencia de este extracto en el producto comercial VR6 DEFINITIVE HAIR, es muy probable que la acción del mismo sobre la reducción de la producción de 5-­‐α-­‐R sea la causante del efecto positivo de dicho producto sobre la alopecia. Ver resumen del
estudio de Biopolis
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