biología molecular de rotavirus: una mirada a través de la

Bustos Jaimes I, Castañeda Patlán C, Oria Hernández J,
Rendón Huerta E, Reyes Vivas H, Romero Álvarez I,
(eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXXII. Depto de
Bioquímica, Fac de Medicina, Universidad Nacional
Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF,
MÉXICO (2008).
(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)
(ISSN-0188-137X)
BIOLOGÍA MOLECULAR DE ROTAVIRUS: UNA MIRADA A
TRAVÉS DE LA INTERFERENCIA DE RNA
Margarito Rojas, Camilo Ayala-Breton y Susana López*
Departamento de Genética y Fisiología Molecular.
Instituto de Biotecnología/ UNAM
Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, 62210
*susana@ibt.unam.mx
Resumen
Los rotavirus son el agente etiológico mas importante de gastroenteritis infantil, siendo
responsables de alrededor de 600,000 muertes al año en todo el mundo. Recientemente han
salido al mercado dos vacunas para la prevención de la diarrea severa causada por estos virus,
pero la experiencia con la primera vacuna contra rotavirus, que tuvo que ser retirada del mercado
un año después de su liberación, debido a que se encontró una posible asociación con
intususcepción, nos ha dejado claro que es necesario conocer profundamente la biología de
estos virus para poder diseñar estrategias preventivas y/o terapéuticas que nos permitan
contender con la infección causada por estos virus.
Los rotavirus están formados por tres capas concéntricas de proteína que envuelven al
genoma viral que consta de once segmentos de RNA de doble cadena. Este genoma tan
particular ha sido uno de los obstáculos mas importantes para hacer mutantes sitio dirigidas en
cada uno de los genes virales y estudiar su función. Recientemente se ha descrito un nuevo
proceso en biología, la interferencia de RNA (RNAi), que consiste en el silenciamiento
secuencia-específico de genes a través del apareamiento de pequeños RNAs (siRNAs o
microRNAs) con RNA mensajeros específicos, lo que dirige su degradación y por lo tanto, la
falta de expresión de la proteína que codifican.
En nuestro laboratorio hemos empleado exitosamente la RNAi para silenciar la expresión
de cada una de las proteínas de rotavirus, lo que nos ha permitido conocer las funciones de
estas durante la infección. En este trabajo, presentamos algunos de los hallazgos con los que
nos hemos encontrado al utilizar esta metodología.
Palabras clave: Rotavirus, gastroenteritis viral, RNA de interferencia, morfogénesis viral,
silenciamiento génico.
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
Abstract
Rotaviruses are the single most important agent of acute severe gastroenteritis in
children worldwide. It has been estimated that they are responsible for about 600,000 deaths
annually. Two new vaccines against these viruses have been released recently, however the
previous experience with the first human rotavirus vaccine, which had to be withdrawn from the
market after the finding of a possible correlation of vaccinated children with intussusceptions, has
made clear the need for a deep knowledge of the biology of rotaviruses to be able to design novel
preventive and/or therapeutic measures against the infection caused by these viruses.
Rotaviruses are formed by three concentric layers of protein which surround the viral
genome composed of eleven segments of double stranded RNA. The genome of these viruses
has not been amenable to reverse genetics and thus the biochemistry and molecular
characterization of the genes of this virus have been limited to a few mutants that have been
isolated. Recently, a new phenomenon in biology has been described; the RNA interference
(RNAi), this is a sequence-specific process by which small fragments of double stranded RNA
hybridize with the corresponding mRNA and direct its degradation, with the consequent silencing
of the expression of the protein encoded by it. In our laboratory, we have used RNAi to silence
the expression of each of the rotavirus proteins to study their function and the effect of their
absence during the infection. In this manuscript we describe some of the findings that we have
encountered using this methodology to study the molecular biology of rotaviruses.
Keywords: rotavirus, viral gastroenteritis, RNA interference, viral morphogenesis, RNA silencing.
Introducción
Rotavirus
Las gastroenteritis infecciosas agudas son la causa más frecuente de morbilidad y
mortalidad en niños menores de cinco años en los países en desarrollo, con alrededor de mil
millones de episodios diarreicos y entre cuatro y cinco millones de muertes por año. Los rotavirus
del grupo A son la causa principal de las diarreas deshidratantes severas en niños menores de
dos años, y se ha estimado que una vacuna efectiva contra estos virus podría evitar cerca de
600,000 muertes de infantes cada año [1]. Resulta interesante notar que, aunque la mortalidad
debida a las infecciones por rotavirus es mucho mayor en países en desarrollo que en países
desarrollados, la frecuencia de infección es muy similar en todo el mundo. Ya que los rotavirus
juegan un papel tan importante en las enfermedades diarreicas infantiles, y debido a que incluso
niveles de higiene avanzados no son capaces de controlar significativamente las infecciones por
estos virus, existe un interés considerable para desarrollar estrategias efectivas de vacunación
y/o terapéuticas. Recientemente se aprobaron dos vacunas vivas atenuadas contra rotavirus y a
finales del 2007 se inició la aplicación de una de estas vacunas en México. Sin embargo, la
experiencia previa con la primera vacuna de rotavirus, que fue autorizada en Estados Unidos en
1998 y que fue retirada del mercado al año siguiente debido a una posible correlación entre la
aplicación de esta vacuna y la aparición de intususcepción en niños vacunados [2], ha reforzado
la idea de que es necesario desarrollar estrategias alternativas para la inducción de protección
contra estos virus. Es fundamental para este desarrollo el conocimiento básico de los
mecanismos moleculares por los cuales los rotavirus interaccionan con su célula huésped.
150
Rojas y cols.
Estructura
Los rotavirus del grupo A, miembros de la familia Reoviridae, son virus no envueltos que
tienen aproximadamente 100 nm de diámetro. El virión maduro está compuesto por tres capas
concéntricas de proteínas que engloban al genoma viral, el cual consta de once segmentos de
RNA de doble cadena (dsRNA) (Figura 1). La capa más interna del virión está formada por 60
dímeros de la proteína VP2, que rodea al genoma del virón y de pequeñas cantidades de la RNA
polimerasa VP1 y de la guanilil-transferasa VP3. Doscientos sesenta trímeros de VP6, la
proteína más abundante del virión, constituyen la capa intermedia. La capa más externa está
formada por dos proteínas, VP4 y VP7. La superficie lisa del virus está compuesta por 780
copias de la glicoproteína VP7, organizada en forma de trímeros, mientras que 60 espículas,
formadas por VP4, se proyectan hacia el exterior de la superficie viral [3]. La proteína VP4 tiene
funciones esenciales en el ciclo de vida del virus, incluyendo la unión al receptor y la penetración
a la célula que infecta; por lo tanto, las propiedades de esta proteína son determinantes
importantes del rango de huésped, virulencia, tropismo, e inducción de inmunidad protectora [3].
El papel de VP7 durante las primeras interacciones del virus con la célula no es muy claro,
aunque se ha demostrado recientemente que esta proteína interacciona con la superficie celular
en eventos posteriores a la unión inicial [4].
Figura 1. a) Diagrama de la partícula viral madura (TLP) con sus tres capas; b)
Electroforesis del genoma viral; c) Proteínas marcadas de células infectadas (+), o no (-)
con rotavirus.
Después de unirse a la superficie de la célula, el virus penetra la membrana plasmática
durante el proceso de entrada. Esta penetración se incrementa y muy probablemente depende,
del tratamiento del virus con tripsina. Este tratamiento proteolítico resulta en el corte específico
de VP4 en dos polipéptidos de menor peso molecular, llamados VP8 y VP5 [5]. Los rotavirus
tienen un tropismo muy específico, ya que únicamente infectan las puntas de las vellosidades del
intestino delgado, esto sugiere que deben existir receptores específicos que permitan su entrada
a la célula huésped. In vitro, estos virus también muestran un tropismo restringido ya que,
aunque pueden unirse a la superficie de una gran variedad de líneas celulares, sólo son capaces
de infectar eficientemente aquellas derivadas de epitelio renal o intestinal. Este tropismo es
debido, cuando menos en parte, a la interacción del virus con sus receptores celulares;
aparentemente, la entrada de estos virus a la célula huésped es un proceso que se lleva a cabo
en varios pasos, en el cual están involucrados diferentes dominios de las proteínas de superficie
del virus, así como varios receptores celulares, que incluyen a las integrinas a2b1, a4b1, axb2,
avb3 y a la proteína hsc70 [6]. Además de estas proteínas, se ha sugerido que las balsas
lipídicas (microdominios ricos en colesterol y esfingolípidos) tienen un papel importante en la
infección [7]. Aun se desconoce la vía de internalización del virus, aunque se ha propuesto que
podría ser a través de endocitosis dependiente de balsas lipídicas o mediante un mecanismo de
penetración directa a través de la membrana plasmática [8].
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
Ciclo replicativo
Durante el proceso de entrada, la partícula viral pierde las proteínas de la capa externa y
se activa la trascripción que depende de la RNA polimerasa viral (VP1) (Figura 2). Los transcritos
virales recién sintetizados tienen dos funciones; por una parte funcionan como mRNAs que
dirigen la síntesis de las seis proteínas estructurales (VP1-VP7) y las seis proteínas noestructurales (NSP1-NSP6) del virus [3] y por la otra, sirven como templados para la síntesis de
la cadena negativa (que es complementaria al mRNA) y da lugar al RNA de doble cadena
(dsRNA) que constituye el genoma viral [9].
Una vez que se acumula una masa crítica de proteínas virales, de 3 a 4 horas después
de la infección, se forman en el citoplasma celular estructuras electrodensas llamadas
viroplasmas (Figura 3), en donde se ha propuesto que se lleva a cabo la replicación del genoma
viral. En estas estructuras también se ensamblan las partículas de doble capa que
posteriormente geman al interior del retículo endoplásmico y adquieren durante este proceso la
tercera capa protéica, dando lugar a la partícula madura [10,11] (Figura 2). Las proteínas NSP2 y
NSP5 son esenciales para la formación de los viroplasmas, ya que en ausencia de cualquiera de
ellas no se forman estas estructuras y el ciclo replicativo del virus se interrumpe [12,13].
Figura 2. Ciclo replicativo de rotavirus. El virus interacciona con sus receptores en la
superficie de la célula y penetra por un mecanismo aun desconocido. En el interior de la
célula se activa la transcriptasa viral y los mRNAs dirigen la síntesis de proteínas virales.
Las proteínas se acumulan en estructuras llamadas viroplasmas donde se replica el RNA
viral y se ensamblan las partículas de dos capas (DLPs) para proseguir la morfogénesis
en el retículo endoplásmico.
Poco tiempo después de su entrada, el virus se apodera de la maquinaria de síntesis de
proteínas de la célula, de modo que la mayoría de las proteínas que son sintetizadas durante la
infección son las proteínas virales y la síntesis de proteína celular se ve casi abatida
completamente (Figura 1C). Los mRNAs virales tiene una estructura Cap- en el extremo 5’, pero
a diferencia de la mayoría de los mRNAs celulares, no contienen poli-A en el extremo 3’, y en su
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Rojas y cols.
lugar, tienen una secuencia consenso (GACC3’) que está conservada en los once segmentos del
RNA viral [9].
Figura 3. Célula infectada con rotavirus. En verde se tiñeron las fibras de actina, en azul
los núcleos y en rojo los viroplasmas utilizando un anticuerpo contra la proteína NSP2.
Replicación
En los viroplasmas, o fábricas virales, es donde los mensajeros virales cumplen su
segunda función, servir como templado para la replicación del genoma. La serie de eventos
necesarios para este proceso no se conocen completamente, sin embargo, se han descrito
complejos de RNAs con proteínas virales que han sido propuestos como intermediarios de
replicación (IRs). La unidad mínima está formada por las proteínas VP1 y VP3 en asociación con
el mRNA. El siguiente intermediario se define como el pre-core, en el que además de VP1 y VP3,
se añaden las proteínas NSP2 y NSP5, las cuales probablemente ayudarían a un proceso activo
de entrada del mRNA hacia el interior del core, al que se ha agregado VP2; es en estos IRs
donde se lleva a cabo la replicación del genoma viral. Posteriormente, VP6 se ensambla sobre el
core, para formar a la partícula de dos capas o DLP, la cual ya contiene los elementos
necesarios para llevar a cabo una nueva ronda de transcripción del genoma [9].
La falta de un sistema eficiente de genética reversa para rotavirus ha hecho muy
complicada y limitada la investigación acerca de la función de cada una de las proteínas virales
durante el ciclo replicativo del virus. Recientemente, se ha utilizado el sistema de interferencia de
RNA como una alternativa para inhibir de manera específica la traducción de cada una de las
proteínas virales y analizar el fenotipo resultante en células infectadas.
Interferencia de RNA
En los últimos años hemos presenciado la implementación de una nueva tecnología que
promete revolucionar la manera en que la investigación post-genómica se llevará a cabo, y el
campo de la virología está incluido en esta revolución. Esta nueva tecnología esta basada en un
fenómeno biológico recientemente descrito, al que se la ha llamado interferencia del RNA
(RNAi), silenciamiento de RNA, o silenciamiento génico postranscripcional. Este es un fenómeno
conservado evolutivamente que se encuentra en hongos, plantas y animales. La interferencia del
RNA es un proceso de respuesta al RNA de doble cadena (dsRNA) en el que se silencia, de
manera específica, la expresión del gene que tiene identidad con el dsRNA [14].
Originalmente, el sistema de RNAi fue descubierto en plantas y hongos al encontrar que,
la introducción de genes quiméricos involucrados en la producción de pigmentos, resultaba
paradójicamente en la producción de plantas y hongos sin color. Estos resultados parecían
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
indicar que la introducción de un gene extra inhibía la expresión del gene endógeno [15,16], a
este fenómeno se le denominó silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS por sus siglas
en inglés). Posteriormente en 1998, A. Fire y C. Mello [17], encontraron que la introducción de
fragmentos de dsRNA, pero no de cadena sencilla, al gusano Caenorhabditis elegans causaba la
inhibición de la expresión del gene que presentaba identidad en secuencia con el dsRNA
introducido. A este fenómeno le llamaron interferencia de RNA (RNAi), descripción que les valió
ganar el premio Nobel en el 2006. Más tarde, gracias a la contribución de varios grupos de
investigación, se demostró que en el interior de las células, las moléculas largas de dsRNAs eran
cortadas en fragmentos pequeños de 21 a 25 nucleótidos, estos fragmentos fueron denominados
RNAs interferentes pequeños (siRNAs, por sus siglas en inglés small interfering RNAs) [18-20].
Actualmente se sabe que estas moléculas median el proceso de RNAi. A partir de entonces, el
sistema de RNAi empezó a ser utilizado como herramienta biológica para apagar la expresión de
genes de plantas, nemátodos y otros organismos.
Fue mas difícil demostrar la existencia de este fenómeno en células de vertebrados, ya
que en éstas, los dsRNA de mas de 30 pb de longitud activan la respuesta de interferón, lo que
lleva a una inhibición inespecífica de la síntesis de proteína celular y a la degradación, también
inespecífica, de todos los mRNAs de la célula; este es un mecanismo que las células de
mamífero han desarrollado como defensa ante las infecciones virales. Afortunadamente, el grupo
de T. Tuschl encontró que la introducción de 21 meros de dsRNA a células de mamífero en
cultivo, escapa a la respuesta del interferón y es capaz de inducir la inhibición secuenciaespecífica de la expresión de un determinado gene, sin afectar la síntesis del resto de las
proteínas celulares [18]. Esta observación ofreció la gran oportunidad de utilizar la RNAi para
estudiar la función de cada uno de los genes de una célula y también la de los genes de distintos
virus que infectan a células de mamífero.
La RNAi se dispara en plantas y en animales invertebrados ante la presencia de
moléculas de dsRNA, las que son reconocidas y procesadas por una RNAsa específica de
dsRNA llamada Dicer. Esta enzima corta el dsRNA en fragmentos pequeños de ~20-25 pb
(siRNAs) que se asocian específicamente con un complejo multiprotéico llamado RISC (del
inglés, RNA-induced silencing complex), en el que una helicasa los desnaturaliza y una de las
cadenas del siRNA sirve como guía del complejo RISC hacia el RNA mensajero (mRNA) que
tiene la secuencia complementaria. Una vez que el complejo RISC reconoce al mRNA blanco,
una ribonucleasa presente en RISC corta al mensajero hacia la mitad del híbrido. El mRNA
cortado es sustrato de endo- y exonucleasas celulares que lo degradan, lo que tiene como
consecuencia el silenciamiento postranscripcional de la expresión de dicho gene [14] (Figura 4).
Se ha propuesto que naturalmente la RNAi juega un papel central en la regulación de
muchos procesos celulares a nivel de traducción, que incluyen la movilización de transposones,
el silenciamiento de transgenes, la regulación de algunos estadios tempranos en el desarrollo,
así como también en la regulación de la expresión a nivel de genoma. En plantas, se ha
demostrado que, entre otros papeles, la RNAi representa un mecanismo de defensa contra las
infecciones virales y se ha propuesto que este fenómeno juegue un papel similar en algunos
organismos invertebrados [14].
El estudio del sistema de RNAi conllevó al descubrimiento de los microRNAs (miRNAs),
los cuales presentan similitud estructural y funcional con los siRNAs. A diferencia del siRNAs, los
microRNAs se producen a partir de la transcripción de genes celulares, dando lugar a lo que se
conoce como microRNA primario (pri-microRNA). Esta molécula es procesada en el núcleo por
una enzima llamada Drosha, dando origen a una molécula de RNA de 70 a 100 pb, con una
estructura tipo tallo-asa (pro-microRNA) (Figura 4). Posteriormente, el pro-microRNA es
transportado al citoplasma donde es procesado por Dicer, la misma que enzima que procesa el
dsRNA. Finalmente, los microRNAs maduros (de 21-25 pb) se incorporan a complejos similares
a RISC. En estos complejos los microRNAs también dirigen el silenciamiento génico (Figura 4).
Sin embargo, a diferencia de los siRNAs, los microRNAs pueden reprimir a su blanco a través de
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Rojas y cols.
dirigir su degradación como los siRNAs o mediante la inhibición de la traducción de dicho mRNA,
sin causar su degradación; los mecanismos exactos por lo que esto ocurre aún no han sido
esclarecidos completamente [21,22].
Figura 4. 1) Generación de siRNAS por Dicer; 2) Asociación de los siRNAs a RISC; 3)
Hibridación con mRNA blanco y degradación; 4) Trascripción de primicroRNAs y
procesamiento por Drosha; 5) Corte de los pre microRNAs por Dicer; 6 ) Asociación del
microRNA con RISC y 7) Hibridación con el mRNA blanco y arresto de la traducción.
Aunque aun esta por definirse la función biológica precisa de este mecanismo, campo en
febril actividad, la observación de que este sistema es funcional en vertebrados y que se puede
aplicar a células en cultivo, ha dado lugar a su utilización como herramienta de silenciamiento
específico de genes. La RNAi ha resultado particularmente útil para estudiar aquellos virus para
los que no ha sido posible aun implementar un sistema de genética reversa. Es posible
pronosticar que pronto se utilizará la RNAi para analizar los genes celulares que interaccionan
con el genoma y las proteínas virales que participan durante el ciclo replicativo de un virus, y a
mediano plazo, al análisis de la función que los genes virales tienen durante la infección de un
organismo completo. Hay también grandes esperanzas de que se pueda aplicar la RNAi al
tratamiento de enfermedades virales, ya sea como medida profiláctica o terapéutica. Esta
metodología parece particularmente atractiva para aquellos virus que establecen infecciones
crónicas (VIH, virus de la hepatitis B y C) o latentes (virus del herpes). Actualmente, uno de los
principales retos es desarrollar métodos que permitan introducir los siRNAs de manera eficiente
y estable en organismos completos, de modo que lleguen al órgano blanco donde se espera que
actúen.
Actualmente, los siRNAs se pueden sintetizar químicamente e introducirlos en las células
de interés por diferentes métodos, entre los que destacan la transfección, la electroporación y la
microinyección. Recientemente demostramos que se puede utilizar la RNAi para silenciar de
manera específica la expresión de un gene viral sin afectar la expresión del resto de los genes
del virus, a través de introducir a la célula un siRNA cuya secuencia es complementaria a la del
gene viral que se desea silenciar [23,24]. Esta metodología está permitiendo estudiar la función
de cada uno de los genes rotavirales en el contexto de una infección, lo que no había sido
posible anteriormente dado que, como hemos mencionado, el genoma de estos virus no se
presta para hacer genética reversa. En nuestro laboratorio en el Instituto de Biotecnología hemos
empleado exitosamente esta metodología para el estudio de cada uno de los genes de rotavirus,
generando nueva información acerca de cada uno de los pasos del ciclo replicativo de estos
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
virus. A continuación expondremos algunos ejemplos de la aplicación de esta estrategia en el
estudio de la biología de estos virus.
Interferencia de genes de rotavirus
Como estrategia general para este tipo de ensayos, diseñamos y mandamos sintetizar
un oligonucleótido de dsRNA de 21 pares de bases con la secuencia homóloga al gene que se
desea silenciar. Este siRNA se introduce a células en cultivo mediante lipofección (utilizando
liposomas cargados positivamente que facilitan la entrada de ácidos nucleicos a través de la
membrana celular), posteriormente las células se infectan con rotavirus y estudiamos si el siRNA
es capaz de silenciar la expresión de la proteína blanco mediante ensayos de
inmunofluorescencia de las células transfectadas e infectadas; por inmunoensayos utilizando
lisados de las células infectadas, también determinamos el efecto del siRNA sobre la infectividad
viral y sobre la producción de progenie infecciosa. Todos estos ensayos se comparan con
células control que son tratadas de la misma manera que las células experimentales, pero que
fueron transfectadas con un siRNA control irrelevante, que tiene una secuencia para la que no
hay homólogos en el genoma de la célula (por ejemplo, un siRNA con secuencia homóloga a la
proteína verde fluorescente).
Papel de las proteínas virales durante la morfogénesis de la partícula viral
La morfogénesis viral es el proceso que comprende todos lo pasos necesarios para el
ensamble de las partículas virales infecciosas. La morfogénesis de los rotavirus inicia en los
viroplasmas, con el ensamble de los intermediarios de replicación que posteriormente dan origen
a las DLP’s. En células infectadas, la proteína VP7 y la proteína no estructural NSP4 son
glicoproteínas que durante su traducción se insertan y modifican en la membrana del retículo
endoplásmico (RE) (Figura 5). Las DLP’s presentes en los viroplasmas (que se encuentran
alrededor del RE), geman hacia el lumen del RE y se ha propuesto que la proteína NSP4 funge
como receptor de la DLP en la membrana del RE y favorece su gemación; durante este proceso,
las DLP’s adquieren una membrana lipídica transitoria que contiene, además de NSP4, a la
glicoproteína VP7 y a VP4 que es la proteína que forma las espículas del virus. Finalmente, las
partículas envueltas pierden la membrana lipídica, NSP4 se disocia y la capa externa, formada
por VP4 y VP7, adquiere su conformación final (Figura 5). El mecanismo por el cual se lleva a
cabo este último paso en la morfogénesis no esta claro; en estudios previos se había observado
que, in vitro, tanto VP4 como NSP4 tienen actividad desestabilizante de membranas y por lo
mismo, estas proteínas habían sido propuestas como las responsables de remover la membrana
lipídica de las partículas presentes en el lumen del RE [3,25]. Por otra parte, se había propuesto
que las proteínas VP4, VP7 y NSP4 formaban un receptor hetero-trimérico que permitía el
proceso de gemación de las DLP’s, hacia el interior del RE [26,27].
En nuestro laboratorio decidimos estudiar nuevamente el proceso de morfogénesis de
rotavirus utilizando como herramienta la interferencia de RNA, con la idea de establecer mas
claramente el papel de las proteínas virales en este proceso. La primera proteína cuya expresión
silenciamos fue VP4. Como hemos mencionado, VP4 forma las espículas de la partícula viral y
su función en el proceso de unión y entrada a la célula hospedera ha sido demostrada a partir de
la caracterización de cepas de rotavirus mutantes en VP4 y por el uso de anticuerpos que
bloquean la interacción entre VP4 y los receptores celulares. Utilizando estas herramientas, se
describió que la unión y entrada de los rotavirus a su célula hospedera requiere del
reconocimiento secuencial de diferentes receptores en la superficie celular. Para esto, los
rotavirus utilizan diferentes dominios de las proteínas de superficie VP4 y la glicoproteína VP7.
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Rojas y cols.
Figura 5. Morfogénesis de rotavirus. 1) Replicación del RNA viral en el core dentro del
viroplasma; 2) Adición de VP6 al core; 3) Interacción DLP-NSP4 y gemación hacia el
lumen del RE; 4) Partícula viral inmadura con membrana lipídica y NSP4; 5) Partícula viral
madura o TLP.
Sin embargo, no se había analizado el efecto que tendría la ausencia de VP4 sobre el
ciclo replicativo del virus. Diseñamos un siRNA con secuencia homóloga al gene que codifica
para VP4 y lo introdujimos a células en cultivo mediante lipofección, posteriormente estas células
se infectaron con rotavirus y estudiamos si efectivamente el siRNA de VP4 era capaz de silenciar
la expresión de esta proteína. Por ensayos de inmunofluorescencia en estas células y de
inmunoensayos utilizando lisados de las células infectadas, encontramos que la expresión de
VP4 disminuyó en un 80% (Figura 6) comparado con la expresión de esta proteína en células
infectadas en las que utilizamos un siRNA control. En ausencia de VP4, la síntesis de proteínas
del virus, el RNA genómico o el mRNA viral no se afectaron, resultado esperado, ya que a la
proteína VP4 no se le han atribuido funciones en los procesos de traducción, transcripción o
replicación viral. Interesantemente, en ausencia de VP4 se ensamblaron partículas de tres capas
(TLP’s) sin las espículas, a las que llamamos spikeless (sin espículas). Como era de esperarse,
las partículas spikeless son mucho menos infecciosas (aprox. 75%) que las partículas completas,
confirmando las observaciones previas en el sentido de que VP4 es importante en las primeras
interacciones del virus con su receptor en la superficie de su célula hospedera y en
consecuencia estas partículas son incapaces de unirse y de entrar a la célula [23,24].
Además de su participación en el proceso de entrada, a VP4 se le habían atribuido
algunas funciones en el proceso de morfogénesis de rotavirus, debido a su actividad de fusión
con membranas y a su presencia en heterotrímeros con VP7 y NSP4. Dadas estas
características, se esperaba que el silenciamiento de VP4 resultara en una disminución en la
morfogénesis de las partículas virales. Sin embargo, por microscopía electrónica, se observó que
en ausencia de VP4 se acumulan partículas spikeless sin cubierta lipídica en el lumen RE,
sugiriendo que VP4 no forma parte del receptor que permite la gemación de las DLP´s al interior
del RE y que la actividad fusogénica de esta proteína no es relevante para la morfogénesis del
virus. Adicionalmente, la formación de partículas spikeless demostró que el ensamble de VP7
sobre las partículas virales ocurre de manera independiente al ensamble de VP4, hecho que se
desconocía.
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Figura 6. Silenciamiento de la expresión de VP4. a) Inmunoblot de lisados celulares
infectados en presencia de los siRNAs indicados; b) Autorradiografía de los lisados
mostrados en a); c) Rendimiento viral.
El silenciamiento del gene que codifica para VP4 también nos permitió determinar que el
mRNA viral destinado a la replicación de los rotavirus no es degradado por el sistema de RNAi.
En células infectadas, el mRNA viral puede ser traducido a proteína viral o bien puede ser usado
como templado para la replicación de los segmentos de dsRNA virales, por lo que se esperaba
que el silenciamiento del gen que codifica para VP4 resultara una reducción en la síntesis de la
proteína VP4 y en una reducción en la replicación del segmento de dsRNA que codifica para
VP4. Sin embargo, al analizar el genoma de las partículas spikeless, observamos que el número
de segmentos de dsRNA y la abundancia de cada uno era similar a la observada en las TLP’s.
Estos datos sugieren que en las células infectadas existen dos pozas de RNA viral: una que se
dirige a la traducción de proteínas virales y que puede ser degrada por el sistema de RNAi y otra
poza que se utiliza para la síntesis de los segmentos de dsRNA y que no es susceptible al
sistema de RNAi. Sin embargo, el mecanismo por el cual los mRNA, destinados a la replicación,
evaden el sistema de RNAi permanece desconocido.
Posteriormente, analizamos la función de VP7 y NSP4 en la morfogénesis de los
rotavirus utilizando siRNAs dirigidos contra estas proteínas. El silenciamiento de VP7 o NSP4
resultó en una reducción de la producción de progenie viral de aproximadamente 75% en ambos
casos; sin embargo, la explicación en cada caso fue diferente. El silenciamiento de la expresión
de VP7 resultó en la reducción de la formación de TLP’s, efecto esperado ya que VP7 forma
parte de la tercera capa de los rotavirus. Al analizar las células por microscopía electrónica, se
observó que la reducción en la formación de TLP’s correlacionaba con la acumulación de DLP’s
envueltas en el lumen del RE. Esta observación nos permitió establecer que la glicoproteína VP7
no es indispensable para la gemación de las partículas al interior del RE. Si bien en ausencia de
VP7 se forman partículas virales, la falta de maduración de éstas, explica la disminución en
infectividad [28].
Por otra parte, al silenciar la expresión de NSP4 la distribución celular de la mayoría de
las proteínas virales se vio alterada y se redujo notablemente la formación de partículas virales,
lo que explica la reducción en la producción de progenie viral. Sin embargo, al analizar al
158
Rojas y cols.
microscopio electrónico estas células, encontramos que, aun en estas condiciones, se logra
formar una pequeña proporción de partículas maduras y sin envoltura lipídica en el interior del
RE. Estos datos indican que NSP4 y no el heterotrímero VP4/VP7/NSP4 es suficiente para servir
como receptor de las DLP’s en el RE [28].
El último paso en la morfogénesis de los rotavirus es la pérdida de la envoltura lipídica.
Como hemos mencionado antes, en ausencia de VP4 se acumulan partículas spikeless en el
RE; sin embargo, estas partículas ya han perdido la envoltura lipídica. Los resultados de este
trabajo sugieren que NSP4 podría tener una función importante en el proceso de ensamble de
las DLP´s; y que VP4 y NSP4 no son importantes en la remoción de la envoltura lipídica de las
partículas inmaduras. Sorprendentemente, silenciando la expresión de VP7, una proteína que no
había sido considerada importante durante este evento, se observó la acumulación partículas
envueltas en el lumen del RE. El hecho de que la capa de lípidos sea retenida cuando no se
encuentra VP7, aun en presencia de VP4 y NSP4, sugiere que VP7 es la proteína viral que
participa en el proceso de remoción de la envoltura de DLP’s. Esta hipótesis se ve reforzada
por el hecho de que el tratamiento con drogas que inhiben la glicosilación de VP7 en células
infectadas, también produce acumulación de partículas envueltas en el RE, similar a lo que
ocurre al silenciar la expresión de VP7.
Proteínas involucradas en el ciclo replicativo de rotavirus
Por ensayos de replicación y transcripción in vitro se ha encontrado que las proteínas
VP1 y VP2 son necesarias y suficientes para replicar el RNA viral. Sin embargo, estudios con
mutantes termosensibles de VP3, mostraron que esta proteína también es necesaria para la
replicación viral en células en cultivo. En vista de la diferencia en los resultados obtenidos in vitro
con respecto a in vivo, decidimos investigar el papel de las proteínas que forman a la DLP (VP1,
VP2, VP3 y VP6) en el ciclo replicativo del virus, utilizando RNAi para inhibir específicamente la
traducción de esas proteínas virales y analizar el fenotipo de las células infectadas en su
ausencia. Una vez que se demostró que los siRNAs eran efectivos para silenciar la expresión de
estas proteínas por inmunoensayos, lo siguiente fue analizar la producción de los mRNAs y
dsRNAs virales en ausencia de VP1, VP2, VP3 y VP6. En estos ensayos, las células
transfectadas con los diferentes siRNAs y posteriormente infectadas, fueron cosechadas a
distintos tiempos post-infección y se extrajo el RNA total de la célula para cuantificar el mRNA y
dsRNA virales mediante un ensayo de RT-PCR cuantitativo, para obtener una cinética de
acumulación del RNA viral. Encontramos que cuando las células fueron transfectadas con los
siRNAs dirigidos contra VP1, VP2, VP3 y VP6, pero no cuando se transfectaron con el siRNA
control, tanto la síntesis de mensajero, como la de RNA doble cadena se inhibieron (Fig 7b),
demostrando que estas proteínas son necesarias, directa o indirectamente, para la replicación y
transcripción del genoma del rotavirus (Ayala-Breton et al, resultados no publicados).
Estos resultados confirman los obtenidos al utilizar el sistema de replicación in vitro, ya
que encontramos que tanto VP1 como VP2 son importantes para la replicación del virus, pero
además nos permitió establecer que VP3 y VP6 también son relevantes para este proceso
durante la infección.
Continuando con el análisis del fenotipo obtenido al silenciar las proteínas que forman a
la DLP, estudiamos como era la traducción de proteínas virales y celulares bajo estas
condiciones. Cuando se silenciaron las proteínas VP1 o VP3, la síntesis de proteínas tanto
virales como celulares se mantenía muy similar a la observada en células control; en contraste,
al silenciar VP2 o VP6, la síntesis de proteínas virales se vio seriamente inhibida (Figura 7a).
Estos resultados son interesantes ya que a pesar de que en todos los casos la cantidad
de mRNA fue muy similar, observamos que el poco mRNA producido cuando se interfieren VP1
o VP3 es suficiente para dirigir la traducción de las proteínas virales a niveles comparables con
159
MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
el control. En contraste, cuando se silenció la expresión de VP2 y/o VP6, observamos que la
síntesis de proteínas virales disminuyó considerablemente. Estos resultados sugieren que tanto
VP2 como VP6 pueden jugar un papel ya sea directo o indirecto sobre la regulación de la
traducción de los mRNAs virales, aunque aun no sabemos cuál es el mecanismo por el que
estas proteínas pudieran estar actuando.
A la fecha no tenemos un modelo para explicar el papel de VP2 y VP6 en la traducción
viral. Una posibilidad es que estas proteínas protejan al mRNA viral de la degradación, o bien
que estas proteínas se unan a factores de traducción, y estas interacciones permitan la
traducción viral durante la infección.
Figura 7. Silenciamiento de la expresión de VP1, VP2, VP3, VP4 y VP6. a)
Autorradiografía de células infectadas en presencia de los siRNAs indicados, Luc es el
control. b) RT-PCR en tiempo real del mRNA y dsRNA producido en células en las que
VP1 fue silenciada.
En conclusión, el sistema de RNAi nos ha permitido conocer la importancia de VP1, VP2,
VP3 y VP6 en la replicación y transcripción virales. Aprendimos además que VP2 y VP6 son
importantes en la traducción viral, por lo que en su ausencia no hay síntesis de proteínas virales,
esta regulación traduccional es un hallazgo nuevo que requiere de ser explorado para
comprender el papel de estas proteínas (Ayala-Breton et al resultados no publicados). El uso de
RNAi para inhibir la traducción específica de cierta proteína viral ha ampliado el conocimiento
obtenido mediante replicación y transcripción in vitro y con mutantes termosensibles. Con esta
herramienta se hace posible el estudio in vivo del papel de otras proteínas virales durante la
infección por rotavirus.
Perspectivas
En general, como hemos ejemplificado en este trabajo, la RNAi tiene un gran potencial
como herramienta en muchos de los campos de la biología. De hecho, recientemente se ha
empezado a utilizar de manera generalizada en estudios genómicos para analizar la función de
cada uno de los genes de organismos completos, como en el gusano C. elegans, la mosca de la
fruta Drosophila melanogaster y mas recientemente se han descrito bibliotecas de siRNAs para
160
Rojas y cols.
silenciar todos los genes del genoma humano [29-31]. Los invitamos a meditar si no creen que
sea posible utilizar esta valiosa metodología en su sistema de estudio.
Referencias
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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)
Semblanza de la Dr. Susana López Charreton
La Dra. Susana López Charreton es Investigadora
Titular “C” del Instituto de Biotecnología de la UNAM y
pertenece al nivel III del Sistema Nacional de Investigadores.
La Dra. López hizo la licenciatura y el Doctorado en
Investigación Biomédica Básica, en la UNAM. Posteriormente
realizó estudios postdoctorales en el Instituto Tecnológico de
California (CalTech), EUA. Su área de investigación es la
virología molecular, con particular interés en el estudio de la
epidemiología y la biología molecular de virus causantes de
gastroenteritis infantiles Ha publicado 85 artículos en revistas
de circulación internacional de alto impacto, entre las que se
encuentran el Journal of Virology, Virology, Nucleic Acids
Research, Proceedings of the National Academy of Sciences,
EMBO Reports y Trends in Microbiology. Sus trabajos han sido
citados en más de 1700 ocasiones en la literatura mundial. Ha formado 19 estudiantes, 6 de
licenciatura, 9 de maestría y 5 de doctorado. Ha presentado más de 200 ponencias en congresos
nacionales e internacionales. Ha sido revisor de trabajos enviados a numerosas revistas
internacionales y actualmente es miembro del comité editorial del Journal of Virology, una de las
revistas especializadas más importantes del área. Ha sido profesor invitado en el Instituto
Nacional de Salud de Japón, en el Instituto Tecnológico de California y en el Institute de la
Recherche Agronomique (INRA) de Francia. Entre sus distinciones, recibió el premio de la
Academia Mexicana de Ciencias en el área de Ciencias Naturales en 1993, el premio Carlos J.
Finlay otorgado por la UNESCO en el 2001, y también recibió la medalla Sor Juana Inés de la
Cruz otorgada por la UNAM en el 2004. Actualmente tiene el nombramiento de Investigador
Internacional del Instituto Médico Howard Hughes, desde el 2000 hasta el 2010, dentro del
Programa de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias.
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