Bacillus sporothermodurans anaeróbicos

Recibido 28/06/2012, Aceptado 17/07/2012, Disponible online 07/12/2012
Bacillus sporothermodurans anaeróbicos facultativos aislados de
leches UHT elaboradas en Colombia
1,2,3
Ivonne Bernier P 1, Eliana Cárdena F2, Oscar A Piñeros3
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTD, Calle 49 No. 70C - 31,
Bogotá – Colombia. (571) 416 63 01
direcciontecnica@iblaboratorio.com
Resumen
En diferentes estudios realizados, Bacillus sporothermodurans ha sido caracterizado
fenotípicamente como un microorganismo aerobio estricto. Sin embargo, IBLAB, al
realizar la prueba de esterilidad comercial de leches UHT producidas en Colombia,
siguiendo la Norma NTC 4433, en la que se inoculan medios de cultivo en condiciones de
aerobiosis y anaerobiosis a diferentes temperaturas (35±2°C y 55±2°C), ha obtenido
crecimientos atípicos de este microorganismo en ausencia de oxígeno, evidenciando que
este bacilo no sólo puede crecer como aerobio estricto sino también como anaerobio
facultativo. Para confirmar el crecimiento anaerobio, se realizaron siembras en agar
infusión cerebro corazón (BHI) suplementado de vitamina B12, las cuales fueron
incubados en las mismas condiciones iniciales (anaeróbicas). Se observaron las
características microscópicas de las cepas aisladas en la muestra 87020 y confirmadas
por tinción de Gram y pruebas bioquímicas. Para la confirmación del microorganismo se
utilizó la técnica de PCR tradicional con base a la identificación del gen 16S ribosomal y
posterior secuenciación. El análisis filogenético demostró un 99% de identidad con otras
cepas de B.sporothermodurans. Estos análisis confirmaron la presencia de Bacillus
sporothermodurans anaeróbicos facultativos en las muestras de leche UHT analizadas.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 126
ABSTRACT
In different studies, Bacillus sporothermodurans
has been characterized
phenotypically as a strict aerobic organism. However, IBLAB, while doing test of
commercial sterility of UHT milk produced in Colombia, following the Standard NTC 4433,
in which culture media inoculated in aerobic and anaerobic conditions at different
temperatures (35 ± 2 ° C and 55 ± 2 ° C) obtained atypical growth of this organism in the
absence of oxygen, showing that this bacillus can grow as not only an aerobic strictly but
also anaerobic optional. To confirm the anaerobic growth, were plated on brain heart
infusion agar (BHI) supplemented vitamin B12, which were incubated in the same initial
conditions (anaerobic). There were microscopic features of the strains in the sample
87020 and confirmed by Gram staining and biochemical tests. For confirmation of the
organism was used traditional PCR-based identification of 16S ribosomal gene and
subsequent sequencing. Phylogenetic analysis showed a 99% identity with other strains
of B.sporothermodurans. These analyzes confirmed the presence of facultative anaerobic
Bacillus sporothermodurans in UHT milk samples analyzed.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 127
I-
Introducción
En Colombia la actividad ganadera
ha sido estimada en 25 millones de
cabezas en 2010 con una producción
anual de 6.600 millones de litros de
leche y aproximadamente 3 millones de
litros de leche corresponden a leche
pasteurizada y leches UHT, equivalente
al 46% de la producción total según
FEDEGAN1.
Ocasionalmente
se
presenta
deterioro por microrganismos resistentes
a las altas temperaturas, como resultado
de contaminación durante operaciones
de llenado. Algunos géneros presentes
corresponden a Bacillus badius, Bacillus
cereus, Bacillus licheniformes, Bacillus
polymixa, Bacillus subtilis y Bacillus
stearothermophilus, identificados como
causantes de este deterioro (Petterson et
al., 1996). Bacillus sporothermodurans
(BS) es una bacteria Gram positiva,
descrita inicialmente por Petterson et al.,
(1996) produce esporas altamente
resistentes al calor que pueden
sobrevivir en las leches UHT a
temperaturas entre 135 a 142 °C por
unos pocos segundos. Varios autores
como (Foschino et al., 1990, Hammer et
al., 1995a, 1995b, Klijn et al., 1997) han
descrito a este microrganismos como
una bacteria aerobia mesófila. Esta
bacteria es considerada no patógena
(Hammer et al., 1996) y es mejor
caracterizada de forma fenotípica
mediante secuenciación del gen 16S
rRNA y técnicas moleculares (Pettersen
et al., 1996) quien demostró la
ocurrencia de 2 tipos diferentes de B
sporothermodurans. Aun cuando estos
dos tipos difieren fenotípicamente y
genotípicamente de acuerdo con las
descripciones de Klijn el al 1997.
Estudios de laboratorio han demostrado
que la ingestión de BS (+) en leches, en
animales o incluso en seres humanos no
se ha observado efectos patógenos; es
posible que los BS puedan llegar a
enmascarar a otros bacilos que pueden
ser potencialmente patógenos. Todos los
métodos de caracterización fenotípica y
genotípica son aplicados sobre cultivos
puros y la amplificación por técnicas de
PCR (Reacción de la Cadena de
Polimerasa), ofrece la oportunidad de
realizar la identificación específica del
microrganismo (Scheldeman et al.,
2012).
Entre los años 2010 y 2011 se ha
incrementado la incidencia de leches
UHT con prueba de
esterilidad
comercial
con
resultados
no
satisfactorios, razón por la cual se
realizó la siguiente
investigación
identificando
los
grupos
de
microorganismos presentes en las
muestras rechazadas encontrándose
diferentes especies de cocos y bacilos
Gram positivos como flora contaminante
aerobia y anaerobia, mesófilas y
termófilas. La presencia de estos bacilos
en condiciones de aerobiosis y
anaerobiosis facultativa, procedentes de
leches UHT incubadas durante 10 días a
diferentes temperaturas (NTC 4433
Método para evaluar la esterilidad
comercial en alimentos); indica que el
producto no cumple con la prueba de
esterilidad comercial “Satisfactoria” para
ser comercializada como apta para
consumo humano de acuerdo con la
especificación del Decreto 616 de 2006
(en estudio), situación crítica ya que las
leches
no
Satisfactorias
son
decomisadas y descartadas.
1
http://portal.fedegan.org.co/pls/portal/docs/PA
GE/FNG_PORTAL/PG_SERVICIOS/COYUNTURA_L
ECHERA1/LO_QUE_USTED_NECESITA_SABER_CA
RTILLA.PDF
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 128
II- MATERIALES Y METODOS
las condiciones de
anerobiosos iniciales.
Muestras de leche UHT: Se
analizaron 510 muestras de leche UHT
de 5 marcas comerciales de venta a
nivel nacional, para análisis inicial de
esterilidad comercial de acuerdo con la
Norma NTC 4433.
Prueba de esterilidad comercial NTC 4433. Para la prueba de esterilidad
de las leches UHT se tomaron al azar 2
unidades del mismo lote de leche UHT.
Uno de los envases se incubó a
35°C±2°C y el otro a 55°C±2°C durante
10
días.
Luego
se
inocularon
asépticamente 2 mL de leche UHT en
cada uno de los 12 tubos conteniendo
caldo BHI al 0,1% de almidón. Seis (6)
tubos se incubaron a 35°C±2°C, de los
cuales tres (3) tubos se mantuvieron en
condición aeróbica y los otros tres (3) en
condición
anaeróbica
(jarra
de
anaerobiosis). Los seis (6) tubos
restantes se incubaron a 55°C±2°C, tres
(3) tubos en condición aeróbica y los
otros tres (3) en condición anaeróbica
(jarra de anaerobiosis).
Todos los tubos se incubaron por
72 horas y después se realizó un frotis
de cada tubo. Se observó la microscopía
y se determinó la ausencia o presencia
de microorganismos en cada tubo.
Ninguno de los tubos incubados en
condiciones de aerobiosis o anaerobiosis
puede dar turbidez (crecimiento) para
que la prueba sea conceptuada como
Satisfactoria.
Para la presente investigación a las
leches UHT que presentaron crecimiento
en cualquiera de los tubos aerobios o
anaerobios se les realizó aislamiento en
agar
plate
count
y
agar
BHI
suplementado. Este agar se preparó a
partir de caldo BHI (Oxoid) adicionado de
agar al 15% y suplementado de vitamina
B12 (1mg/L) con posterior incubación en
aerobiosis
o
Pruebas bioquímicas.
La
identificación
de
los
microorganismos crecidos en agar plate
count se realizó mediante pruebas
bioquímicas comerciales (BBL Crystal) y
la identificación de los microorganismos
crecidos en agar BHI suplementado se
realizó
con
pruebas
bioquímicas
convencionales sugeridas por Montanari
et al., 2004.
Cepas bacterianas y condiciones
de crecimiento. Para la comparación de
las
características
fenotípicas
se
utilizaron
cepas
de
Bacillus
sporothermodurans
DSMZ 10599
versus las cepas aisladas de las leches
UHT en agar BHI. Para los cultivos en
anaerobiosis se utilizó la jarra de
anaerobiosis, anaerogen e indicador de
anaerobiosis (Oxoid). Las cajas de petri
se incubaron a 35°C±2 y a 55°C°±2°C
por 48 horas.
Medios de cultivo: Todos los medios
de cultivo utilizados se sometieron a
pruebas ecométricas de acuerdo con la
ISO 11133-2 de 2006, obteniéndose
como
resultados
un
índice
de
crecimiento (IG) de 16 para medios
sólidos, incluido el agar BHI preparado y
una turbidez alta (nivel de 2) para
medios líquidos, lo que indicó que todos
los medios de cultivo preparados y
evaluados cumplen con los requisitos de
productividad y selectividad deseados.
Los medios de cultivo utilizados
corresponden a la casa comercial Oxoid.
Extracción de ADN: se realizaron
extracciones de DNA a partir de a)
cultivos puros de presuntas colonias
aisladas en agar BHI provenientes de la
prueba de esterilidad no satisfactoria b) a
partir de las leches incubadas por 20
horas y subcultivadas en caldo BHI y c) a
partir de agar BHI de cultivos puros
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 129
obtenidos por esporulación a 80 °C por
10 minutos. Las colonias provenientes
de cultivos puros se inocularon en 200
µL de buffer de lisis, seguida de
agitación por vórtex y posterior
calentamiento a 92°C por 20 minutos y
centrifugación por 5 minutos a 10000
rpm. Para las muestras subcultivadas en
caldo BHI se tomó 1 mL de la muestra y
se procedió de igual forma.
Primeros y condiciones PCR: los
siguientes primeros fueron utilizados
BSPO-F2 (5′ ACGGCTCAACCGTGGAG
3′), localizado en la posición 589–605 y
BSPO-R2 (5′ GTAACCTCGCGGTCTA
3′), localizado en la posición 1252–1237,
amplifican el gen 16S rRNA específico
de B.sporothermodurans, con un tamaño
de 648 pares de bases (pb)
(Scheldeman et al., 2002), 2 µL del ADN
extraído de B.sporothermodurans se le
añadió a 23 µL de una mezcla de 20
mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM KCl, 3mM
MgCl2, 0.2 mM de cada deoxynucleotide
trifosfato, 1-2 U Taq DNA polymerasa y
20 pmoles de cada primer. Las
condiciones del ciclo fueron descritas por
Scheldeman et al 2002. Para la
amplificación del gen 16S rRNA fue
utilizado 27F AGAGTTTGATCMTGGCT
CAG, 1492R TACGGYTACCTTGTTACG
ACTT,518 FCAGCAGCCGCGGTAATAC
G and 800R TACCAGGGTATCTAATCC,
que amplifica el fragmento de 1465 bp
(descrito por Macrogen, Korea). Cuatro
(4) μL del producto de la PCR fue
analizado en 1,5% gel de agarosa
(Bioline USA) y teñido con bromuro de
etidio. Las muestras fueron corridas a
100 volts por 35 minutos y visualizadas
en un transiluminador UVP (Upland, CA
USA).
Secuenciación: los productos de
PCR se purificaron y se secuenciaron
utilizando un secuenciador de DNA
3730XL (Applied Biosystems, California,
USA). Dos (2) cepas recuperadas en
este estudio y referenciadas como 87017
y 87020 (aeróbica y anaeróbica
facultativa respectivamente), les fue
secuenciado el gen completo 16S rRNA.
Las secuencias se compararon con la
base de datos del BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) y la base de
datos del proyecto ribosomal (RDP).
Secuencia
de nucleótidos y
análisis
filogenético:
múltiples
secuencias de alineaciones y las
matrices de análisis se calcularon
utilizando el software DNAMAN. Los
árboles filigenéticos fueron diseñados
utilizando la versión 4.1 del software
MEGA. Las distancias genéticas se
calcularon utilizando el modelo de
sustitución de nucleótidos de TamuraNei y los árboles se construyeron por el
método de neighbor-joining con 10 000
repeticiones de bootstrap.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 130
II- RESULTADOS
Microorganismos aislados de las
pruebas
de
esterilidad
no
satisfactorias
De las 510 muestras de leche
analizadas para la prueba de esterilidad
comercial, 144 muestras de leche UHT
de diferentes presentaciones y marcas
comerciales dieron resultados de prueba
de
esterilidad
No
satisfactoria,
presentando crecimiento de diferentes
grupos de bacterias termorresistentes.
Tabla No. 1
Tabla No 1. Presencia en (%) de especies de bacterias termoresistentes en
leches UHT
Presencia
Microorganismos (%)
Lactococcus lactis
43,75
Gemella morbillorum
6,25
Staphylococcus
simulans
6,25
Bacillus subtilis
12,5
Bacillus brevis
12,5
Bacillus spp
18,75
Setenta y cinco (75) muestras de
leche UHT, es decir el 52 % de las
muestras
analizadas
presentaron
crecimiento positivo en agar BHI y se
confirmó
la
presencia
de
B
sporothemodurans tanto por pruebas
bioquímicas como por PCR
De las 75 muestras, treinta y tres (33)
muestras
desarrollaron
el
microorganismo
en
condiciones
anaerobias facultativas (44%) y sólo en 9
muestras el crecimiento se presentó en
condiciones aerobias estrictas (12%)
Tabla No. 2.
Tabla No. 2 Tipos de crecimiento observados en aerobiosis y anaerobiosis
Núme
ro
muestras
Crecimiento en tubos de
esterilidad Comercial
Tubos aerobios a 35°C
Tubos aerobios y anaerobios a 35°C
Tubos aerobios a 35°C y tubos
aerobios a 55°C
Morfología microscópica
Sobre los aislamientos en agar BHI
bajo condiciones de aerobiosis y
anerobiosis se observó que había 2 tipos
de morfología de crecimiento diferentes:
(1) de tipo aerobio, que corresponde a
colonias mayores a 2 mm de diámetro,
Bacilos Gram
Positivos en
filamentos
Bacilos Gram
Positivos
individuales
9
9
30
30
30
3
3
3
de superficie brillante de color beige y
rugosa con bordes difusos reducidos; y
(2) el tipo anaeróbico correspondiente a
colonias mayores a 3 mm de diámetro,
de bordes liso de color beige, suaves,
opaca. En la tinción de Gram las
colonias aerobias se presentan como
bacilos Gram positivos en cadenas
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 131
largas o como filamentos largos (figura
1A), morfología similar a la del B.
sporothermodurans DSMZ 10599 (figura
1B).
En
contraste
las
colonias
anaerobias se presentan como bacilos
Gram positivos en cadenas más cortas o
en células individuales (figura 1 C y D)
FIGURA 1
Fig 1. Bacillus sporothemodurans traits from aerobic and anaerobic culture, A) in UHT
milk (aerobic), B) pure culture from supplemented BHI agar (aerobic), C) UHT
milk (anaerobic), D) pure culture from supplemented BHI agar (anaerobic).
Caracterización fisiológica
Fisiológicamente las cepas aisladas
que crecieron en condición de aerobiosis
fueron similares a la respuesta
bioquímica de B sporothermodurans
DSMZ 10599. Las características
bioquímicas de las cepas aisladas bajo
condiciones de anaerobiosis mostraron
un crecimiento en 2 diferentes rangos
de temperatura 35°±2°C y a 55°C°±2°C.
Además ambas cepas aerobias y
anaerobias
mostraron
el
mismo
comportamiento frente a la fermentación
de los azúcares (producción de ácido) y
a no hidrolizar la úrea, la gelatina o
almidón; todas las cepas analizadas
fueron catalasa y oxidasa positiva. Sin
embargo, las diferencias estaban
presentes en el crecimiento a 55 °C y
concentración de NaCl (7%), con cepas
anaeróbicas
que
muestran
un
crecimiento variable a 53 °C y
crecimiento variable a una concentración
de
cloruro
de
sodio
al
(7%)
respectivamente. Tabla No. 3
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 132
Tabla N°3. Características de B. sporothermodurans aislados en aerobiosis y anaerobiosis
Results
Phenotypic profile
Cytology
Formation of filaments
Individual bacilli
Acid of
Cellobiose
Fructose
Galactose
Glucose
Mannitol
Mannose
Hydrolysis of:
Urea
Gelatin
Starch
Growing conditions:
Strict aerobic
Facultative anaerobic
Growth at 53 ± 2 ° C
Growth at 35 ± 2 ° C
Growth at pH 5.8
Growth at pH 6.8
Others
Catalase
Oxidase
Citrate
Growth in NaCl
0%
2%
5%
7%
Growth at
15°C
20°C
45°C
53°C
B. sporothermodurans
DSMZ 10599
Aerobic wild strains
Anaerobic wild
strains
V
V
V
V
V
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
-
-
V
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
V
V= variability
Análisis molecular
Los
métodos
moleculares
permitieron
la
confirmación
de
B.sporothermodurans en leches UHT.
Los resultados de la PCR tradicional para
el B sporothemodurans DSMZ 10599
cepa utilizada como control mostraron
que las cepas aerobias y anaerobias
aisladas en el laboratorio presentan gran
similitud con el gen 16S rRNA BSPO-F2
y
BSPO-R2
primeros
BSPO
seleccionados para el estudio de genes
específicos amplificados 16S rRNA para
BS, la generación de una banda de 648
pares de bases (pb), que está al mismo
nivel (tamaño) de la cepa referencia
DSMZ 10599 utilizada en este estudio,
confirmando así que las cepas aerobias y
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 133
anaerobias facultativas corresponden a
BS como inicialmente se identificaron por
el método tradicional
El análisis comparativo de las
secuencias de nucleótidos del gen 16S
rRNA de 87017 y 87020 y las cepas
diferentes de BS revelaron algunas
diferencias en el gen VR principalmente
en la regiones hipervariables VR1 y VR2.
La cepa 87017 mostró una sustitución en
el VR1, en la posición 84 (C→T). Tres
sustituciones fueron detectadas en
ambas cepas en la región VR2 en las
posiciones 448 (G → A), 471 (C → G),
que han sido reconocidos como la región
hipervariable entre los rRNAs de las
diferentes cepas bacterianas (Fig. 2). En
VR6 hubo una sustitución en la posición
1001 (A→C) en ambas cepas, y ninguna
sustitución se observó en la región VR8
de ambas cepas estudiadas. Otras
sustituciones se observaron en las cepas
87017 y 87020 en diferentes posiciones
del gen (Fig. 2).
Análisis filogenético
El análisis filogenético de la secuencia
del
gen
16S
rRNA
de
B.sporothermodurans (1465pb) a partir
de 87017 y 87020 (cepas aerobias y
anaerobia respectivamente) aisladas a
partir de la prueba de esterilidad
comercial, permitió agrupar a la cepa
anaerobia
con
la
cepa
No.19,
encontrándose una similitud del 99% a
nivel nucleotídico (Fig 3). Las cepas de
BS
(aerobia y anaerobia) fue más
similar a la cepa SC-H.
Las cepas estudiadas de Bacillus
sporothermodurans y de otras cepas
cercanas genéticamente se agruparon
en el mismo clado, y mostraron una
similitud mayor al 94% en su gen 16S
rRNA. El grado más alto de disimilitud
que existe entre especies del género
Bacillus es del 7% (Fig.3).
Fig. 2 Alineamiento de las regions variables (VR) of B. sporothermodurans strains
of 16S rRNA gene.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 134
Fig.3
B.sporothermodurans
árbol filogenético
utilizando
el método
Neighborjoining y el modelo de sustitución Tamura-Nei. Las cepas analizadas en el estudio
corresponden a la 87017 y 87020.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 135
DISCUSIÓN
El sector lácteo se enfrenta aun
grave problema debido a la presencia de
B sporothermodurans en la leche UHT,
ya que su presencia cataloga al producto
como NO SATISFACTORIO (Norma
NTC 4433) y conduce a su decomiso.
Esto se traduce en pérdidas económicas
para los productores de leche que son
los más afectados. Las pérdidas en el
sector lácteo por el decomiso y descarte
de las leches consideradas No
Satisfactorias tienen un impacto
económico en los productores de leche,
que son conscientes que la presencia de
este bacilo puede reducir la vida útil del
producto, aunque el microrganismo es
considerado como no patógeno para los
seres humanos, puede reducir la calidad
de la leche debido a la supervivencia de
las esporas al proceso de esterilización
comercial
(Scheldeman et al., 2005,
Pettersson et al. 1996; Herman et al.
1998, Vaerewijck et al., 2001). La
presencia de diferentes grupos de
bacterias termorresistentes en la leche
UHT, indica que existe más de una
fuente de contaminación que debe
estudiarse, con el fin de determinar dosis
apropiadas de choque de desinfectantes
para eliminar este microorganismo
(Scheldeman et al., 2005).
La prueba de esterilidad comercial
realizada con la NTC 4433 que aunque
no es específica para realizar la prueba
de esterilidad comercial en leche UHT,
permite claramente identificar si los
bacilos presentes crecen de forma
aerobia o de forma anaerobia, la
desventaja de esta técnica es que dura
10 días la incubación, 3 días la siembra
en caldo BHI, 48 horas la siembra en
agar BHI y 72
horas a 7 días las
pruebas
bioquímicas
para
su
identificación, para un total de 18 a 23
días.
Por
otro
lado
los
métodos
moleculares utilizando el gen 16S ARNr,
reducen el tiempo de respuesta de 23
días a 48 horas. Gray y col. 1984
destacó que la región variable VR2
donde se concentra el mayor número de
diferencias de nucleótidos entre 440-496
pb y forma una estructura de lazo y
horquilla, y con VR1 del gen 16S que
concentra un mayor número de
nucleótidos.
En las cepas 87017 y 87020 se
encontraron ciertas sustituciones en
dichas regiones (VR1, VR2 y VR6) y en
otras partes del gen se encontraron que
pueden ser los responsables del control
del fenotipo del microrganismo.
Para concluir, la detección temprana
de BS, mediante la incubación de la
leche durante 40 horas es una
alternativa viable de la detección, pero
para que sea concluyente falta realizar
más ensayos de laboratorio para que la
prueba sea aprobada como oficial para
la detección de este microorganismo;
igualmente se deben realizar estudios de
la presencia de este microorganismo en
las leches crudas en las diferentes
regiones del país. Igualmente se hace
necesario estudios que identifiquen el
gen que confiere la resistencia al calor.
I.
REFERENCIAS
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Los autores agradecen a la junta
directiva y al equipo de microbiología de
IBLAB, por el patrocinio y colaboración
en la realización del presente estudio.
AGRADECIMIENTOS
Igualmente a Corpogen, y en especial
al Dr, Walter Ocampo por los aportes en
la revisión del documento
Von Hammer, P., Walte H. G., (1996).
Zur
Pathogenita¨t
hitzeresistenter
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 138