F(ab`)2 anti PLA2 crotalica neutraliza la actividad fosfolipásica, y

Resumen: E-033
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F(ab`)2 anti PLA2 crotalica neutraliza la actividad fosfolipásica, y edematogénica
del veneno de Crotalus durissus terrificus (Cascabel).
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Rodríguez, Juan P. - Maruñak, Silvana - Acosta, Ofelia - Leiva, Laura C. - Malchiodi, Emilio L.
1. Cátedra de Química Biológica I, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, U.N.N.E.
Av. Libertad 5400 Corrientes, ARGENTINA. TE 03783 - 457996 Int 112. e-mail: lcleiva@exa.unne-.edu.ar
2. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU) – UBA – CONICET
Junín 956 4to piso. Buenos Aires ARGENTINA. TE 011 4964-8259/69 Int 110
3. Cátedra de Farmacología, Facultad de Ciencias Veterinarias UNNE.
Sgto. Cabral 2139 – Corrientes ARGENTINA. TE 03783-425753 int. 113
ANTECEDENTES
En la intoxicación por veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) de Sud América se presentan efectos sobre
sistema nervioso1. El veneno constituye un paquete de sustancias tóxicas tales como: crotoxina, crotamina, convulsina y
giroxina. Tanto la crotamina como la crotoxina son las que causan alteraciones en la neurotransmisión periférica.2.
La crotoxina, principal componente del veneno, exhibe actividad neurotóxica 3. Es un complejo formado por dos
proteínas unidas de modo no covalente, una básica y otra acídica. El componente básico (crotoxina B) con un pI de 8.6
4
o 9.7 5 es una fosfolipasa A2. Esta enzima puede reproducir todos los efectos farmacodinámicos de la crotoxina aunque
a dosis más altas de las requeridas por el complejo crotoxina 2,6,7. El componente acídico (crotoxina A), denominado
crotapotín, con un pI de 3.4-3.7 4,8 es un polipéptido que no presenta actividad enzimática ni posee toxicidad. En
presencia de la fosfolipasa A2, la proteína acídica, crotapotín forma un complejo en el cual se restablecen las
propiedades fisicoquímicas y la alta toxicidad que exhibe la crotoxina, aunque reduce la actividad que exhibe la
fosfolipasa A2 cuando está libre 9.
La crotoxina también presenta actividad hemolítica10. Este efecto es debido principalmente a los productos
formados por la acción fosfolipásica sobre glicerofosfolípidos, esto es, ácidos grasos y lisofosfolípidos. Los
lisofosfolípidos emulsionan los fosfolípidos de la membrana, alterando así la estructura de la membrana del eritrocito,
lo que conlleva a la lisis celular. Por lo tanto, se trata de una hemólisis indirecta.
El tratamiento de elección para las intoxicaciones ofídicas, es la administración, a tiempo, del antisuero
específico. Está constituido por anticuerpos heterólogos, generados por inoculación de caballos con el veneno entero
correspondiente. Si bien este tipo de suero genera una protección inmediata frente a la toxicidad del veneno, se genera
un paquete proteico exógeno que produce reacciones adversas donde, la porción Fc de los anticuerpos es la principal
responsable de las mismas11. Es por esto que la OMS, ha estado recomendando desde 1981 la utilización de antivenenos
del tipo F(ab´)2, como así también Fab 12,13
Trabajos previos14 demostraron que IgG anti-PLA2, producidos en conejos, son neutralizantes de la letalidad del
veneno, además es factible la obtención de F(ab´)2 capaces de unirse y bloquear la acción fosfolipasa del veneno de
Crotalus durissus terrificus (C.d.t.)15
Un antiveneno constituido por F(ab´)2 posee reducida inmunogenicidad, dado que la porción antigénica de los
anticuerpos completos (porción FC) no está presente, lo que aumenta su versatilidad de uso y disminuye el riesgo de
aparción de reacciones adversas. En este trabajo se demostró la capacidad neutralizante de la actividad fosfolipásica y
edematogénica del veneno en tests in vitro e in vivo. Los resultados obtenidos permiten considerar el uso potencial de
este antídoto para el tratamiento farmacológico de intoxicaciones por cascabel.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Veneno y obtención del antígeno.
Veneno disecado de Crotalus durissus terrificus fue provisto por el Zoológico de la ciudad de Corrientes.
El antígeno, PLA2, enzima presente en el veneno de C. d. t. se aisló y purificó según técnica descripta por Landucci16 y
Adaptada por Rodríguez14 et al.
Animales.
Se trabajó con conejos mestizos machos en grupos de 5 (cinco), distribuidos en dos grupos.
Preparación del inóculo: 700 µg. del antígeno (PLA2) se disolvió en 1 ml de buffer PBS. A esta solución se le
agregaron 20 µl de Tween 20, y luego gota a gota, sobre vórtex, 1 ml de Ayuvante Completo de Freud. Se agitó hasta
formar una emulsión evitando que se separe el aceite del adyuvante en una fase y, el PBS, en otra. Los boosters se
realizaron de la misma manera, con la utilización de Adyuvante incompleto de Freud.
Protocolo de inmunización: los conejos se inmunizaron mediante la inoculación de 0.6 ml intramuscular en cada
miembro posterior y 0,8 ml aplicados en 3 inyecciones subcutáneas en distintos lugares del lomo. A los 15 y 21 días se
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aplicaron los refuerzos del mismo modo. A los 60 días se sangraron los conejos por vena yugular. Los sueros de los
respectivos conejos inmunizados se mezclaron en un pool, sometiendo el mismo a test de detección de anticuerpos.
Obtención de F(ab’)2
1. Obtención de gammaglobulinas: Las inmunoglobulinas fueron separadas del resto de las proteínas del suero de
conejo por precipitación con (NH4)2SO4. El precipitado se desionizó y se mantuvo a –20°C liofilizado, hasta el
moento de uso.
2. Obtención de IgG anti-PLA2: 2 mL de solución de Inmunoglulinas (10 mg/mL) se sembró en columna de Mono-Q
FPLC (HR 5/5 de Amersham Biosciences) y se eluyó con buffer Tris 50 mM pH: 8.5 hasta no detección de
proteínas. Las proteínas fijadas a la columna fueron luego eluídas con buffer Tris 50 mM, NaCl 1M pH: 8.5.
3. Digestión con pepsina: IgG anti-PLA2 en buffer Acetato de sodio 0,1M pH 4.5. se digerió con Pepsina en relación
50/1. La mezcla se incubó 17 hs, a 37 ºC. Luego de dicho tiempo la reacción se detuvo con el agregado de buffer Tris
1M pH: 8. Los Fragmentos obtenidos en la digestión se analizaron por SDS – PAGE.
4. Eliminación del Fragmento FC: los F(ab’)2 obtenidos de la digestión pépsica se purificaron del fragmento FC por
cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-100 usando Tris 50 mM pH 8.5 como buffer eluyente.
Ensayos de Neutralización con F(ab’)2 anti- PLA2 producidos:
Neutralización de la actividad fosfolipásica directa:
La actividad fosfolipásica directa se realizó mediante el test cinético descripto por Lobo y Araujo17, en el cual, 15 µl de
muestra (veneno entero o veneno entero preincubado durante 60 minutos a 37°C, con diluciones de F(ab´)2 anti-PLA2
obtenido) se adicionaron a 1,5 mL de mezcla reaccionante (10 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 7 mM Triton X-100; 0,265%
de Lecitina de Soja, 100 µM Rojo de Fenol) de pH: 7,6. Se registraron los cambios de absorbancia por minuto de la
reacción durante 5 minutos y se determinó la velocidad de reacción en UI/L. La neutralización de la actividad
fosfolipásica se expresó como la cantidad de antiveneno (mg) necesaria para disminuir la velocidad de reacción en un
50% (Dosis Efectiva 50, DE50)
Neutralización de la actividad hemolítica del veneno de C. d t.
En placas de plástico, se depositaron 25 ml de agar al 1% (previamente fundido y enfriado a 50 °C) pH: 7,2 conteniendo
0,3 ml de solución 1:3 de yema de huevo en solución Fisiológica, 0,3 ml de paquete del glóbulos rojos, 0,25 ml de
CaCl2 0,01M y 5 mg. de Azida sódica. Se dejo solidificar y se confeccionaron 4 pares de orificios con un sacabocados
de 3 mm de diámetro. En cada uno de los pares de orificios se sembró veneno entero o veneno entero preincubado
durante 60 minutos a 37°C en partes iguales, con diluciones de F(ab´)2 anti-PLA2 obtenido. Las placas fueron incubadas
en cámara húmeda durante 20 hs. a 37°C., midiéndose luego los diámetros de los halos de hemólisis. La neutralización
de la actividad fosfolipásica indirecta o hemolítica se expresó como la cantidad de antiveneno (mg) necesaria para
disminuir el diámetro de halo de hemolisis 50% con respecto al halo medido con veneno solo (Dosis Efectiva 50, DE50).
Neutralización de la actividad edematogénica del veneno de C. d t.
Se utilizó el método de Yamakawa et al18, 1976. Grupo de 6 ratones machos de la cepa Cf1 (20 + 2 g.) fueron
inoculados en almohadilla plantar dérmica con 50 µl de veneno entero o veneno preincubados con un volumen
previamente ajustado de F(ab`)2 anti-PLA2 obtenido 60 minutos a 37 ºC. El miembro contrario fue inoculado con 50 µl
de PBS. Los ratones fueron sacrificados 5 horas después con anestesia (hidrato de cloral), luego se cortaron ambos
miembros inoculados y se pesaron en balanza analítica. El edema fue expresado en porcentaje como incremento de peso
del miembro inoculado respecto al opuesto y la neutralización como la disminución del edema respecto a los controles
que recibieron veneno preincubado con PBS.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Obtención de fragmentos F(ab´)2 anti-PLA2
La digestión con pepsina de IgG anti-PLA2 produjo fragmentos F(ab`)2 detectados por SDS-PAGE (Figura 1). La
eliminación del fragmento Fc por cromatografía de exclusión molecular resultó efectiva, tal como se muestra en el
perfil de elusión en la Figura 2. El pico I corresponde a F(ab`)2 y el pico II, de menor peso molecular, al fragmento Fc
junto a péptidos productos de la digestión. La purificación de F(ab`)2 se confirmó por SDS-PAGE (Figura 1).
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Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida. A: IgG (2 mg/mL). B: Digesto de IgG sin purificar. C: F(ab`)2
purificado. D: Marcadores de peso molecular (SIGMA: albúmina bovina, 66 kDa; ovoalbúmina, 45 kDa;
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa ,36 kDa; anhidrasa carbónica ,29 kDa; tripsinógeno , 24 kDa; y lactalbúmina
20 kDa) Las proteínas separadas se tiñeron con AgNO3
I
2.5
2
II
Abs.
1.5
1
0.5
0
0
10
20
30
40
50
N° de Tubo
Figura 2. Exclusión molecular en Sephadex G-100.
Purificación de F(ab)2 anti-PLA2 a partir de digesto de IgG anti-PLA2 con Pepsina
Neutralización de las actividades Fosfolipásicas y Edematogénica del veneno de C. d t.
La neutralización de la actividad fosfolipásica (por método cinético) se demostró por la disminución de la velocidad de
reacción de mezclas de veneno preincubadas con F(ab´)2 anti-PLA2 con respecto a las velocidades obtenidas para
veneno solo. En la Tabla 1 se comparan las Dosis Efectivas de F(ab´)2 o Antisuero crotálico comercial necesarias para
neutralizar una cantidad predefinida de veneno entero (100 µg), se observa que las dosis obtenidas son similares.
La capacidad neutralizante de la actividad hemolítica de los fragmentos F(ab´)2 fue demostrada con la reducción de los
halos de hemólisis que se obtuvieron al comparar los halos producidos por una cantidad predeterminada de veneno
preincubado con PBS y la misma cantidad de veneno preincubada con fragmentos F(ab´)2. La capacidad neutralizante
obtenida para los fragmentos F(ab´)2 fue levemente superior a la obtenida con el suero anticrotálico comercial para la
concentración proteica de antivenenos ensayadas.
La neutralización de la actividad edematizante se llevo a cabo considerando la Dosis Efectiva neutralizante de la
actividad hemolítica. Se obtuvo una reducción del 56 ± 0,5 % en la actividad edematogénica con F(ab´)2 anti-PLA2 y
un 47 ± 0,4 % utilizando Suero crotálico comercial.
En las actividades fosfolipásicas y edematogénica ensayadas los F(ab´)2 resultaron igualmente efectivos que el suero
comercial, dado que las dosis requeridas para lograr la neutralización de veneno entero fueron semejantes.
Tabla 1. Neutralización de la actividad enzimática de PLA2 mediante F(ab’)2 [mg de F(ab’)2 por 100 µg de veneno
entero neutralizado]. Comparación con Suero anticrotálico comercial.
Suero
F(ab´)2
anticrotálico
anti-PLA2
comercial
Actividad Fosfolipásica
1,54 ± 0,15 1,66 ± 0,16
Directa (DE50)
Actividad hemolitica
3,65 ± 0,36 2,97 ± 0.29
Indirecta (DE50)
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CONCLUSIONES
Los fragmentos F(ab`)2 anti-PLA2 obtenidos a partir de suero hiperinmune de conejo mostraron capacidad neutralizante
de las actividades fosfolipásica, hemolítica y edematogénica exhibidas por el veneno entero, comparable a la del suero
anticrotálico comercial, con la ventaja de que F(ab`)2 anti-PLA2 al carecer de Fc es no inmunogénico, por ende el riesgo
de aparición de reacciones adversas es menor.
Dado que la actividad fosfolipásica es responsable de la letalidad del veneno entero, los resultados obtenidos permitirían
la potencial utilización estos fragmentos para neutralizar la toxicidad del veneno crotálico. Restan aun estudios
sistémicos a fin de comprobar que no perduren secuelas consecuentes a la acción del veneno entero. Cabe también la
posibilidad de que estos fragmentos puedan ser empleados para aumentar el carácter protector de antivenenos
comerciales.
BIBLIOGRAFIA.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Vital Brasil “Neurotoxins from the South American rattlesnake venom. J.” Formosan Med. Assoc. 71, 395, 1972.
Habermann, E. and Breithaupt, H.: Mini-review. The crotoxin complex-An example of biochemical and
pharmacological protein complementation. Toxicon 16: 19, 1978.
Brazil, O. V. (1966). Pharmacology of crystaline crotoxin. II. Neuromuscular blocking action. Mem. Inst. Butantan
33, 981-992.
Horst, J., Hendon, R. A. and Fraenkel-Conrat, HThe active components of crotoxin. Biochem. Biophys. Res.
Comunn. 46, 1042, 1972
Breithaupt, H., Omori-Satoh, T and Lang, J (1975) Isolation and characterization of three phospholipases A from
the crotoxin complex. Biochim. Biophys. Acta 403, 355.
Rübsamen, K, Breithaupt, H and Habermann E, (1971) biochemistry and pharmacology of the crotoxin complex. I.
Subfractionation and recombination of the crotoxin complex. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Exp. Path. Pharmax.
270,274.
Fraenkle-Conrat, H and Singer, B. Fractionation and composition of crotoxin. Archs Biochem. Biophys. 60,64.
1956
Breithaupt, h, Rübsamen, K and Haberman, E (1974) Biochemistry and pharmacology of the crotoxin complex.
Biochemical analysis of crotapotin and the basic Crotalus phospholipase A. Eur. J. biochem. 49, 333.
Breithaupt, H., Habermann, E. Byochemistry and Pharmacology of phospholipase A and its complex from
Crotaluss durissus terrificus venom as influenced by crotapotin. Toxicon 10, 525-526 (1972)
Rosenfeld, G. Symptomatology, pathology and treatment of snake venoms with a practical methodof threatment of
snake bites in South America. In: Buckley E. E. Bücherl, W. (Eds.): Venomous and their venoms. Vol: II. New
York- London Academic Press, 1971
Otero, R.; Núñez, V.; Barona, J.; Díaz, A.; Saldarriaga, M. Características bioquímicas y capacidad neutralizante de
cuatro antivenenos polivalentes frente a los efectos farmacológicos y enzimáticos de Bothrops asper y Porthidium
nasutum de Antioquia y Chocó. IATREIA, 15(1):1-10, 2002 (Otero et al, 2002)
World Helath Organization. Progress in the characterization of venoms an standarization of antivenoms. Who
Offset Public Nº 58. Geneva 1981.
Chipaux JP; Goyffon, M. Venoms, antivenoms and inmunotherapy. Toxicon, 36: 823 – 846, 1998
Rodríguez, Juan .P.; Leiva, Laura C. y Acosta, Ofelia. Producción de Anticuerpos específicos anti PLA2 en
conejos. http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/com2004/index.htm E 046.
Rodríguez, Juan .P.; Demarci Mauricio.; Acosta, Ofelia.; Lieva Laura y Malchidi, Emilio. F(ab`)2 anti-PLA2
crotalica neutraliza la actividad fosfolipásica in-vitro del veneno de Crotalus durissus terrificus (Cascabel). .
http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/com2005/index.htm. E 033.
Landucci, Elen C. T., Condino-Neto, A., Perez A.C., Hislop, S., Corrado, A. P., Novello J. C., Marangoni, S.,
Oliveira B., Antunes E. and Nucci G. (1993). Crotoxin induces aggregation of human washed platelets. Toxicon
32(2), 271-226, 1994.
Lôbo de Araújo A. and Radvanyi, F. Determination of phospholipase A2 activity by a colorimetric assay using a
pH indicator. Toxicon 25, 1181-1188, 1987
Yamakawa, M., Nozaki, M., Hokama, Z., 1976. Fractionation of Sakishima-Habu (Trimeresurus elegans) venom
and lethal, hemorrhagic, and edema forming activities of the fraction. In: Ohsaka, A., Hayash, K., Sawai, Y. (Eds.),
Animal, Plant and Microbial Toxins Biochemistry. Plenum Press, New York, pp. 97–109.