Tema 6
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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Mecanismo de la actividad enzimática Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Clasificación de las enzimas 1. Oxidoreductasas: Oxidación – Reducción 2. Transferasas: Transferencia de grupos C, N, o P 3. Hidrolasas: Desdoblamiento de enlaces por agua 4. Liasas: Separación de enlaces C-C, C-S, y ciertos enlaces C-N 5. Isomerasas: Racemización de isómeros geométricos (re-arreglos intra-moleculares) 6. Ligasas: Formación de enlaces entre carbono y O, S, N acoplados a la hidrólisis de enlaces fosfato de alta energía Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 1. Óxido - reductasas (deshidrogenasas) Catalizan la oxidación o reducción de sustratos Glucosa oxidasa Peroxidasas Lactato deshidrogenasa Ciclohexanona monooxigenasa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología El mayor número de oxidorreductasas llevan a cabo la reacción: AH2 + B ↔ A + BH2 Donde: B es el aceptor de elctrones: NAD+, NADP+, ferricitocromo, etc. Nota: Esta reacción ocurre bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas Lactato deshidrogenasa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Lactato deshidrogenasa [(S)-L-Lactato:NAD+ oxidoreductasa, EC 1.1.1.27] Contiene cuatro sitios activos por molécula; esto es, cada subunidad polipeptídica contiene el equivalente a un sitio activo. No hay efecto cooperativo entre los 4 sitios activos. Mecanismo: Bi Bi secuencial ordenado NAD+ Piruvato Lactato NADH E-NAD+•L E E-NAD+ E-NADH••P E-NADH E Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 2. Transferasas Catalizan la transferencia de un grupo de un compuesto a otro, los grupos que son transferidos son C, residuos aldehídicos y cetónicos, acil, glicosil, alkil, nitrogenados, fósforo y grupos que contienen azufre. Most transaminases share a common substrate and product (glutamate and oxoglutarate) with glutamate dehydrogenase, and this permits a combined nitrogen excretion pathway for individual amino acids that is commonly described as "trans-deamination". Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Mecanismo: Bi Bi Ping-Pong Alanine transaminase (EC 2.6.1.2) A E B P EA-FP F Q FB-EQ E Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 3. Hidrolasas Catalizan las reacciones de hidrólisis donde el agua es el aceptor del grupo transferido Ejemplos: Amilasas, celulasas, β-galactosidasas, lipasas, Proteasas Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Mediante gráficas de Lineweaver-Burk Enzima libre: Vmax = 26.2 mol mg-1 min-1 kcat = 29 s-1 KM = 1.35 mol dm-3 Enzima inmovilizada: Vmax = 5.2 mol mg-1 min-1 kcat = 5.7 s-1 KM = 0.2 mol dm-3 Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai . 2004. Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology, 35 : 488–493 Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 4. Liasas Catalizan la lisis de un substrato, generando un doble enlace en una eliminación no-hidrolítica, no-oxidativa (Sintetasas catalizan la adición a un doble enlace, la reacción inversa de una liasa) Pyruvate decarboxylase (EC 4.1.1.1) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Active site of pyruvate decarboxylase with selected amino acids: Glu-51, Glu-477, Asp-444, and Asp-28. Also displayed are cofactors TPP and Mg2+. Susane Lowe and J. Gregorzye Ikus. 1992. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi. Journal of General Microbiology , 138: 803-807 Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 5. Isomerasas Catalizan las reacciones de isomerización Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología 6. Ligasas (sintetasas) Catalizan la formación de enlaces entre dos compuestos usando la energía derivada del desdoblamiento de un enlace pirofosfato tal como se encuentra en el ATP Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Características de las Enzimas • • • • Tasas catalíticas extremadamente altas Condiciones de reacción suaves Especificidad de reacción Regulación Las enzimas (catalizadores biológicos) son efectivas en pequeñas cantidades Permanecen sin cambios después de la reacción No afectan el equilibrio de una reacción reversible, simplemente incrementan la velocidad a la cual el equilibrio se alcanza Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Especificidad de las enzimas Especificidad de substrato El resultado del reconocimiento molecular • El substrato (pequeño) se enlaza a la enzima (grande) vía fuerzas débiles: Enlaces-H, van der Waals, iónicas (algunas veces interacciones hidrofóbicas) • El sitio de enlace de un sustrato es generalmente una hendidura sobre la superficie de la enzima que es complementaria para el substrato - en forma (geométricamente complementarios) - en características químicas (complementariedad electrónica) al substrato Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Especificidad de las enzimas • Especificidad absoluta: • Especificidad relativa: Quimoselectividad Regioselectividad •Estereoespecificidad: •Inespecificidad Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Especificidad absoluta Cataliza la reacción de un substrato único a un producto particular Existen enzimas que sólo aceptan una molécula como sustrato, ejemplos: a) b) c) d) e) f) g) Uricasa, la cual actúa solamente sobre ácido úrico Arginasa, la cual actúa solamente sobre arginina Carbonic anhidrasa, la cual actúa solamente sobre ácido carbónico Lactasa, la cual actúa solamente sobre lactosa Sucrasa, la cual actúa solamente sobre sucrosa Maltasa, la cual actúa sobre maltosa acetilcolinesterasa que actúa solamente sobre los ésteres de colina Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Especificidad relativa Ciertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actúan sobre muchos compuestos que poseen un rasgo estructural común. Por ejemplo, la fosfatasa del riñón cataliza la hidrólisis de ésteres fosfato del ácido fosfórico a diferentes velocidades, la amilasa hidroliza el almidón independiente de su origen. Las proteasas y lipasas hidrolizan proteinas y lípidos. Es decir, catalizan el mismo tipo de reacción con varios sustratos; pero que tienen en común un mismo grupo químico (amino, fosfato, metil), el cual es el directamente modificado en la reacción, ejemplo esterasa que actúa sobre los grupos éster. Quimoselectividad Es la capacidad de catalizar reacciones con otros grupos funcionales como por ejemplo hidrólisis o síntesis de un enlace amida (aminólisis). Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Regioselectividad Es la capacidad para discriminar entre las posiciones externas sn-1,3 ó la posición interna sn-2. Lipasa sn-2 selectiva Lipasa sn-1,3 selectiva Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Estereoespecificidad Es la capacidad de diferenciar entre moléculas de sustrato que posean enantioisómeros cuando se trata de sustratos quirales. H O O O Ciclohexanona Monooxigenasa O2 ,NADPH, H+ H O H H2O, NADP+ + O H Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología A Stereo Specificity sp3 D B Enzyme surface C The tetrahedral structure of carbon orbital has rigid steric strain which makes the basic building unit of protein conformation D B C C B D These two triangles are not identical Juang RH (2004) BCbasics Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Amplia especificidad (La excepción a la regla) Catalizando un amplio rango de compuestos y reacciones Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Chymotrypsin Has A Site for Specificity O O N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C R H R’ OC Ser Specificity Catalytic Site Site Active Site Juang RH (2004) BCbasics Planta Piloto de Specificity ofFermentaciones Ser-Protease Family Departamento de Biotecnología cut at Lys, Arg Deep and negatively charged pocket O O –C–N–C–C–N– C C C C NH3 + COOC Asp Chymotrypsin Elastase cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly O O –C–N–C–C–N– C O O –C–N–C–C–N– CH3 Shallow and non-polar pocket Non-polar pocket Active Site Juang RH (2004) BCbasics Trypsin Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Algunos otros términos importantes • Cofactores – Iones metálicos – Móleculas orgánicas (coenzimas)—usualmente derivados de vitaminas • FAD • NAD/H • Grupos Prostéticos—Cofactores enlazados covalentemente • Apoenzima/holoenzima Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Cofactores y Coenzimas Son pequeñas moléculas que se asocian con enzimas para facilitar las reacciones que amino ácidos no pueden hacer solos Ejemplo: oxidación – reducción • Iones metálicos que actúan como cofactores - Cu2+, Fe3+, y Zn2+ • Cofactores orgánicos son generalmente referidos como coenzimas - NAD+ y CoA • Cosubstratos - cofactores que están solamente asociados transientemente con la enzima • Grupos prostéticos - cofactores que están permanentemente asociados con la enzima Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Con y sin Cofactor/Coenzima • Haloenzima – Una enzima catalíticamente activa con su cofactor • Apoenzima - enzima sin el cofactor Apoenzima + cofactor ↔ haloenzima (inactive) (active) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Regeneración de Coenzimas • Las coenzimas son cambiadas químicamente en la reacción en la cual participan • Las coenzimas deben ser regeneradas para poder completar el ciclo catalítico • En las reacciones catalizadas por NADH, NAD+ es reducido a NADH. El NADH debe ser nuevamente oxidado NAD+ para permitir que ocurran múltiples ciclos de la reacciones • Para los cofactores unidos transientemente, algunas veces la regeneración es realizada por otra enzima • En el caso de grupos prostéticos, la regeneración ocurre en una fase separada de la misma secuencia de reacciones enzimáticas Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Coenzimas Adenosine Triphosphate (ATP) Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADP+) Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Metales y oligoelementos importantes como cofactores enzimáticos Metal Ejemplo de enzima Función del metal Fe Citocromo oxidasa Oxidación reducción Cu Ácido ascórbico oxidasa Oxidación-reducción Zn Alcohol deshidrogenasa Facilita la unión de NAD+ Mn Histidina amoniaco liasa Facilita la catálisis mediante la extracción de electrones Co Glutamato mutasa El Co forma parte de la coenzima cobalamina Ni Ureasa Lugar catalítico Mo Xantina oxidasa Oxidación-reducción V Nitrato reductasa Oxidación-reducción Se Glutatión peroxidasa Sustituye al S en una cisteína del lugar activo
