El lúpulo contenido en la cerveza, su efecto antioxidante en un

El lúpulo contenido
en la cerveza, su
efecto antioxidante en
un grupo controlado
de población
Marzo 2007
Prof. Jesús Román Martínez Álvarez
Dra. Victoria Valls Bellés
Prof. Dr. Antonio Villarino Marín
Sociedad Española de Dietética
y Ciencias de la Alimentación (SEDCA).
Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.
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El lúpulo contenido en la cerveza,
su efecto antioxidante en un
grupo controlado de población
Este trabajo ha sido realizado por el siguiente grupo de investigación:
Prof. Jesús Román Martínez Álvarez
Prof. Dr. Antonio Villarino Marín
Sociedad Española de Dietética y Ciencias de la Alimentación
Dra. Victoria Valls Bellés
Dra. Pilar Codoñer Franch
Ana Belén López Jaén
Simón Yao Lee
Facultad de Medicina. Universidad de Valencia
Mª Carmen Ambrós Marigómez
Hospital de León
Agradecimientos:
Los autores manifiestan su agradecimiento a las personas que con su colaboración hicieron
posible la realización de este Estudio: al Dr. Rafael Pérez Vicente, jefe del servicio de análisis
clínicos del Hospital de León, y a las Comunidades Cistercienses de los monasterios de San
Miguel de las Dueñas, de Santa María de Carrizo, en Carrizo de la Ribera, y de Santa María
la Real en Gradefes (León).
SUMARIO
1
INTRODUCCIÓN: CERVEZA, LÚPULO,
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y SALUD ..........................................................6
1.1. Cerveza con alcohol y cerveza sin alcohol .............................................8
1.2. Lúpulo ...........................................................................................9
2
RADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO ..................................................16
2.1. El oxígeno y el daño oxidativo .............................................................16
2.2. Los radicales libres .............................................................................17
2.3. Origen de los radicales libres................................................................20
2.4. Daño oxidativo a las biomoléculas ........................................................22
2.5. Procesos fisiopatológicos relacionados con los radicales libres..................23
2.6. Sistemas de defensa ante el estrés oxidativo..........................................33
2.7. Alimentación y estrés oxidativo ............................................................51
3
OBJETIVOS DEL ESTUDIO .........................................................................59
4
MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................60
4.1. Material.............................................................................................60
4.2. Métodos ............................................................................................61
4.3. Diseño experimental............................................................................68
5
RESULTADOS...........................................................................................70
5.1. Valoración nutricional y energética .......................................................70
5.2. Suplementación dietética: cerveza sin alcohol ........................................72
5.3. Suplementación dietética: lúpulo..........................................................80
5.4. Estudio comparativo entre la suplementación
con cerveza sin alcohol y lúpulo...........................................................88
6
DISCUSIÓN.............................................................................................90
6.1. Metabolismo oxidativo.........................................................................90
6.2. Metabolismo lipídico ...........................................................................93
6.3. Parámetros marcadores de inflamación ..................................................95
6.4. Capacidad antioxidante comparada de
la cerveza sin alcohol y del lúpulo ........................................................97
7
CONCLUSIONES .............................................................................................99
• BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................101
u
n
o
INTRODUCCIÓN: CERVEZA, LÚPULO,
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y SALUD
La cerveza es una bebida fermentada tradicional que está presente en la dieta
desde hace miles de años. Es una bebida de baja graduación alcohólica y se produce industrialmente a partir de ingredientes que apenas han cambiado en el
transcurso de los siglos: agua, malta y lúpulo. Su posible relación con la salud no
ha sido estudiada hasta tiempos muy recientes y sus efectos se achacan, sobre
todo, a la presencia en la misma de sustancias antioxidantes como los polifenoles
y las melanoidinas, además de otras sustancias nutritivas (folatos, carbohidratos,
magnesio, etc.) y no nutritivas (fibra).
Dentro de las bebidas que contienen polifenoles destaca la cerveza, cuya actividad antioxidante global oscila entre unos valores mínimos y máximos comprendidos en el intervalo 2 - 56 mg según la capacidad antioxidante equivalente de
vitamina C (CEAC). Estos datos indican que se trata de una bebida con una capacidad antioxidante global significativa, ya que posee valores similares a otras bebidas alcohólicas, como el vino, y no alcohólicas, como el mosto. De los estudios
realizados se desprende que el tipo de cerveza no influye en el poder antioxidante, ya que cervezas negras, rubias y sin alcohol presentan valores similares
(González San José et al., 2001).
Los compuestos fenólicos protegen de la oxidación a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel clave en la prevención de la aterosclerosis.
También pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregación plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Este efecto se ha demostrado mediante experimentos con animales in vitro e in vivo. En muchos casos se inhibe la AMP
cíclico fosfodiesterasa y como resultado se incrementan los niveles de cAMP.
Asimismo, se reduce el nivel de calcio, se inhibe el “factor de activación plaquetario”, se promueve la captación de los radicales libres y se reduce la liberación de enzimas que favorecen la agregación plaquetaria (Meltzer y Malterud, 1997; Craig, 1996).
Los compuestos fenólicos también son considerados como reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la modulación del
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u
metabolismo del ácido araquidónico, reduciendo los niveles de tromboxano. También
modulan la actividad enzimática de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2,
hialuronidasa, e inhiben la acción de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa
(que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los
radicales superóxido), entre otras. Dichos efectos les otorgan un amplio potencial
para su utilización con fines médicos (Craig, 1996). Son numerosos los estudios que
han mostrado que este tipo de compuestos poseen propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando radicales libres como hidroxilo, supéroxido y alcoxi radical (Sichel et al., 1991).
Igualmente se han descrito efectos antivíricos, antibacterianos y antifúngicos. Se
ha observado in vitro el potencial de la epicatequina como agente antivírico y las
antocianidinas pueden inhibir las enzimas que intervienen en la replicación del rhinovirus y del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hocman, 1989).
Los efectos beneficiosos de la ingesta de un elevado número de alimentos ricos
en compuestos fenólicos como cerveza, fresas, espinacas, vino tinto, etc. se pueden
evaluar a corto plazo ya que aumentan la capacidad antioxidante en suero (Cao et
al., 1998; Velioglu et al., 1998; Kähkönen et al., 1999), lo que avala el creciente
interés por el consumo de alimentos ricos en estos compuestos (Hertog et al.,
1995).
Desde un punto de vista bioquímico, los compuestos fenólicos también tienen
un especial interés debido a su potencial anticarcinógeno, bien estimulando el bombeo de ciertos agentes cancerígenos hacia el exterior de las células o bien mediante la inducción de enzimas de detoxificación (Mazza, 2000). En la bibliografía científica son múltiples las referencias que demuestran que los flavonoides tienen efectos citostáticos en varios sistemas in vitro y que son capaces de regular ciertos procesos importantes en el desarrollo del cáncer. Los flavonoides tienen actividad antipromotora, efecto antiinvasivo, e inhiben enzimas como la tirosina proteinkinasa,
la ornitin decarboxilasa ATP-dependiente y la DNA topoisomerasa. Numerosos tra-
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u
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o
bajos de investigación demuestran que los isoflavonoides de la soja, especialmente la genisteína, pueden tener efecto protector frente a diferentes tipos de cáncer
(mama, colon y piel). Este hecho, se ha relacionado con el efecto estrogénico de
los isoflavonoides, mediante diferentes mecanismos bioquímicos (Barnes, 1995;
Herman et al.,1995).
En lo que respecta al lúpulo, existen numerosos estudios sobre su papel en diferentes patologías. Así, según los resultados obtenidos por Milligan (Milligan et al.,
2002), se encuentra que la humulona del lúpulo inhibe la resorción ósea, lo que
produce una elevada protección frente a la osteoporosis, y posee una pronunciada
actividad anti-inflamatoria. La humulona inhibe además la angiogénesis, es decir,
reduce la formación de nuevos vasos sanguíneos, proceso clave en la proliferación
de tumores, así como en el crecimiento descontrolado de células endoteliales, un
marcador de riesgo cardiovascular.
1.1. CERVEZA CON ALCOHOL Y CERVEZA SIN ALCOHOL
La cerveza es una bebida de baja graduación alcohólica resultante de fermentar
el mosto procedente de la malta (usualmente de cebada, aunque pueden participar minoritariamente otros cereales como el arroz, el trigo y el maíz), sólo o mezclado con otros productos amiláceos transformables en azúcares, por digestión
enzimática y su cocción. El mosto de la malta se aromatiza con flores de lúpulo.
En conclusión, los constituyentes de la cerveza y su valor nutritivo y no nutritivo provienen de sus tres principales ingredientes: malta, lúpulo y agua. En el
caso de la cerveza sin alcohol, por diferentes procedimientos tecnológicos se elimina –habitualmente a partir de cerveza completa- el contenido alcohólico.
La cerveza sin alcohol es un producto relativamente nuevo en el mercado que
satisface las necesidades adicionales de determinados consumidores que desea-
8
u
ban disfrutar de una bebida refrescante como es la cerveza sin contenido alcohólico. La legislación española admite esta denominación siempre que el contenido
alcohólico sea inferior al 1% en volumen, aunque en el mercado existen actualmente cervezas de tipo Cero.
1.1.1. CONSUMO DE CERVEZA SIN ALCOHOL EN ESPAÑA
El crecimiento de la cerveza sin alcohol en nuestro país aumenta progresivamente cada año y representó en 2006 más del 10% del consumo total de cerveza. España se consolida por tanto como el primer consumidor del mundo de cerveza sin alcohol, a gran distancia de Francia, segundo país del mundo en consumo de cerveza sin alcohol.
1.2. LÚPULO
El lúpulo (Humulus lupulus L.) se emplea para aromatizar la cerveza y obtener
el característico sabor amargo de la bebida. Pertenece a la familia de las cannabáceas, plantas herbáceas carentes de látex, de flores menudas.
Planta medicinal silvestre conocida ya en la Antigüedad, unos 6.000 años a.
C., el lúpulo se utiliza desde el siglo IX para la obtención de “lupulino”, empleado en la fabricación de cerveza.
El lúpulo, además de contribuir a la estabilidad de la espuma, aromatiza y
tiene propiedades antisépticas. Las cervezas lupuladas son más resistentes al
deterioro microbiológico.
En el Diccionario de la Lengua Española de la Real Academia se define esta
materia prima de la cerveza como una planta trepadora, muy común en varias partes de España, de la familia de las cannabáceas, con tallos sarmentosos de tres a
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o
cinco metros de largo, hojas parecidas a las de la vid, flores masculinas en racimo, y las femeninas en cabezuela, y fruto en forma de piña globosa cuyas escamas cubren dos aquenios rodeados de lupulino. Los frutos, desecados, se emplean para aromatizar y proporcionar el sabor amargo a la cerveza.
La planta del lúpulo tiene una serie de brotes, a partir de la cepa, que dan lugar
a tallos trepadores o sarmientos, sobre los cuales, en cada nudo, se desarrollan dos
hojas opuestas, pecioladas y con tres a siete lóbulos, de una forma que recuerda a
los pámpanos de la vid. La vida útil de la planta es de diez a quince años, al cabo
de los cuales es conveniente arrancarla y sustituirla por otra nueva.
El lúpulo es una planta dioica, por lo que las flores masculinas y femeninas se
producen en distintos pies. Generalmente, los productores de lúpulo sólo cultivan
las plantas hembras. Las flores femeninas se agrupan en conos o piñas, formando
verdaderos racimos. En la base de las escamas que forman los conos se encuentra
la lupulina, una sustancia amarillenta y amarga que contiene resinas, aceites esenciales y taninos utilizados en la industria cervecera. La lupulina se emplea también
para usos médicos e industriales, aunque su función principal es aromatizar la cerveza. Este producto, de aspecto y tacto de polvo, algo grasiento, tiene un aroma
Humulus lupulus, reproducción
de una lámina del Herborarium
Blackwellianum de 1739
10
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característico, más o menos intenso y fino, al igual que los perfumes que combinan
intensidad y finura de aroma.
El lúpulo florece en verano, y los conos se cogen entre finales de agosto y primeros de septiembre.
1.2.1. USOS TRADICIONALES
Tradicionalmente, el lúpulo se ha usado como hipnótico, sedante y diurético (FontQuer, 1983). En la Inglaterra medieval, se rellenaban las almohadas con conos de la
planta como remedio contra el insomnio. Santa Hildegarda, le atribuía virtudes contra la “bilis negra” o melancolía. Sin embargo, en la medicina antigua se ignoraba
su utilidad (no lo citan ni Galeno ni Dioscórides) aunque Plinio se refiere brevemente a ella considerándola una planta alimenticia (cuyo nombre era lupus). En
algunas comarcas españolas, los vástagos tiernos se han consumido de forma similar a la de los espárragos.
En 1516 el duque bávaro Guillermo IV aprobó la famosa "Reinheitsgebot" o "Ley
de pureza" de la cerveza, que limitaba los ingredientes permitidos en su elaboración
a tres: cebada (o trigo), lúpulo y agua. Esta ley continua aún vigente, con escasas
modificaciones, en toda Alemania; lo que nos da una idea de la importancia del
lúpulo en la elaboración de la cerveza desde hace siglos.
1.2.2. USO INDUSTRIAL DEL LÚPULO
Inicialmente, se utilizó el lúpulo silvestre para la cervecería, pero su baja calidad y
el volumen de esta industria conllevaron el comienzo del cultivo en España. A estos
efectos, el primer intento serio se realizó en La Coruña a principios del siglo XX. Sin
embargo, durante la posguerra española, y coincidiendo con la II Guerra Mundial,
las fábricas de cerveza tuvieron grandes problemas de abastecimiento de lúpulo,
11
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o
debido a la práctica paralización de las importaciones. En consecuencia, el gobierno español promulgó el 23 de mayo de 1945 un decreto por el que se prevé el
fomento del cultivo a través de una concesión administrativa que recae en la
Sociedad Anónima Española de Fomento del Lúpulo, constituida por casi todas las
fábricas de cerveza que existían en ese momento en el país.
1.2.3. EL LÚPULO EN LA PRODUCCIÓN CERVECERA
En el lúpulo se han identificado más de 1.000 sustancias entre las que se encuentran múltiples derivados isoméricos (Verzele y Keukeleire, 1991). Todas ellas aportan al lúpulo sus peculiares características que lo convierten en insustituible para
la fabricación de la cerveza. Son las resinas, almacenadas en glándulas de lupulina
presentes en varias partes de la planta, pero fundamentalmente en los frutos producidos a partir de las flores femeninas. Estas resinas se clasifican en función de su
diferente solubilidad y son una mezcla de compuestos químicos análogos que son
los precursores de los alfa y beta ácidos, los cuales al cocer con el mosto se isomerizan y se transforman en sustancias amargas.
El contenido de estos alfa y beta ácidos (medido como porcentaje en peso) es
una característica varietal, si bien pueden verse influidos de una manera importante por la climatología y otros factores. Otros constituyentes importantes son los
aceites esenciales (humuleno, farneseno, mirceno, etc.) y los taninos. Los primeros
confieren al lúpulo su aroma característico. Tradicionalmente se ha hablado de
variedades aromáticas y de variedades amargas, precisamente en función del nivel
de alfa ácidos y de aceites esenciales.
1.2.4. COMPONENTES DEL LÚPULO
Las flores de la planta del lúpulo (también llamadas conos o piñas) contienen en
su interior unas glándulas de color amarillo. Estas glándulas están llenas de una
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u
resina llamada lupulina, que es el principio activo que los cerveceros buscan en el
lúpulo. La lupulina aporta:
1.2.4.1. COMPONENTES AMARGOS
Los ácidos amargos representan entre el 5% y el 20% aproximadamente del peso
del lúpulo maduro según su variedad (Verzele y Keukeleire, 1991). Estos ácidos se
clasifican como alfa ácidos y beta ácidos y son derivados del floroglucinol di o triprenilados. Los alfa ácidos se extraen tras la adición de acetato de plomo al
extracto crudo, mientras que los beta ácidos permanecen en solución. La calidad
del lúpulo viene marcada sobre todo por los alfa ácidos, especialmente por la
humulona (35-70% del total de alfa ácidos), la cohumulona (del 20-65%) y la
adhumulona (del 10-15%). Los alfa ácidos están presentes en la cerveza en concentraciones de hasta los 4 mg/ml contribuyendo en la misma a la estabilidad de
la espuma y aportando sus características antibacterianas y, por lo tanto, de mejora de la conservación.
El amargor del lúpulo proporciona el contrapunto adecuado al dulzor de la
malta y este sabor amargo se extrae durante la cocción. En ella, los alfa ácidos
insolubles se isomerizan en ácidos iso-alfa más solubles que, en la cerveza representan más del 80% de los componentes del lúpulo presentes en la misma.
Se han conseguido aislar en el laboratorio cinco alfa ácidos que están presentes en el lúpulo de forma natural, en diferentes proporciones que varían como
hemos dicho según la variedad:
■ humulona
■ cohumulona
■ adhumulona
■ prehumulona
■ posthumulona
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Además de alfa ácidos, el lúpulo también contiene beta ácidos, los cuales también añaden amargor a la cerveza cuando se oxidan. Sin embargo, los ácidos beta
oxidados no son tan amargos como los ácidos alfa isomerizados y contribuyen
mucho menos al amargor final de la cerveza.
Los alfa ácidos son muy susceptibles a la oxidación (sobre todo a temperaturas
elevadas) y cuando esto ocurre ya no pueden ser isomerizados en ácidos iso-alfa,
lo cual merma significativamente su capacidad de amargor. Esta es una característica que hace que su almacenamiento y conservación sean muy delicados. Los cerveceros deben tener esto muy en cuenta y, por ello, tratan de conseguir lúpulos lo
más frescos posibles y de guardarlos en frío y en condiciones anaeróbicas.
1.2.4.2. COMPONENTES AROMÁTICOS
Los investigadores no han sido capaces, hasta ahora, de reproducir la complejidad
de aromas del lúpulo añadiendo componentes químicos sintéticos. Ni tampoco utilizando otro tipo de plantas o especias. Existe un consenso generalizado sobre que
son las sinergias que se producen entre los distintos componentes del lúpulo las
que le confieren su inimitable capacidad aromatizante. Mediante técnicas cromatográficas se han conseguido identificar más de 250 aceites esenciales y todavía existen otros muchos aún desconocidos.
1.2.4.3. ACEITES ESENCIALES
Son extremadamente volátiles y son una razón más para conservar el lúpulo en
algún medio anaeróbico, como en recipientes al vacío o en atmósferas modificadas
de CO2 o nitrógeno. Tampoco soportan una cocción dilatada. Es por ello que los
lúpulos aromáticos se suelen añadir en los últimos minutos de cocción, mientras
que los lúpulos amargos se añaden antes para facilitar la isomerización de los áci-
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u
dos alfa. El aceite esencial de lúpulo contiene alkanos, monoterpenos y sesquiterpenos, habiéndose detectado (Eri et al., 2000) doscientas ochenta y seis distintas
sustancias en su aceite, más de cien de las cuales ni siquiera han podido ser identificadas actualmente. Como constituyentes volátiles, se han identificado claramente al monoterpeno myrceno y a los sesquiterpenos beta-cariofileno y al humuleno,
quienes representan entre el 57-82% del aceite esencial. Este aceite no parece ejercer un papel fitoestrogénico.
1.2.4.4. FLAVONOIDES PRENILADOS
Son una mezcla de chalconas, de las que hasta la fecha se han aislado treinta especies, secretadas por las glándulas lupulínicas junto con los ácidos amargos y los
aceites volátiles (Milligan et al., 1999). Tienen efecto fitoestrogénico.
La chalcona xantohumol es el más abundante flavonoide prenilado en el producto en fresco y en el lúpulo comercial, alcanzando concentraciones de 0.01-0.5%
(Stevens et al., 1999). El estrógeno vegetal más potente hoy conocido como 8-prenilnaringenina corresponde con el 1:1 racemato (+)-8-prenilnaringenina o hopeína
(según la terminología de Keukeleire et al., 2001).
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RADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO
2.1. EL OXÍGENO
Y EL
DAÑO OXIDATIVO
El conocimiento de los efectos biológicos de las especies oxigénicas reactivas corre
paralelo al estudio del metabolismo energético de los seres vivos, proceso en el que
la presencia de oxígeno es imprescindible. En efecto, hoy sabemos que el oxígeno
(uno de los elementos gaseosos más abundantes de la naturaleza) se presenta en
forma de gas diatómico. El oxígeno molecular, a pesar de contener un número par
de electrones, se presenta como una molécula paramagnética donde dos de sus electrones están localizados en orbitales diferentes y girando en un mismo sentido con
espines paralelos. Esto tiene un gran interés en relación con su mecanismo de
acción molecular y, especialmente, con su papel oxidativo.
Tal vez una de las primeras referencias sobre la toxicidad del oxígeno se la debemos a Lavoisier, quien en 1785 ya sugirió que el exceso de la administración de oxígeno podría ser tan peligroso como su defecto. Más tarde, en el siglo XVIII, se descubrieron otros productos derivados del oxígeno como el H2O2 y el ozono
(Bannister, 1986).
2.1.1. EVOLUCIÓN Y OXIDACIÓN
La importancia evolutiva del oxígeno fue señalada por Irvin Fridovich en 1978, descubridor de la SOD, quien atribuía a la presencia de oxígeno en la tierra la desaparición de especies orgánicas incapaces de metabolizar y defenderse contra las acciones de aquella molécula y, más concretamente, contra la acción de las especies oxigénicas producidas mediante su oxidación monovalente (Fridovich, 1974). De este
modo, sólo aquellos organismos capaces de desarrollar mecanismos enzimáticos
reactivos derivados fueron adaptándose paulatinamente a la progresiva oxigenación
de la atmósfera. De cualquier forma, independientemente de las teorías evolutivas
y sus mecanismos de selección, es evidente que el oxígeno fue seleccionado por la
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d
naturaleza para actuar como aceptor terminal de las oxidaciones celulares, desempeñando así, una función clave en su reacción con la citocromo oxidasa, representando el último eslabón de la cadena de transporte electrónico. Gracias a este mecanismo se produce más del 90% del oxígeno consumido por las células de los animales superiores.
Un átomo de oxígeno individual puede adquirir dos electrones para completar los
ocho y convertirse en un ión óxido. También pueden unirse dos átomos de oxígeno
para compartir un par de electrones cada uno, formándose así la molécula de oxígeno diatómico. Finalmente, si una molécula de oxígeno adquiere un electrón extra
en el curso de una reacción, se transforma en otra especie paramagnética y mono.
rradical cargada negativamente que se conoce como anión superóxido (O -). Éste
2
es uno de los radicales libres o especies reactivas más importantes en gran parte
responsable de la toxicidad del oxígeno.
Gracias a los experimentos de Fridovich, el radical superóxido alcanza un enorme
interés en el campo de la bioquímica (Fridovich y Handler, 1961) al demostrarse su
producción por enzimas celulares tales como la xantina oxidasa y, adicionalmente,
al descubrirse la existencia de la enzima superóxido dismutasa (SOD), capaz de
transformar el ión superóxido en un producto de menor reactividad como es el H2O2,
que a su vez es reducido a agua y oxígeno por la acción de otras enzimas.
A partir de ese momento, estas especies (y otras que se irían descubriendo posteriormente) irían cobrando un papel protagonista en la explicación de los mecanismos de acción citotóxica del oxígeno mediante el estrés oxidativo.
2.2. LOS RADICALES LIBRES
Son especies moleculares activadas, dotadas de un electrón desapareado en un nivel
energético superior y, por lo tanto, dotadas de propiedades paramagnéticas, lo que
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s
les confiere una alta e indiscriminada reactividad. Actualmente los radicales libres
(RL) también son conocidos como especies reactivas oxigénicas, EROs o ROS, así
como especies reactivas del nitrógeno ERN o RNS. Cuando se combinan radicales
libres procedentes del oxígeno y del nitrógeno se pueden convertir en otras especies reactivas no radicales también llamados ROM (Reactives Oxygen Metabolites) o
metabolitos reactivos del oxígeno o AO (Active Oxygen). Las especies oxigénicas
reactivas más destacadas se encuentran reflejadas en la Tabla 1:
Tabla 1. Resumen de las Especies Reactivas
Radicales
No Radicales
.
ROS
O
EROs
Superóxido (O2- )
.
Hidroxilo ( OH)
Peroxilo (RO2)
.
Alkoxilo (RO )
Hidroperóxilo (HO2)
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Ácido hipocloroso (HOCI)
Ozono (O3)
Oxígeno singlete (1O3)
RNS
O
ERN
Óxido nítrico (NO)
Dióxido nítrico (NO2)
Ácido nitroso (HNO2)
Tetróxido de dinitrógeno (N2O4)
Trióxido de dinitrógeno (N2O3)
Peroxinitrito (ONOO-)
Ácido peroxinitroso (ONOOH)
Catión nitronio (NO2+)
Peroxinitritos alkilos (ROONO)
Tanto ROS como RNS son términos genéricos (Halliwell, 1996) que incluyen radicales y algunos no radicales que actuan como agentes oxidantes del oxígeno y del
nitrógeno, pudiendo convertirse fácilmente en radicales. Hay que añadir que algunas de estas sustancias pueden clasificarse en ambas categorías y que, además,
existen las denominadas especies reactivas del cloro. El término “reactivo” tal vez
no sea un término del todo apropiado, ya que hay radicales y no radicales como
H2O2, que pueden reaccionar con otras especies y formar otras mucho más reacti.
vas como el OH que presenta una alta reactividad.
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2.2.1. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
Son muchas las especies oxígenas que actúan como oxidantes biológicos. La
capacidad de cada radical (RL) o especie oxigénica reactiva viene determinada,
desde el punto de vista químico, por cuatro características básicas:
■ Reactividad
■ Especificidad
■ Selectividad
■ Difusibilidad
.
El O2 - es la sustancia reductora más potente. Tras la simple adición de un
.
protón, da lugar a la formación de HO2 - convirtiéndose en un agente oxidante
.
muy activo, selectivo y específico. El O2 - no es, sin embargo, especialmente
reactivo con lípidos, glúcidos o ácidos nucleicos y exhibe una reactividad limi.
tada con determinadas proteínas. Sin embargo, el O - sí reacciona con proteí2
nas que contienen metales en su grupo prostético.
.
El OH , sin embargo, reacciona con cualquier molécula que tenga cerca, sin
especificidad alguna. El peligro de su efecto radica, por lo tanto, en la importancia funcional del compartimento celular en el que se origina, así como en la
molécula a la que ataca. De este modo, si afectase al ADN podría producir graves efectos. Por el contrario, si la producción del radical tiene lugar en un entorno como el plasma y la molécula dañada es un enzima que se encuentra presente en gran cantidad, el daño biológico real será prácticamente imperceptible. Los
.
.
tres componentes con mayor capacidad de difusión son O - < H O < OH , capa2
2 2
ces de reaccionar con moléculas que se encuentran alejadas de su lugar de origen, incluso contando con capacidad de atravesar las membranas celulares
(Figura 1).
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s
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Figura 1. Reactividad de especies oxigénicas
.
O2 - + H+ + e.
.
O2 - + HO2
.
HO2 + HO2 + H+
.
.
O2 - + O2 - + H+
.
O2 - + H2O2
HO2
H2O2 + O2
H2O2 + O2
H2O2 + O2
.
OH + OH- + O2
La producción de los radicales libres tiene que ser controlada continuamente y
mantenida a muy bajas concentraciones por parte de los distintos mecanismos disponibles por las células obligadas a desarrollarse en ambientes aeróbicos. Por esta
razón, las especies oxigénicas se producen en ambientes suficientemente circunscritos para impedir su difusión o, en su defecto, controlados por la acción de enzimas defensivas sintetizadas por las células aeróbicas encargadas de su rápida conversión en especies más estables o inofensivas.
2.3. ORIGEN
DE LOS
RADICALES LIBRES
Se sabe que los radicales libres se producen de forma natural como intermediarios
o productos de numerosas reacciones oxidativas de las células, así como a través de
diversos procesos físico-químicos o de biotransformación (Pryor, 1976). También
existen fuentes externas. Es decir, se ha de considerar el origen tanto endógeno
como exógeno de las especies reactivas oxigénicas y especies reactivas del nitrógeno. Las EROs pueden producirse a través de la exposición a oxidantes medioambientales, tóxicos y metales pesados, que pueden perturbar el equilibrio entre las
reacciones de reducción celular y las de oxidación, alterando la normalidad de las
funciones biológicas.
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2.3.1. FUENTES ENDÓGENAS
Las principales fuentes endógenas de radicales libres en la célula son:
■ La cadena de transporte electrónico.
■ El transporte electrónico microsomal (reacciones de hidroxilación).
■ Las células fagocitarias.
■ La autooxidación de compuestos de carbono reducido.
■ La activación calatalítica de diversos enzimas del metabolismo intermediario:
hipoxantina, xantina oxidasa, aldehído oxidasa, monoamina oxidasa, ciclooxigenasa y lipooxigenasa (Beckman y Ames, 1998; Lindsay y Astley, 2002).
2.3.2. FUENTES EXÓGENAS
Como se ha citado con anterioridad, los EROs también pueden tener un origen exógeno. Estas fuentes exógenas pueden ser:
■ Ambientales
Radiaciones electromagnéticas, luz solar, ozono y tabaco. Los radicales libres se
pueden producir en respuesta a radiaciones electromagnéticas, como los rayos
gamma, que pueden escindir el agua y producir radicales hidroxilo (Hallywell,
1996; Betteridge, 2000). Los óxidos de nitrógeno presentes en el humo de los
cigarrillos, causan la oxidación de las macromoléculas así como la reducción de
21
o
s
d
o
s
los niveles orgánicos de antioxidantes, lo que contribuye a la aparición de diferentes patologías en el fumador como ciertos tipos de cáncer, especialmente el
de pulmón (Ames et al., 1990; Halliwell, 1994; Betteridge, 2000; Muñiz et al.,
2001).
■ Farmacológicas
Xenobióticos, drogas, etc. (Valls et al., 1994 ; Valls et al., 2004). Éste es el caso
de las antraciclinas, que interaccionan con el complejo I de la cadena de transporte electrónico e inducen la formación de radicales libres.
■ Nutricionales
Contaminantes, aditivos, etc. Las sales de hierro y de cobre promueven la formación de radicales libres generando H2O2 (reacciones de Fenton). Cuando un
individuo absorbe una cantidad significativa de hierro de la dieta debido a un
defecto genético (especialmente si se trata de hierro hemo), esto se convierte
en un factor de riesgo adicional para contraer enfermedades cardiovasculares así
como ciertos tipos de cáncer en hombres sanos (Ames, 1990).
2.4. DAÑO OXIDATIVO
A LAS
BIOMOLÉCULAS
Aunque las EROs se han considerado perjudiciales para la célula, pueden sin embargo haber jugado un papel importante en el origen de la vida y en la evolución biológica. En los últimos años, se ha reconocido el papel de las EROs en la modulación
de la expresión génica. De hecho, no es sencillo catalogar a las EROs como moléculas definitivamente beneficiosas o dañinas, dependiendo su efecto del proceso
22
d
celular que se analice. Por ejemplo, la muerte celular por necrosis, seguida de isquemia-reperfusión, daña a los tejidos; en este proceso, se cataloga a las EROs como
perjudiciales, mientras que en la muerte celular por apoptosis, este punto de vista
puede variar dependiendo del sistema celular y del proceso que se esté estudiando.
Por otro lado, el papel de las EROs en los procesos de inflamación también puede
ser ambivalente, habiéndose calificado como beneficiosos en el aspecto proinflamatorio, ya que proporcionan una mejora en la respuesta inmune tras la infección, pero
en otros trastornos, como la artritis reumatoide, la respuesta inflamatoria inapropiada generada por ellos es claramente perjudicial y debe ser restringida.
En conclusión, las especies reactivas del oxígeno juegan un papel importante en
la modulación de la expresión genética y de la función celular, pudiendo utilizar
estos cambios como biomarcadores del estrés oxidativo. Las EROs pueden causar oxidación a biomoléculas como los lípidos poliinsaturados, las moléculas de colesterol,
los glúcidos, proteínas y ácidos nucleicos que pueden verse afectadas in vivo por los
radicales libres.
2.5. PROCESOS FISIOPATOLÓGICOS
RELACIONADOS CON LOS RADICALES LIBRES
En la actualidad, son muchos los procesos relacionados con la producción de radicales libres, tales como mutagénesis, transformación celular, cáncer, diabetes,
aterosclerosis, infarto de miocardio, procesos de isquemia/reperfusión, enfermedad del neonato (retinopatía neonatal), enfermedades inflamatorias (artritis reumatoide, lupus), desórdenes en el sistema nervioso central (enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Alzheimer), envejecimiento, etc. En numerosas patologías, se han observado niveles reducidos de las enzimas antioxidantes, o bien de
antioxidantes totales.
23
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d
o
s
2.5.1. ESTRÉS OXIDATIVO Y PATOLOGÍA CARDIOVASCULAR
Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de morbimortalidad en los países desarrollados. En el 2020, según datos de la Organización
Mundial de la Salud (OMS), será la primera causa de mortalidad en el mundo. La
patología cardiovascular es un proceso multifactorial donde están implicados la
obesidad, diabetes, hipertensión, genética, dislipemia, radicales libres, estilo de
vida (nutrición, tabaquismo, sedentarismo, etc.), etc., siendo la hiperlipemia uno
de los mayores riesgos en los procesos ateroscleróticos. La aterosclerosis es un
proceso muy complejo en el que están implicadas las LDL y la proliferación celular en el endotelio (Celermajer et al., 1992).
2.5.1.1. HIPÓTESIS
DE LA
ATEROSCLEROSIS
Existen diferentes hipótesis para explicar los procesos asociados al desarrollo de
la aterosclerosis:
a) Respuesta al daño.
Esta hipótesis se basa en la propuesta de que el paso inicial sería la disfunción endotelial produciendo un número de respuestas compensatorias que alteran las propiedades homeostáticas vasculares normales. Sin embargo, más
recientemente se ha visto que una pared celular endotelial intacta puede desarrollar lesiones ateroscleróticas.
b) Respuesta a la retención de LDL.
Se basa en un aumento en la retención de la LDL dentro de la pared arterial y
su asociación con los proteoglicanos. Junto a la unión a proteoglicanos parece jugar un papel importante las enzimas lipolíticas y liposomales en la matriz extracelular.
24
d
c) Modificación oxidativa.
Se basa en que la LDL atrapada en el espacio subendotelial, es susceptible a la
modificación oxidativa. La LDL oxidada estimula la quimiotasis monocítica y favorece la formación de células espumosas a partir de los macrófagos. Una vez
formada, la LDL oxidada también provoca la disfunción endotelial y el daño celular. Las células espumosas tienden a la necrosis debido a la estimulación de
LDL oxidada originando fibrosis posterior (placa fibrosa), y favoreciendo la trombosis a consecuencia de la agregación plaquetaria y del incremento de citoquinas proinflamatorias (Steinberg et al., 1989) (Figura 2 y 3).
Figura 2. Oxidación de las LDL
LDL nativas
Monocitos circulantes
Células
endoteliales
Macrófago
LDL modificadas
mediante oxidación
Célula espumosa
Steinberg et al. N Engl J Med, 1989;320:915-24
En la actualidad, existen muchas evidencias que indican que en el proceso
de iniciación de la aterosclerosis están implicados los radicales libres, la peroxidación lipídica y la modificación oxidativa de las LDL (Spiteller, 2005; Zmijewski et al., 2005), dando mayor validez a la última hipótesis descrita.
25
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s
d
o
s
2.5.1.2. OXIDACIÓN
DE LAS
LDL
En las lesiones ateroscleróticas se ha observado la existencia de diferentes modificaciones oxidativas que tienen lugar sobre la lipoproteína, además de la producción
de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno por las células vasculares. Por ello,
la aterosclerosis se ha representado como un estado de elevado estrés oxidativo
caracterizado por la oxidación lipídica y proteica en la pared vascular. Así pues,
recientes estudios han establecido la presencia de lípidos oxidados (Carpenter et al.,
1994; Heinecke, 2006) en dichas lesiones, como consecuencia de la oxidación lipídica, obteniéndose productos como peróxidos, hidroperóxidos, epóxidos, etc. Del
mismo modo, cuando las especies reactivas actúan sobre las moléculas de colesterol producen hidroperóxidos de colesterol y oxisteroles. Además, existen evidencias
de la oxidación proteica en tales lesiones (Fu et al., 1998; Heinecke, 1999;
Heinecke, 2002).
Se ha visto que la aterosclerosis y sus consecuencias anatomopatológicas vasculares, se acentúan con el estrés oxidativo. En los supuestos en que estos fenómenos de oxidación acontecen sobre las lipoproteínas plasmáticas (LDL), éstas
aumentan significativamente su poder aterogénico, provocando que la LDL oxidada
sea responsable de una serie de efectos como los que se describen a continuación:
• Es captada con mayor facilidad por los macrófagos, lo que produce el enriquecimiento de éstos en ésteres de colesterol y la formación de células espumosas.
• Es quimiotáctica para los monocitos y los T-linfocitos.
• Inhibe la motilidad de los macrófagos en la pared arterial.
• Altera la expresión génica, induciendo la producción de citokinas.
26
d
• Induce la proliferación de células musculares lisas.
• Es inmunogénica y puede provocar la formación de autoanticuerpos.
• Es más susceptible a la agregación, lo que estimula la captación por parte de
los macrófagos.
• Puede alterar de forma perjudicial los procesos de coagulación, como es el caso
de la alteración de la agregación plaquetaria.
2.5.1.3. PROGRESIÓN
DE LA
ATEROSCLEROSIS
La progresión de la aterosclerosis se puede caracterizar en 6 tipos de lesiones, que
reflejan las fases de inicio, desarrollo y maduración de la enfermedad, que culminaría en la ruptura de la placa de ateroma y la formación de trombos. Los diferentes tipos son:
• Tipo I: Zona propensa a lesión, engrosamiento adaptativo de la intima.
• Tipo II: Acumulación de lípidos en el macrófago formándose unas áreas nodulares de deposición de lípidos y dan lugar a células espumosas.
• Tipo III: La formación continuada de células espumosas y necrosis de macrófagos produce este tipo de lesiones que contienen pequeños depósitos de lípidos extracelulares. Esto representaría el núcleo de la lesión aterosclerótica.
• Tipo IV: Se caracteriza por una separación tisular fina del núcleo de lípidos del
lumen arterial.
27
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d
o
s
• Tipo V: Las lesiones muestran tejido fibroso, apareciendo un núcleo cubierto
por cápsula fibrosa.
• Tipo VI: Se caracteriza por áreas fibrosas calcificadas con visible fisura o rotura de la placa.
Finalmente, se produciría la formación de un trombo, que no suele ocluir completamente la arteria, produciéndose una lesión más fibrosa y estenosante. Las
lesiones, posteriormente, siguen evolucionando con las consiguientes consecuencias cardiovasculares (Figura 3).
Figura 3. Esquema de la progresión de la aterosclerosis
Tipo I
(zona propensa a la lesión)
Tipo II
Tipo III
(Preateroma)
ROS
LDL
Monocitos
Macrófago
Media
Célula espumosa
Tipo IV
(Ateroma)
Núcleo de lípidos extracelulares
28
Íntima
Macrófagos
Células espumosas
Tipo V
(Ateroma fibroso)
Tejido fibroso
Pequeños depósitos
de lípidos extracelulares
Tipo VI
(Complicaciones de la lesión)
Fisura y hematomas
Trombos
d
2.5.2. ESTRÉS OXIDATIVO Y PROCESOS DE INFLAMACIÓN
Desde tiempo atrás se ha manifestado un creciente interés por conocer el papel
exacto que los procesos oxidantes juegan en la patogénesis de la inflamación, la
artritis reumatoide, el asma, la psoriasis y la dermatitis de contacto entre otras
enfermedades (Geronikaki y Gavalas, 2006), todas ellas con un posible vínculo
común con el estrés oxidativo.
El conjunto de procesos asociados con la respuesta inflamatoria es muy complejo (Geronikaki y Gavalas, 2006) y a menudo conlleva la implicación de las especies oxigénicas reactivas. Se han descrito numerosos mediadores que podrían
amplificar la respuesta inflamatoria, como es el caso de la histamina, la serotonina, las citoquinas y el factor de necrosis tumoral. La inflamación juega, en efecto, un papel importante en el desarrollo de numerosas patologías, entre las que
podemos citar la diabetes tipo II, así como sus patologías asociadas como la obesidad (Browning y Jebb, 2006).
De hecho, la relación entre inflamación, diabetes y dieta ha sido verificada en
diferentes estudios realizados tanto en animales como en personas. Así, los marcadores sanguíneos de inflamación, como es el caso de la proteína C reactiva
(PCR) y de la interleukina-6, se consideran, a menudo, parámetros predictivos de
la diabetes. Un caso específico, que nos ilustrará lo complicado de estos procesos, lo constituye la inflamación prostática que, como sabemos, puede contribuir
a la aparición de cáncer en esta glándula, riesgo que disminuye tras la ingestión
de drogas antiinflamatorias y de sustancias antioxidantes (Sugar, 2006).
Según algunos autores, los antioxidantes podrían reducir la inflamación de las
vías aéreas y la reactividad aumentada que existe en los asmáticos (Park y Lee,
2006; Lee et al., 2006). Así, en algunos trabajos se ha demostrado cómo los antioxidantes pueden reducir la expresión de ciertos tipos de citoquinas (interleukina
IL-18) en estos procesos asmáticos, inhibiendo la actividad de NF-kappa B, lo que
29
o
s
d
o
s
sugiere que las especies oxigénicas reactivas podrían regular la expresión de
interleukinas (Lee et al., 2006).
Existe, desde luego, un interés creciente sobre el papel de los antioxidantes
en el control de otras enfermedades con una base inflamatoria, como por ejemplo la alergia. Según se cree, el estatus antioxidante del individuo, está asociado
con una respuesta inmune aumentada aunque no hay evidencia de que a niveles
más elevados de antioxidantes esté asociada una menor respuesta a los alergenos
(Dunstan et al., 2006). La posible acción de los antioxidantes sobre la función
inmune también ha despertado el interés de los investigadores sobre su posible
efecto en patologías ligadas a alteraciones inmunológicas como podría ser el caso
de la esclerosis múltiple (Carlson y Rose, 2006).
A este respecto, se han propuesto numerosas sustancias nutritivas con un
posible papel modulador de la inflamación y, por lo tanto, del impacto global de
ciertas patologías, como la diabetes, sobre el paciente. Asimismo, conocemos factores de la dieta como el ácido oleico, el ácido linolénico y otros antioxidantes
(Basu et al., 2006), y su capacidad reductora de los marcadores de inflamación.
En esta misma línea, ciertos hallazgos sugieren que la vitamina C tienen efectos
antiinflamatorios, estando asociada con una menor disfunción endotelial en varones que no tenían un historial previo de diabetes o de enfermedades cardiovasculares (Wannamethee et al., 2006) o que la quercetina y otros polifenoles antioxidantes tienen una relación directa con la disminución de la inflamación, efecto que estaría mediado por la inhibición de las citoquinas proinflamatorias como
el factor de necrosis tumoral (Nair et al., 2006).
De este modo, las estrategias dietéticas que se han señalado corrientemente
como dieta equilibrada (ingestión adecuada de ácidos grasos omega-3, reducción
de grasa saturada y de ácidos grasos trans y, en paralelo, un consumo elevado de
frutas, hortalizas, frutos secos y cereales integrales), pueden asociarse con una
disminución de la inflamación (Guigliano et al., 2006). En cualquier caso, es evi-
30
d
dente que son necesarios estudios adicionales para poder cuantificar el papel preciso de cada una de las diferentes sustancias implicadas en estos procesos.
2.5.3. INFLAMACIÓN Y ATEROSCLEROSIS
La inflamación juega un papel fundamental en todas las fases de la enfermedad
aterosclerótica. El papel clave de la oxidación, que liga lípidos e inflamación a la
aterosclerosis, es convincente y apoyado por numerosas evidencias experimentales (Tardif, 2006; Basu et al., 2006). Como conocemos, los factores de riesgo cardiovascular y el síndrome metabólico están tipificados por un cierto grado de
inflamación. Adicionalmente, la reducción de peso hace menores (Basu et al.,
2006) los marcadores de inflamación (por ejemplo la proteína C reactiva y la interleukina-6).
El conocimiento cada vez más profundo de las implicaciones metabólicas y del
papel que ejercen sustancias como las lipoproteínas, nos ha permitido un acercamiento más eficaz a las distintas posibilidades preventivas. Así, era perfectamente conocido cómo, en grandes poblaciones, los niveles de HDL colesterol estaban
inversamente relacionados con el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (Navab et al., 2006); sin embargo, el valor predictivo de estas cifras para un
individuo concreto estaba lejos de ser perfecto.
En consecuencia, se han investigado otros factores asociados a las HDL, entre
los que se incluyen ciertos componentes de estas mismas lipoproteínas. Las HDL
son realmente heterogéneas y contienen diferentes sustancias antioxidantes y
prooxidantes, lo cual lógicamente repercute en su misma función. Así, diferentes
estudios han indicado distintos papeles para las HDL como serían la capacidad
de promover el transporte de colesterol y modular la inflamación sistémica. En
ausencia de inflamación, las HDL interactuarían con las enzimas antioxidantes
para mantener el estatus antiinflamatorio.
31
o
s
d
o
s
En presencia de inflamación sistémica, estas enzimas antioxidantes pueden
verse inactivadas y las HDL podrían acumular lípidos oxidados y proteínas que las
convertirían en proinflamatorias. En estas condiciones, la principal proteína de la
HDL, la apolipoproteína A-I, puede verse modificada a merced de la acción de las
especies oxigénicas reactivas. Esta modificación inhabilita la capacidad de las
HDL de vehicular el flujo de colesterol. En consecuencia, la medida de la calidad
y de las funciones de las HDL-c puede proporcionar una mejor identificación de
aquellas personas con un riesgo aumentado de enfermedad cardiovascular.
2.5.4. RELACIÓN ENTRE ENVEJECIMIENTO E INFLAMACIÓN Y PROCESOS
CARDIOVASCULARES
El envejecimiento es consustancial al ser humano y, sin embargo, aún son poco
conocidos los complejos mecanismos por los que se produce. Se han elaborado
al respecto diversas teorías que intentan explicar los mecanismos involucrados
en el proceso de envejecer, siendo una de las más aceptadas la teoría de los radicales libres o del estrés oxidativo. Se basa en un fenómeno común que se produce en nuestras células ante la presencia de oxígeno, lo que conlleva reacciones de oxidación que, a su vez, están en el origen de los llamados radicales
libres. La consecuencia es que estos agentes oxidantes producen deterioro celular, lo que se traduce en una mayor incidencia de diabetes, alteraciones cardiovasculares, cánceres, etc.
Este problema es creciente en una sociedad como la nuestra donde la esperanza de vida es cada vez mayor y, por lo tanto, la trascendencia no sólo sanitaria, sino también económica, de las patologías ligadas al envejecimiento es
enorme. Además de las grandes causas de mortalidad ya citadas, otras muchas
patologías pueden tener su origen, o su mecanismo iniciador, en un desequilibrio en el estatus antioxidante del sujeto: cataratas, enfermedades neurodege-
32
d
nerativas, patologías visuales, etc. Dado que uno de los mecanismos más sencillos y accesibles para mejorar nuestra defensa antioxidante es seguir una dieta
adecuada, parece lógico seguir profundizando en el conocimiento de aquellas
sustancias presentes en los alimentos que puedan beneficiarnos en este sentido.
Teóricamente, unos estilos de vida saludables donde se incorporen unos hábitos
dietéticos correctos podrían beneficiar nuestra longevidad y la calidad de vida de
estos años vividos.
Atendiendo a los datos citados con anterioridad, es comprensible que algunos autores sugieran que la mejora de la función leucocitaria y la restauración
del balance redox tras el consumo de niveles adecuados de antioxidantes en
adultos, pudiera ser útil para conseguir un envejecimiento más saludable
(Alvarado et al., 2006). En cualquier caso, y como conclusión, es evidente que
se necesitan investigaciones adicionales para definir el papel de los factores dietéticos sobre los marcadores de inflamación (Basu et al., 2006).
2.6. SISTEMAS
DE
DEFENSA
ANTE EL
ESTRÉS OXIDATIVO
Frente a la acción tóxica de los radicales libres, los organismos han desarrollado
mecanismos de defensa que permiten su eliminación o transformación en moléculas estables (Davies, 1995).
Todos los sistemas biológicos están en un estado de equilibrio aproximado
entre las fuerzas prooxidantes y la capacidad antioxidante (Sies, 1985), siendo
el desequilibrio a favor de la acción prooxidante lo que se conoce como estrés
oxidativo. De hecho, el daño oxidativo solamente se produce cuando los mecanismos oxidantes superan la capacidad de los sistemas de defensa. Por lo tanto,
la supervivencia de las células aeróbicas precisa de mecanismos que contrarresten los efectos negativos de los radicales libres, permitiendo, los sistemas antio-
33
o
s
d
o
s
xidantes, el mantenimiento de un balance favorable entre los productos deletéreos y los antioxidantes celulares.
Según Halliwell y Gutteridge (1989), antioxidante es cualquier sustancia que
en presencia del sustrato oxidable retrasa considerablemente o inhibe la oxidación de tal sustrato. Un buen antioxidante se caracteriza por su alta efectividad, su variabilidad operativa y su versatilidad para combinarse con una importante variedad de especies oxígenas reactivas. Así pues, entre los sistemas
antioxidantes cabe destacar:
a) A nivel fisiológico: El sistema microvascular, cuya función es mantener los
niveles tisulares de O2, siempre dentro de presiones parciales relativamente
bajas.
b) A nivel bioquímico: La defensa antioxidante puede ser enzimática y no enzimática.
2.6.1. SISTEMA ENZIMÁTICO ANTIOXIDANTE
El principal sistema de defensa contra los radicales libres lo constituyen proteínas antioxidantes enzimáticas (Figura 4) que incluyen la enzima superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutation peroxidasa (GPx), (Betteridge,
2000). La eficacia de esta tríada enzimática reside en una triple acción defensiva al disminuir la producción de estas especies oxigénicas e impedir la interacción de éstas entre sí, para dar lugar a especies más estables de menor reactividad y evitar la peroxidación de las macromoléculas.
Hay otros enzimas importantes que también participan en el sistema de
defensa, incluidos en las reacciones de la regeneración del Glutation (GSH),
como la GSH reductasa, o la NADPH-quinona oxidoreductasa (DT diaforasa).
34
d
2.6.2. SISTEMA NO ENZIMÁTICO ANTIOXIDANTE O “SCAVENGERS” DE
RADICALES LIBRES
En el sistema antioxidante de defensa no debemos olvidar a las moléculas antioxidantes hidrofílicas o lipofílicas. Como el beta-caroteno, la ferritina, la ceruloplasmina, el selenio, el manganeso, la ubiquinona, el zinc, el ácido úrico. De
entre las moléculas hidrofílicas cabe destacar la vitamina C, la vitamina E, el
GSH, los flavonoides y las melanoidinas, entre otras.
Figura 4. Sistema enzimático antioxidante
.
(1) 2 O2 - + 2 H+
(2) 2 H2O2
(3) H2O2 + 2 GSH
SOD
2 H2O2 + O2
Catalasa
2 H2O + O 2
GPx
GSSH + 2 H2O
NADPH
GR
NADP
2 GSH
.
(4) Q + 2e - + 2 H+
DT-diaforasa
QH2
2.6.1.1. GLUTATION REDUCIDO (GSH)
Entre las endógenas destacaremos el Glutation (g-Glu-CysH-Gly) es el mayor componente antioxidante intracelular. Es un tripéptido compuesto de cisteína, ácido
glutámico y glicina. Su distribución es universal al estar presente tanto en tejidos
de plantas como de animales y juega un papel principal en la protección celular
contra los efectos dañinos de los radicales libres. Está presente en las células principalmente en su forma reducida y gran parte de sus funciones se deben a la pre-
35
o
s
d
o
s
sencia del grupo tiólico reducido que le confiere la cisteína y que promueve su
estabilidad intracelular.
En la defensa celular contra los radicales libres tiene un papel importante como
antioxidante al ser capaz de interaccionar y estabilizar radicales hidroxilo, superóxido y peróxidos, además de participar en la reducción de otros antioxidantes
(tales como el α-tocoferol) y de donar hidrógenos para reparar el ADN dañado. Por
otro lado puede actuar como cosustrato de enzimas antioxidantes como la glutation peroxidasa, como ya hemos mencionado. Del glutation reducido podemos destacar las siguientes características:
1. El GSH es un antioxidante exógeno y endógeno. El GSH de la dieta puede ser
absorbido en el intestino delgado y puede ser sintetizado de nuevo.
2. Aunque el radical glutation formado por la oxidación del GSH es un radical prooxidante, este puede reaccionar con otro radical GSH (GS·) y dar como resultado GS-SG que es reducido a GSH por la enzima glutation reductasa dependiente del NADPH.
3. El GSH puede reaccionar con componentes electrofílicos de algunos xenobióticos en la reacción catalizada por la glutation-S-transferasa.
4. El GSH capta las EROs.
5. El GSH puede conjugarse con NO, lo que tiene como consecuencia la formación de
GSH nitrosilado, que a través de un sistema de tiol proteínas liberará GSH y NO.
6. El GSH interacciona con ciertas proteínas tiólicas (glutaredoxina y thioredoxina) que pueden jugar un papel importante en la regulación de la homeostasis
del sistema de reducción-oxidación celular.
36
d
La síntesis del GSH se produce a partir de glutamato, cisteína y glicina en dos
etapas: en la primera etapa, se une el ácido glutámico y la cisteína en una reacción catalizada por la γ-glutamil cisteína sintasa. Dicho paso está limitado por la
disponibilidad de cisteína. El GSH está unido a γ-glutamil cisteína por la GSH sintasa que suma la glicina (Figura 5).
El GSH total está regulado por una reacción de retroalimentación de la γ-glutamil cisteína sintasa. La disponibilidad dietética de los aminoácidos azufrados
puede tener influencia en las concentraciones del GSH celular.
Figura 5. Síntesis de GSH
O
O
SH
S
O
O
N
Glutamato
N
N
N
cisteína
ATP
γ-glutamil cisteína
sintasa
ADP + Pi
glutation
sintasa
ATP
ADP + Pi
O
C
NH
CH2
C
CH2
H
C
N
O
C
COO-
CH2
C
NH3+
COO-
Entre las exógenas y debido a que se encuentran presentes en la cerveza destacaremos los polifenoles y las melanoidinas.
2.6.1.2. COMPUESTOS
FENÓLICOS
Estos compuestos, denominados frecuentemente polifenoles, se encuentran muy
extendidos por todo el reino vegetal. En los alimentos de este origen, son especialmente abundantes en frutas y verduras, además de en productos como el té, el
café, el cacao, la cerveza, el vino y los zumos.
37
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d
o
s
Una de las razones por las cuales han adquirido gran interés dichos compuestos en los últimos años es debido a su actividad antioxidante. Así pues, su ingestión podría ser de interés en la prevención de los procesos patológicos y fisiopatológicos en los cuales están implicados las especies oxigénicas reactivas (EROs o
ROS), como las enfermedades cardiovasculares, cáncer, envejecimiento, enfermedades degenerativas, cataratas, procesos inflamatorios, etc. Sin embargo, hay que
tener en cuenta que los polifenoles también pueden tener un efecto prooxidante
y, en consecuencia, acabar produciendo daños a las macromoléculas.
Figura 6. Estructuras químicas de los diferentes ácidos fenólicos y compuestos polifenólicos de los alimentos.
Ácidos Hidroxibenzóicos
(Ácido galico)
Ácido clorogénico
Ácidos Hidroxicinámicos
(Ácido cafeínico y felúrico)
R1
R1
OH
O
R2
O
OH
O
O
R2
H
OH
OH
R3
OH
R3
H
OH
H O
OH
OH
Lignanos
Estilbenos
(Resveratrol)
Flavonoides
.
R3
R1
CH3O
R2
.
OCH3
OCH3
OH
OR4
OH
OH
O
A
C
R5
R4
R3
R3
OCH3
B
.
R5
R3
OH
Los polifenoles en los alimentos se clasifican en diferentes familias (Manach et
al., 2004) ordenadas según su estructura química, especialmente según los anillos fenólicos y los sustituyentes de dichos anillos. En consecuencia, se pueden
clasificar (Figura 6) como:
38
d
1. Ácidos fenólicos. Entre los que cabe destacar: ácido clorogénico, ácidos
hidroxibenzoicos y ácidos hidroxicinámicos. Dichos ácidos se encuentran en
cantidades muy pequeñas en el reino vegetal, con excepción de ciertas frutas rojas y en las cebollas. El té es, asimismo, una fuente importante de
ácido gálico (4,5 g/Kg) de té fresco). El ácido hidroxibenzoico forma parte
de complejas estructuras en las frutas rojas. El ácido hidroxicinámico se
encuentra en forma libre en los alimentos, pero si éstos sufren procesos
como la congelación, la esterilización o la fermentación se pueden encontrar
en su forma glicosilada.
2. Estilbenos. Los estilbenos, se encuentran mayoritariamente en el vino, siendo uno de los más importantes el resveratrol. El vino tinto contiene 0,3 a 7
mg/L de resveratrol en forma libre y 15 mg/L en forma glicosilada (Vitral et
al., 2002).
3. Lignanos. Los lignanos están formados por dos unidades de fenilpropano. Se
encuentran mayoritariamente en el aceite de linaza y en menor cantidad, en
los cereales y las frutas.
4. Flavonoides. Son un grupo de polifenoles muy abundantes en la naturaleza,
habiéndose localizado hasta el momento más de 5000 especies diferentes de
flavonoides en frutas, verduras, semillas, tallos, cereales y cerveza, siendo,
por lo tanto, unos integrantes significativos de la dieta humana.
Dentro los flavonoides más importantes cabe destacar:
4.1. Los flavonoles son los más comunes en las frutas y verduras. Estos
compuestos se encuentran en los alimentos en forma glicosilada, como
39
o
s
d
o
s
más representativos cabe destacar la quercitina y kaempferol. Las cebollas contienen aproximadamente 1200 mg/kg, el vino tinto y el té contienen 45 mg/L. Las frutas contienen entre 5 y 10 flavonoles glicosilados diferentes y su concentración esta en función de factores ambientales, tales como la luz solar (Manach et al., 2004).
4.2. Las flavonas se encuentran en cantidades menores que los flavonoles
en las frutas y verduras, también se encuentran en forma glicosilada,
siendo las principales la luteolina y apigenina, que se encuentran en el
perejil. Los cítricos contienen grandes cantidades de flavonas polimetoxiladas tales como: tangeritina, nobiletina y sinensetina, siendo éstas
las más hidrofóbicas. La mandarina contiene hasta 6500 mg/L (TomasBarberan y Clifford, 2000).
4.3. Las flavanonas se encuentra generalmente en forma glicosilada por un
disacárido en posición 7. Las podemos encontrar en cantidades considerables en el tomate, en los cítricos y ciertas plantas aromáticas, tales
como la menta. El zumo de naranja contiene entre 200 y 600 mg de hespiridina/L y de 15 a 85 mg de narirutina/L. Un vaso de zumo de naranja puede contener entre 40 y 140 mg de flavanonas glicosiladas. El contenido mayor de flavanonas en la naranja y mandarina se encuentra en
la parte del albedo y las membranas internas de la naranja y mandarina
(Tomas-Barberan y Clifford, 2000).
4.4. Los flavanoles se encuentran en forma de monómeros (catequina y epicatequina) y en forma de polímeros (proantocianidinas). Éstos en los
alimentos no se encuentran en forma glicosilada. Las catequinas están
mayoritariamente presentes en las frutas, en el vino tinto (hasta 300
40
d
mg/L), en el té, un vaso de té verde contiene hasta 200 mg de catequinas (Lakenbrink et al., 2000) y en la cerveza con/sin alcohol 401 y 343
mg/L respectivamente (Valls y Belles et al., 2005). Las proantocianidinas forman complejos con proteínas de la saliva los cuales son responsables del carácter astringente de las frutas. Es difícil la cuantificación
de las procianidinas en los alimentos ya que según el estado de maduración podemos encontrar diferentes estados de polimerización.
4.5. Las isoflavonas se encuentran principalmente en las plantas leguminosas, siendo la soja la de mayor contenido, podemos encontrar genisteína, daidzeína y gliciteína en una proporción de 1:1:0,2, encontrándose
en cuatro formas químicas diferentes: aglicona, 7-O-glicosido, 6”-O-acetil-7-O-glicosido y 6”-O-malonil-7-O-glicosido. La semilla de soja contiene entre 580 y 3800 mg de isoflavones/kg. Son sensibles al calor y en
los procesos industriales son hidrolizados a glicosidos tal como ocurre
en la producción de la leche de soja, la cual contiene de 30 a 175 mg/L
(Cassidy et al., 2000).
4.6. Las procianidinas (Figura 7) son pigmentos que podemos encontrar en
el vino tinto, en los cereales y mayoritariamente en las frutas, especialmente en la piel de estas últimas. Además pueden existir bajo diferentes formas químicas, siendo la cianidina la más común. El contenido en
los alimentos está en función de la intensidad del color. Puede llegar
hasta 2000-4000 mg/kg en las grosellas y fresas. Estos valores aumentan con el proceso de la maduración. El vino tinto contiene entre 200350 mg de antocianinas/L, las cuales se transforman en complejas
estructuras con la edad del vino (Clifford, 2000).
41
o
s
d
o
s
Figura 7. Estructura química de las procianidinas
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
2.6.1.2.1. FLAVONOIDES
Y
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Estructuralmente, los flavonoides son derivados benzo-γ-pirenos, su estructura
básica está constituida por dos anillos bencénicos unidos a través de un anillo
pirona o pirano heterocíclico (Bravo, 1998) (Figura 6). La estructura química
de los compuestos fenólicos es precisamente la que les confiere su capacidad
para actuar como captadores de radicales libres (Heim et al., 2002). Esta actividad antioxidante viene marcada por el tipo de compuesto, su grado de metoxilación y el número de grupos hidroxilo. Así, los compuestos con mayor actividad (Rice-Evans et al., 1996) son aquéllos que presentan dos grupos hidroxilo en posición orto en el anillo B, lo que confiere una alta estabilidad al radical que se forma después de la reacción de captura del radical libre. Contienen
un doble enlace 2,3 en conjugación con el 4-oxo (C=O) en el anillo C y aquellos compuestos que tienen grupos OH- en 3 y 5 y el grupo oxo (C=O) en 4 anillos A y C. Así pues:
42
d
• Pueden actuar directamente como "scavenger" de radicales libres, oxidándose y dando lugar a otros compuestos más estables (Figura 8).
• Pueden estabilizar compuestos obtenidos a partir de radicales libres.
• Pueden tener un efecto aditivo a la defensa antioxidante endógena, aumentando o manteniendo dicha defensa antioxidante.
La hidrofobicidad de los flavonoides es intermedia entre la vitamina C (altamente hidrofílica) y la vitamina E (altamente hidrofóbica). Por lo tanto, actuarán en la interfase agua-lípido, siendo los más hidrofóbicos los glucuronizados
y sulfatados. Asimismo, tienen capacidad de quelar iones metálicos (Fe, Cu),
.
impidiendo la formación del radical hidroxilo (OH ) (Middleton et al., 2000;
Ozgova et al., 2003) e inhibiendo determinadas enzimas como ciclooxigenasa
(Laughton et al., 1991), lipoxigenasa (Van Hoorn et al., 2002), NADPH oxidasa
(Varga et al., 2004), etc. Los efectos de los polifenoles dependen de la cantidad y su biodisponibilidad.
Los polifenoles también pueden tener efecto prooxidante (Figura 8). Así, en
estudios in vitro, en ciertos flavonoides como los flavanoles con una di-hidroxilación en el anillo B, tienen la habilidad de oxidarse en condiciones concretas
(Chan et al., 2003) dando lugar a la formación de derivados semiquinónicos, que
en presencia de ión superóxido, dan lugar a la formación de peróxido de hidrógeno. En presencia de metales de transición, tales como el Fe y Cu, este peró.
xido formará el radical hidroxilo (OH ). Por otra parte, la semiquinona puede oxidarse a quinona y dañar a las macromoléculas (proteínas, lípidos, DNA, RNA,
etc.) (Spencer et al., 2004; Galati y O’brien, 2004).
43
o
s
s
Figura 8. Actividad antioxidante y prooxidante de los polifenoles
Flavonoide
Antioxidantes
(Vitamina C)
O-
OH
Flavonoide
OH
OH
O2.HO.
H2O2
H2O
OH
O
.
O
Flavonoide
semiquinónico
O
R5.
OH
OH
R5.
ANTIOXIDANTES
o
OH
O
OH
O
O2
O2.O
Flavonoide
quinónico
Daño celular
Derivados
quinónicos
-2e + 2H+
OH
O
O
R5.
PROOXIDANTES
d
OH
OH
O
El mecanismo a través del cual los flavonoides ejercen sus acciones beneficiosas o tóxicas aun está sin esclarecer. Sin embargo, estudios recientes han
especulado que la actividad clásica como antioxidantes de donadores de hidrógenos difiere de la explicación básica para los efectos celulares. Actualmente, se
está estudiando la posibilidad de un nuevo mecanismo de actuación no antioxidante y de protección como sería la unión a receptores, funcionando como moléculas señal, así como la modulación de la expresión de genes (Rice-Evans,
2003).
Los flavonoides se combinan con azúcares para formar glicósidos, siendo ésta
la forma más habitual en la que se encuentran en la naturaleza. Sin embargo,
44
d
se ha visto que las agliconas pueden mostrar incluso una actividad antioxidante
superior a sus correspondientes glicósidos.
2.6.1.2.2. BIODISPONIBILIDAD DE LOS POLIFENOLES
Los mecanismos de absorción gastrointestinal de los polifenoles no están totalmente esclarecidos. Por su naturaleza hidrofílica se piensa que tienen que estar
implicados los transportadores de membrana que faciliten su transporte, aunque en
la actualidad solamente ha sido identificado un transporte activo dependiente de
Na+ en el transporte de ácidos fenólicos (Ader et al., 1996).
En el caso de los flavonoides, éstos (con excepción de los flavanoles) se encuentran en forma glicosilada y esta glicosilación influye de forma importante en su
absorción. Las agliconas pueden ser absorbidas desde el intestino delgado (Hollman
y Katan, 1999) y los glicósidos que resisten la hidrólisis del estómago, no pueden ser
absorbidos en su forma nativa por lo que deben de ser hidrolizados por las enzimas
intestinales o por la microflora del colon para ser absorbidos (Day et al., 2000). En
muchos casos, cuando la flora está implicada, la eficiencia de absorción puede verse
reducida porque tiene lugar una degradación de las agliconas que son liberadas en
forma de ácidos aromáticos. Una excepción en cuanto a su absorción son aquellos
flavonoides conjugados con glucosa que pueden utilizar el sistema de transporte activo de la glucosa dependiente de Na+ (SGLT1) a nivel del enterocito para ser absorbidos, y posteriormente hidrolizados en el interior de las células por una α-glucosidasa (Day et al., 1998). Otra vía implicada en la hidrólisis de algunos glucósidos es a
través de una enzima glucosidasa que se encuentra en la membrana de las microvellosidades de las células intestinales, y cataliza la hidrólisis extracelular facilitando la
difusión de las agliconas al interior de las células (Day et al., 2000).
Las procianidinas difieren de la mayoría de los otros polifenoles por su naturaleza polimérica y alto peso molecular, lo cual limita su absorción a través de la
45
o
s
d
o
s
barrera gástrica donde los olígomeros de más de tres unidades es improbable que
sean absorbidos a nivel del intestino delgado en su forma nativa, (solo dímeros
y trímeros son capaces de atravesar el epitelio intestinal). Así, las procianidinas,
las cuales son los polifenoles más abundantes de la dieta, son muy pobremente
absorbidas, pero pueden ejercer sus efectos localmente en el tracto gastrointestinal o mediar su actividad a través de los ácidos fenólicos producidos resultado
de la degradación microbial. Su acción local es muy importante al estar el intestino particularmente expuesto a agentes oxidantes.
Los efectos de los otros componentes del alimento sobre la biodisponibilidad
de los polifenoles no están estudiados, aunque suponemos que pueden ocurrir
interacciones entre los polifenoles y componentes como las proteínas y los polisacáridos que afecten a su absorción. Otros efectos indirectos de la dieta son su
efecto sobre el pH, la fermentación intestinal, la excreción biliar, etc. que pueden tener consecuencias sobre la absorción final de los polifenoles.
En cuanto al metabolismo de los antioxidantes procedentes de la dieta, éste es
complejo y los antioxidantes pueden actuar como sustratos de diferentes enzimas.
Así, los compuestos polifenólicos son modificados por enzimas de biotransformación de la fase I y los de la fase II que pueden cambiar considerablemente la función de un componente particular, modificándolo para su eliminación posterior o
generando compuestos más bioactivos. La biotransformación en el hígado por
medio de reacciones de fase I introduce o expone grupos polares, y la que tiene
lugar en el colon mediante reacciones de fase II, en las que los microorganismos
degradan los flavonoides no absorbidos. Las reacciones de conjugación de los grupos hidroxilo con el ácido glucurónico, sulfato, glicina o metilación son los pasos
más frecuentes en las metabolización de los flavonoides (Stahl et al., 2002) y algunas de estas reacciones afectan a la capacidad antioxidante in vivo.
La metilación en la posición 3’ de cianidina-3-glucosida y de la quercitina
disminuye su capacidad antioxidante del metabolito. La conjugación con glucu-
46
d
rónido o sulfato puede afectar a la capacidad antioxidante dependiendo de la
posición en la que tenga lugar la conjugación. La quercitina es posiblemente
conjugada durante el proceso de absorción, y parece retener su actividad antioxidante.
El transporte de los polifenoles en plasma está asociado a proteínas, no
encontrandose libres en sangre, siendo la principal transportadora la albúmina.
La concentración plasmática de los polifenoles después de un consumo elevado
varía de acuerdo a la naturaleza y fuente de los polifenoles. Con respecto a la eliminación de los metabolitos de los polifenoles, la excreción puede seguir dos vías
diferentes, la vía biliar y la urinaria. Los metabolitos conjugados son principalmente eliminados por la bilis mientras que los monosulfatos lo hacen principalmente por orina.
A consecuencia de su estructura, presentan importante actividad antioxidante con unos efectos metabólicos importantes. Ya que su solubilidad es intermedia entre la vitamina C y la vitamina E, es de esperar que actúen en la interfase
agua/lípido y puedan estar implicadas en la regeneración oxidativa de ambas
vitaminas. La glucuronidación y sulfatación ocasiona polifenoles más hidrofílicos,
lo que puede afectar su sitio de acción y su interacción con otros antioxidantes.
También pueden mostrar efectos indirectos sobre la salud porque son metabolizados por la misma vía que algunos xenobióticos u hormonas endógenas.
Tras el consumo de flavonoides presentes en alimentos como la cebolla y el
tomate (Boyle et al., 2000), se observa que glucósidos como la quercetina-glucosidada y isorhamnetina-glucosidada incrementan sus niveles en plasma; además, este incremento se asoció con un incremento en la resistencia del ADN de
los linfocitos a la escisión de cadena, y a una disminución de los niveles de la
base modificada 8-hidroxi 2’-deoxiguanosina en orina después de 4h de haber
ingerido cebolla. En el mismo estudio, con una combinación dietética de tomate
y cebolla, se observó que la presencia del flavonoide quercetina en plasma tenía
47
o
s
d
o
s
relación con una disminución en la oxidación de las bases endógenas, sin apreciarse cambios en los niveles de MDA en orina.
Otros estudios llevados a cabo por Cao y colaboradores (Cao et al., 1998) en
humanos, encontraron que después de una comida con fresas, espinacas o vino
desalcoholizado, todos ellos alimentos ricos en antioxidantes de naturaleza fenólica, existió un aumento en la capacidad antioxidante en suero utilizando 3 métodos (ORAC, Trolox y la capacidad de reducir el hierro). Otro estudio (Nagyova et
al., 1998) en vegetarianos demostró que los TBARS estaban reducidos y la capacidad antioxidante total en plasma incrementada.
2.6.1.3. MELANOIDINAS
Las melanoidinas son unos polímeros formados principalmente partir de las interacciones entre carbohidratos y compuestos que poseen un grupo amino libre
(aminoácidos, péptidos y proteínas) a través de la reacción de Maillard (que produce pigmentos marrones). Son un grupo de sustancias con actividad antioxidante que está presente de forma importante en determinados alimentos (café,
malta, bollería, cerveza, etc), siendo ingeridos en cantidades considerables en la
dieta habitual, con una media de ingestión del orden de varios gramos al día.
La reacción de Maillard es una de las más importantes en lo que respecta a
los cambios químicos experimentados por los componentes de los alimentos
durante el procesado y almacenaje de los mismos (Friedman, 1996). Entre los
distintos efectos fisiológicos de las melanoidinas se han descrito los siguientes: capacidad antimicrobiana, antimutagénica, antitumoral, capacidad de
actuar como antioxidantes y como prooxidantes, supresión del crecimiento celular tumoral e inhibición de enzimas digestivos.
Su papel como antioxidante in vivo no es conocido a fondo aunque distintos
estudios in vitro apoyan su papel beneficioso como antioxidante de los radicales
48
d
hidroxilo, superóxido y peroxilo, actuando además como quelantes de metales
como el zinc y el cobre. Así, algunos autores (Chuyen, 1988) observaron que los
niveles de peroxidación lipídica en hígado de ratas wistar alimentadas durante 6
semanas con alimentos ricos en melanoidinas (miso) eran inferiores a los del
grupo control. En una línea similar, nuestro grupo de investigación (Valls et al.,
2004), utilizando melanoidinas procedentes de síntesis, a partir de glucosa-glicina, encontró efecto como antioxidante frente a la toxicidad inducida en hepatocitos aislados de rata por el agente antitumoral adriamicina. Se observó una disminución en los TBARS y en los niveles de LDH liberados al medio extracelular, a
la vez que se producía un incremento en los niveles de ATP. Otros estudios mostraron el papel protector de los productos de Maillard, contra el daño oxidativo al
ser capaz de inhibir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)
humanas in vitro (Dittrich et al., 2003).
No se conoce demasiado sobre su biodisponibilidad, pero ciertos estudios en
animales han permitido saber que se absorben a través del tracto gastrointestinal. Con respecto a su biotransformación, se cree que las enzimas de la fase II
facilitan el tránsito metabólico de las melanoidinas formadas en los alimentos
(Faist y Erbersdobler, 2001). No es conocido el mecanismo por el que estos compuestos pueden ejercer sus efectos a nivel celular, aunque sabemos que los compuestos de la reacción de Maillard se absorben por difusión y son captados en el
hígado, riñón, músculo y eliminados por la orina (Erbersdobler y Faist, 2001). Por
otro lado, distintos trabajos apuntan a que el efecto de las melanoidinas en las
células pueda estar mediado por los RAGE (receptor for advanced glycation end
products), receptores que fueron originalmente identificados y caracterizados
basándose en la capacidad de unir los productos de glicosilación avanzada
(AGEs).
49
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s
d
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s
2.6.3. SISTEMAS REPARADORES
Su objetivo consiste en eliminar los posibles productos metabólicos nocivos formados, lo que impediría su acumulación indeseable. Para ello, se ponen en marcha mecanismos enzimáticos de reparación de ADN, así como enzimas proteolíticas y lipolíticas. En estos sistemas están incluidos los siguientes subsistemas:
a. Sistema reparador directo
Actúa por reducción de los grupos (S-S) de los aminoácidos azufrados de las
proteínas gracias a enzimas específicas como son la disulfuro reductasa y la sulfóxido reductasa. Este grupo de enzimas reparadoras son las que catalizan la
reducción de grupos (S-S) oxidados en proteínas por la acción de reductasas
disulfuro en el interior de las células.
Otro grupo de enzimas reparadoras son las proteasas y las fosfolipasas, que
actúan sobre proteínas y fosfolípidos, una vez se produce el daño en la molécula y éstas deben ser reemplazadas vía síntesis de novo (Davies, 1995; Sartori
y Jiricny, 2003).
b. Sistema reparador indirecto
Este sistema conlleva, en primer lugar, el reconocimiento del daño molecular
(siendo éste eliminado o degradado) y, en segundo lugar, la síntesis de la parte
eliminada. Esto ocurre en las proteínas oxidadas y en los peróxidos lipídicos de
las cadenas carbonadas, como por ejemplo en las oxidaciones de ADN y ARN
(Mataix, 2002).
Los ácidos nucleicos que han sido modificados como consecuencia del estrés
oxidativo, son reparados principalmente por el sistema REB (reparación por
escisión de base) donde intervienen un grupo de enzimas como glicosilasas y
endonucleasas AP, siendo el nucleótido dañado repuesto por las polimerasas
(Demple y Harrison, 1994).
50
d
2.7. ALIMENTACIÓN Y ESTRÉS OXIDATIVO
La composición de la dieta juega, como hemos visto, un papel importante en el
desarrollo del estrés oxidativo, ya que puede contribuir tanto sobre el daño oxidativo como sobre los mecanismos de defensa antioxidante, lo que explica, al
menos en parte, la relación entre la dieta y algunas enfermedades crónicas o
degenerativas como la aterosclerosis y el cáncer.
En efecto, durante las últimas décadas, la preocupación de las autoridades
sanitarias por la importancia de las enfermedades crónicas y degenerativas ha
sido creciente. En efecto, la Organización Mundial de la Salud (OMS) refleja en
sus documentos cómo, de no actuar adecuadamente, en el año 2.020 las enfermedades no transmisibles (patologías cardiovasculares, diabetes, hipertensión
arterial y ciertos tipos de cáncer) serán la causa del 73% de las defunciones y
del 60% de la carga mundial de enfermedad (OMS, 2001).
Simultáneamente, la dieta mediterránea es conocida desde hace tiempo como
un modo de alimentarse saludablemente (Nestle, 1995). En efecto, la prevalencia de las citadas patologías en los países cuya población sigue la dieta mediterránea es sensiblemente menor, habiéndose achacado este efecto a diferentes
factores ambientales y, por supuesto, dietéticos (Keys, 1995). La ventaja, en términos de salud, que supone mantener un estilo de vida que contemple el seguimiento de la dieta mediterránea, ha quedado suficientemente establecido, aunque las causas no están aún lo suficientemente claras: desde el perfil lipídico
hasta el contenido en antioxidantes, pasando por la presencia de fibra y de otras
sustancias, se han propuesto como fundamento de este vínculo entre la dieta y
la salud (Willet, 2006).
En los últimos años, el interés en ciertos antioxidantes, ampliamente distribuidos entre los alimentos de origen vegetal, se ha acentuado considerablemente dados los últimos hallazgos clínicos y epidemiológicos (Pitsavos et al., 2005)
51
o
s
d
o
s
que vinculan la ingestión de alimentos de la dieta mediterránea, ricos en estas
sustancias, con la capacidad antioxidante total. Se destacan especialmente los
polifenoles.
2.7.1. DIETA RICA EN ANTIOXIDANTES (POLIFENOLES) Y SALUD
La ingestión, en el contexto de una dieta equilibrada, de alimentos ricos en
antioxidantes y, entre ellos en polifenoles, parece guardar una estrecha relación
con una mejor salud. Referencias globales de este tipo se encuentran, por ejemplo, en el estudio epidemiológico de Zutphen, realizado en 552 ancianos entre
50 y 69 años durante un periodo de 5 años, en el que se observó cómo la ingesta de flavonoides estaba inversamente correlacionada con la mortalidad producida por la patología cardiovascular. De este modo, se observó un 60% menos
de mortalidad entre la población que ingería un mayor contenido de flavonoides
en su dieta (Hertog et al., 1993). Con respecto a esta repercusión fisiológica
hay que destacar los siguientes puntos:
■ Ingestión de polifenoles y capacidad antioxidante. Los efectos beneficio-
sos de la ingesta de un elevado número de alimentos ricos en compuestos
fenólicos como fresas, espinacas, cerveza y vino tinto, se pueden evaluar a
corto plazo ya que aumentan la capacidad antioxidante en suero (Cao et al.,
1998; Velioglu et al., 1998; Kähkönen et al., 1999), lo que avala el creciente interés por el consumo de alimentos ricos en estos compuestos (Hertog et
al., 1995).
La relación entre la capacidad antioxidante total de la dieta y los marcadores de inflamación apenas ha sido estudiada in vivo. De entre los datos disponibles, señalamos que parece haber una relación significativa inversa entre
la proteína C reactiva del plasma y los antioxidantes totales de la dieta inge-
52
d
ridos. La relación es más estrecha precisamente en aquellos sujetos que padecen hipertensión. Además, el valor antioxidante total de la dieta es significativamente mayor en aquellos sujetos que tienen cifras plasmáticas de proteína C reactiva bajas, en comparación con los que las tienen más altas. La
conclusión de que la capacidad antioxidante total de la dieta está inversa e
independientemente relacionada con las concentraciones plasmáticas de proteína C reactiva, que podría ser uno de los mecanismos que explicaría el efecto protector frente a las enfermedades cardiovasculares de una dieta rica en
antioxidantes. Esto, en definitiva, podría ser especialmente significativo para
sujetos con hipertensión (Brighenti et al., 2005).
En lo que respecta a la capacidad antioxidante total del suero (CAT) en
diversas patologías, se ha visto que a menudo disminuye significativamente
(por ejemplo, hasta un 24% en la anorexia nerviosa, un 20% en la encefalopatía VIH, un 13% en la polineuropatía diabética y un 17% en la cardiomiopatía). Sin embargo, en el suero de los pacientes afectados por enfermedades
renales, la capacidad antioxidante está significativamente elevada. Los datos
indican que un estrés oxidativo aumentado puede relacionarse con la patogénesis o la progresión de la polineuropatía diabética así como de la cardiomiopatía. La disminución de la capacidad antioxidante del suero en pacientes con anorexia nerviosa o con encefalopatía VIH se debe, probablemente,
en primer lugar a la malnutrición y en segundo lugar a la insuficiencia inmune y a la disminución de la capacidad antioxidante. En la enfermedad renal,
sin embargo, la acumulación de urea en plasma parece ser la responsable de
esta alta capacidad antioxidante. En contraste, otros autores no han hallado
cambios en el valor antioxidante del plasma en la enfermedad de Parkinson,
la enfermedad de Alzheimer, en el síndrome depresivo ni en la esquizofrenia
(Sofic et al., 2002).
53
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d
o
s
■ Polifenoles y cáncer. Desde un punto de vista bioquímico, los compuestos
fenólicos revisten un especial interés debido a su potencial anticarcinógeno,
bien por estimular el bombeo de ciertos agentes cancerígenos hacia el exterior
de las células o bien por actuar mediante la inducción de enzimas de detoxificación (Mazza, 2000). En la bibliografía científica, son múltiples las referencias
que demuestran que los flavonoides tienen efectos citostáticos en varios sistemas in vitro y que son capaces de regular ciertos procesos importantes en el
desarrollo del cáncer. Los flavonoides tienen actividad antipromotora, efecto
antiinvasivo, e inhiben enzimas como la tirosina proteinkinasa, la ornitin
decarboxilasa ATP-dependiente y la DNA topoisomerasa. Numerosos trabajos de
investigación demuestran que los isoflavonoides de la soja, especialmente la
genisteína, pueden tener efecto protector frente a diferentes tipos de cáncer
(mama, colon y piel). Este hecho, se ha relacionado con el efecto estrogénico
de los isoflavonoides, mediante diferentes mecanismos bioquímicos (Barnes,
1995; Herman et al., 1995). En lo referente al cáncer en aparato digestivo, es
necesario tener en cuenta que el tracto gastrointestinal está continuamente
expuesto a la acción de los radicales libres por diferentes vías:
a. En el estómago:
1) Se producen mezclas de ácido ascórbico con el hierro formando una combinación prooxidante.
2) Las proteínas hemo de la dieta, las cuales son potentes prooxidantes.
3) Peróxidos lipídicos, aldehídos citotóxicos e isoprostanos de la dieta.
4) El nitrito de la saliva y de los alimentos se convierte en HNO2 por el ácido
gástrico formando nitrogenados y especies desaminadas del DNA.
5) Aumento de la concentración de H2O2 procedente de ciertas bebidas.
54
d
b. En el intestino:
1) La presencia de cantidades de productos oxidables, prooxidantes y compuestos fenólicos tales como hidroxiquinonas.
2) La activación de células inmunes presentes en el intestino por bacterias y
toxinas de los alimentos.
Estos compuestos y sus derivados producirán efectos sobre el tracto gastrointestinal. Por tanto, los polifenoles pueden actuar inmediatamente en el
propio tracto gastrointestinal como “scavengers” de radicales libres, inhibiendo todos los efectos anteriormente mencionados. La absorción del hierro no es
completa en el intestino delgado, por tanto en colon y recto puede actuar
como un prooxidante, por lo que podría ser el responsable de algunos tipos de
cáncer de colon y de recto. Sin embargo, los polifenoles de la dieta que no se
absorben pueden quelar dicho metal y reducir así el efecto prooxidante, ejerciendo por lo tanto un efecto positivo que protegería frente a los cánceres gastrointestinales (Babbs et al., 1990; Middleton et al., 2000; Halliwell et al.,
2005).
■ Polifenoles y salud cardiovascular. Los compuestos fenólicos protegen de la
oxidación a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel
clave para prevenir la aterosclerosis. También pueden prevenir la trombosis,
inhibiendo la agregación plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar
(Mazza, 2000). Este efecto se ha demostrado mediante experimentos con animales in vitro e in vivo. En muchos casos, se inhibe la AMP cíclico fosfodiesterasa y como resultado se incrementan los niveles de cAMP. Asimismo, se reduce el nivel de calcio, se inhibe el factor de activación plaquetario, la captación
de radicales libres y se reduce la liberación de enzimas que favorecen la agregación plaquetaria (Meltzer y Malterud, 1997; Craig et al., 1996).
55
o
s
d
o
s
■ Polifenoles e inmunidad. Los compuestos fenólicos también son considera-
dos como reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la modulación del metabolismo del ácido araquidónico, reduciendo los niveles de tromboxano. También modulan la actividad enzimática
de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la
acción de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los radicales superóxido), entre otras. Dichos efectos les otorgan un amplio potencial para su
utilización con fines médicos (Craig et al., 1996). Son numerosos los estudios
que han mostrado que este tipo de compuestos poseen propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando radicales libres como
hidroxilo, supéroxido y alcoxi radical (Sichel et al., 1991).
■ Polifenoles e infección. También se han descrito efectos antivíricos, anti-
bacterianos y antifúngicos. Se ha observado in vitro el potencial de la epicatequina como agente antivírico y las antocianidinas pueden inhibir las enzimas que intervienen en la replicación del rhinovirus y del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hocman, 1989).
■ Polifenoles y salud ósea. Numerosos estudios señalan el papel protector de
los polifenoles frente a la osteopenia. Así, se ha encontrado que la rutina inhibe la pérdida de trabéculas óseas en ratas ovariectomizadas por diferentes
causas: a) por reducir la resorción ósea y b) por aumentar la actividad osteoblástica (Horcajada-Molteni et al., 2000).
■ Polifenoles y menopausia. Es conocida desde hace tiempo la probable pro-
tección ante la aparición de patologías postmenopaúsicas (ECV, osteoporosis…) cuando se suplementa la dieta con fitoestrógenos (Keller et al., 1999).
56
d
Estudios más recientes apoyan la teoría de que los fitoestrógenos (isoflavonas
y lignanos, entre ellos) podrían tener un papel en la prevención de la osteoporosis tras la menopausia, especialmente en el caso de la soja, las semillas de
lino y las ciruelas (Arjmandi, 2001). Estos fitoestrógenos son compuestos de
origen vegetal (judías, coles, espinacas, soja, cereales, lúpulo, etc.) con actividad estrogénica o antiestrogénica. Los principales componentes presentes en
los alimentos y que tienen esta actividad son los isoflavonoides, los flavonoides y los lignanos.
Sin embargo, actualmente no hay evidencias que sugieran beneficios consiguientes a la promoción de modificaciones dietéticas en este sentido. Asimismo,
cabe destacar que los fitoestrógenos han producido efectos secundarios negativos en animales de experimentación, como por ejemplo sobre la diferenciación
cerebral durante el crecimiento. Tampoco conocemos las posibles dosis tóxicas
cuando se ingieren por niños o por adultos.
2.7.2. PRESENCIA DE POLIFENOLES EN LA ALIMENTACIÓN HUMANA
No se ha profundizado en estudios que reflejen el consumo real de estas sustancias en la dieta cotidiana. Por el contrario, sí señalaremos algunos datos parciales disponibles en diferentes países:
■ En Australia (Lyons-Wall et al., 2004), la ingestión total de flavonoides en
mujeres es de 128 miligramos al día (+/- 19.9 mg/dl). En este grupo, las mayores fuentes dietéticas de este polifenol fueron: cebolla, manzana, té, aceitunas
y brécol en lo que respecta a los flavonoles. Para las flavonas, el perejil y el
apio son las fuentes alimentarias, siéndolo la naranja, el pomelo y sus zumos
para las flavononas y el té, la manzana, el vino tinto, el chocolate negro y el
cacao para las catequinas. La catequina es precisamente el tipo de flavonoides
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más presente en este grupo de mujeres (representan el 59% del total), seguida por los flavonoles (un 20%) y las flavononas (un 18%) con una pequeña
contribución de las flavonas (3%). Como señala el mismo autor, la ingestión
media de catequina en otros países es, a modo de ejemplo, de 14,1 mg en
Finlandia, de 25,4 mg en EE.UU y de 72 mg diarios en Alemania.
■ En Estados Unidos (Kuhnau, 1976), el consumo de flavonoides parece estar
alrededor de 1 g al día. En Holanda (Hertog et al., 1993), la ingestión de polifenoles se estimó en 23 mg al día. En Dinamarca (Justesen et al., 1997), el
valor obtenido fue de 28 mg al día de flavonoides.
■ En el conjunto de los países occidentales (Manach et al., 2004), el consumo
total de flavonoides se ha calculado en una cifra que oscilaría entre los 100 y
150 mg diarios.
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OBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo principal de este trabajo de investigación ha consistido en estudiar el
efecto de la suplementación dietética de lúpulo a través de una bebida fermentada y de cápsulas o concentrados de lúpulo, con el metabolismo oxidativo y su relación con los marcadores de riesgo cardiovascular y de inflamación en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura). Como objetivos parciales del estudio
podemos enumerar el conocimiento de:
■ Los hábitos alimentarios del grupo de población seleccionado y el valor
nutritivo de su dieta.
■ Estudiar el efecto de la ingestión de cerveza sin alcohol en el metabolis-
mo oxidativo y su relación con el metabolismo lipídico y los procesos de
inflamación en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura).
■ Estudiar el efecto de la ingestión de un suplemento de lúpulo en el meta-
bolismo oxidativo y su relación con el metabolismo lipídico y los procesos
de inflamación en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura).
■ Comprobar el efecto antioxidante de la cerveza sin alcohol y del lúpulo en
los procesos patológicos relacionados con el envejecimiento en un colectivo de monjas de clausura.
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MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. MATERIAL
4.1.1. SUPLEMENTOS
■ Lúpulo. Inflorescencias femeninas de lúpulo, encapsuladas en gelatina, propor-
cionadas por el laboratorio Dolisos (marca ElusanR). Cada cápsula conteniendo
200 mg.
■ Cerveza sin alcohol. Se ha optado por esta modalidad al tratarse de un grupo
de edad avanzada.
4.1.2. REACTIVOS
■ Los reactivos para soluciones tamponadas, enzimas, coenzimas, fueron propor-
cionados por Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) y Boehringer Mannheim
(Alemania).
■ Los disolventes y otros reactivos de ScharLau (Barcelona, España) y Merck
(Darmstadt, Alemania).
■ Tests enzimáticos y kits para diferentes determinaciones:
• Triglicéridos: test enzimático GPO-PAP, comercializado por Roche Diagnostics
GMBH, D-68298 Mannheim (Alemania).
• Colesterol: test enzimático CHOD-PAP, comercializado por Roche Diagnostics.
• HDL colesterol: enzimas modificadas por PEG (polietilenglicol) y sulfato de alfaciclodextrina y dextrano, comercializado por Roche Diagnostics.
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• LDL oxidada: inmunoensayo enzimático para la determinación de anticuerpos
frente a LDL oxidada en suero humano. Para esta determinación, se utilizó el kit
OLAB “anti oxidised LDL” de Biomédica.
• Interleukina 1: Kit ELISA, de Diaclone Research.
• Interleukina 6: Kit ELISA, de Diaclone Research.
• Factor de necrosis tumoral: Kit ELISA, de Diaclone Research.
■ El agua utilizada en todas las determinaciones fue de grado Milli-Q (Millipore).
4.2. MÉTODOS
4.2.1. ANALÍTICAS SANGUÍNEAS
Una vez recogidas las muestras de sangre, se trasladan en condiciones de refrigeración al laboratorio para proceder a un tratamiento inicial de las muestras y
a las correspondientes determinaciones.
4.2.1.1. PERFIL LIPÍDICO
a. Determinación de triglicéridos. Para la determinación de los triglicéridos se
utilizó el autoanalizador Modular EDDPP-ROCHE y el test enzimático triglicéridos GPO-PAP. Siendo el rango de normalidad para dicho test de 50-170 mg/dL.
Principio del test: el método se basa en las siguientes reacciones acopladas: los triglicéridos se someten a la acción de la lipoprotein lipasa que pro-
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duce una hidrólisis rápida y completa a glicerol. Posteriormente, y tras fosfatación, se produce dihidroxiacetonafosfato y peróxido de hidrógeno, el cual
en presencia de un cromógeno, 4–aminofenazona y 4–clorofenol formará un
compuesto coloreado (4–fenazona) que es directamente proporcional a la
cantidad de triglicéridos presentes en la muestra.
b. Determinación de colesterol total. Para la determinación del colesterol total
se utilizó el autoanalizador Modular EDDPP-ROCHE y el test enzimático colesterol CHOD-PAP. Siendo el rango de normalidad para dicho test de 70-220 mg/dL.
Principio del test: el método está basado en la hidrólisis de los ésteres de
colesterol presentes en la muestra por la colesterol esterasa dando lugar a colesterol libre y ácidos grasos. Posteriormente, y tras oxidación enzimática con
la colesterol oxidasa, se formará peróxido de hidrógeno y colesterina. Finalmente, este peróxido de hidrógeno se valora por la reacción de Trinder, mediante un cromógeno, fenol y 4-aminofenazona, en presencia de peroxidasa,
formando una benzoquinona, cuya coloración es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra.
c. Determinación de HDL colesterol. La determinación directa de colesterol
HDL mediante el empleo de enzimas modificadas por PEG (polietilenglicol) y
sulfato de alfa-ciclodextrina y dextrano. Se utilizó el autoanalizador Modular
EDDPP-ROCHE, siendo el rango 35 – 60 mg/dl.
Principio del test: PEG- colesterol esterasa rompe los esteres de colesterol-HDL en colesterol libre y ácidos grasos, que tras oxidación, formará peróxido de hidrógeno, el cual por acción del cromógeno 4- aminofenazona y
HSDA (N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina) formará un compuesto coloreado azul-violeta. Dicha coloración es proporcional a la cantidad de
HDL-c presente en la muestra.
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d. Determinación de LDL colesterol. Para la determinación de las LDL- colesterol se utilizó la fómula de Friedewald: permite derivar el valor de la concentración de LDL-c a partir de la concentración de colesterol total, la de triglicéridos y la de HDL-colesterol, magnitudes todas ellas de más fácil medida
que el LDL-c.
Fórmula para la determinación de LDL colesterol.
LDL-c = Colesterol total – HDl-colesterol – VLDL-colesterol ( TG / 5 o TG / 2, 17)
e. Determinación de LDL oxidada. Inmunoensayo enzimático para la determinación de anticuerpos frente a las LDL oxidadas en suero humano. Para esta
determinación, se utilizó el kit OLAB anti oxidised LDL de Biomédica. Añadimos 200 µL de tampón de ensayo en los pocillos de la placa incluyendo el
blanco y 20 µL de la pre-dilución (1:5) de estándar/muestra/control en cada
pocillo excepto el blanco. Cubrimos bien la placa e incubamos a 37 ºC durante 1,5 horas. Transcurrido el tiempo, lavamos los pocillos con tampón de lavado diluido y añadimos 100 µL de conjugado en cada pocillo. Cubrimos bien
la placa e incubamos a temperatura ambiente (18-26 ºC) durante 30 minutos.
Lavamos y añadimos 100 µL de sustrato en cada pocillo e incubamos durante
15 minutos a temperatura ambiente. Añadimos 50 µL de solución stop y finalmente medimos la absorbencia a 450 nm en un lector de placas.
4.2.1.2. PARÁMETROS MARCADORES DE INFLAMACIÓN
a. Determinación de proteína C reactiva. Se utilizó la técnica de inmunoanálisis turbidimétrico de aglutinación. La muestra se coloca en una solución tampón y se mezcla con una suspensión de anticuerpo monoclonal de CRP antihumano de ratón. La CRP se fija al anticuerpo unido al látex y se aglutina. La can-
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tidad de la difusión de luz es proporcional a la concentración de CRP presente en las muestras. Las medidas se realizaron con el autoanalizador: COBAS INTEGRA 800 de ROCHE. Rango de normalidad: 0-5 mg/dl.
b. Determinación de factores de complemento C3 y C4. Se utilizó la técnica
de nefelometría. Las proteínas contenidas en el suero humano forman en una
reacción inmunoquímica con anticuerpos específicos, inmunocomplejos los
cuales pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada depende de la concentración de la correspondiente proteína de la
muestra. La valoración se hace por comparación con un estándar de concentración conocida. Las medidas se realizaron con el nefelómetro DADE-BEHRING. El rango de normalidad para el complejo C3 es de 75-140 mg/dL y para
el C4 de 10-34 mg/dL.
c. Determinación de interleukinas
• IL-1. Kit Elisa, de Diaclone Research, para IL-1 humana. Identifica interleukina 1-beta en suero, plasma, soluciones tamponadas o cultivos celulares. El
método identifica interleukinas de origen natural (interleukinas pro y maduras) y recombinantes.
Principios del método. El kit está basado en un método ELISA en sandwich en fase sólida con un anticuerpo monoclonal específico para la interleukina 1-beta. El proceso incluye una incubación de la muestra a la que se
añade, tras el lavado, la enzima streptavidin-peroxidasa, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la reacción coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adición del sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la concentración de IL-1 presente en
las muestras analizadas.
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• IL-6. Kit ELISA, de Diaclone Research, para Interleukina-6 humana. Dicho kit
permite identificar IL-6 en suero, plasma, soluciones tamponadas y cultivos
celulares. El sistema reconoce IL-6 natural y recombinante.
Principios del método. El kit está basado en un método ELISA en sandwich
en fase sólida con un anticuerpo monoclonal específico para la interleukina
6. El proceso incluye una incubación de la muestra a la que se añade, tras el
lavado, la enzima streptavidin-peroxidasa, volviéndose a incubar y lavar. La
intensidad de la reacción coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adición del sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la concentración de IL-6 presente en las muestras
analizadas.
d. Determinación del factor de necrosis tumoral
• Kit ELISA, de Diaclone Research, para identificación de factor de necrosis
tumoral TNF-α humano. Identifica TNF-α en suero, plasma, soluciones tamponadas y cultivos celulares. El sistema reconoce TNF-α natural y recombinante.
Principios del método. El kit está basado en un método ELISA en sandwich
en fase sólida con un anticuerpo monoclonal específico para TNF-α. El proceso incluye una incubación de la muestra a la que se añade, tras el lavado,
la enzima streptavidin-HRP, volviéndose a incubar y lavar. La intensidad de la
reacción coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adición
del sustrato que actúa sobre la enzima ligada, es directamente proporcional
a la concentración de TNF-α presente en las muestras analizadas. La reacción
se termina mediante la adición de ácido (H2SO4) y la absorbancia se mide a
450 nm.
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4.2.1.3. PARÁMETROS
DEL
METABOLISMO OXIDATIVO
a. Determinación del contenido de grupos carbonilo en proteínas plasmáticas.
La oxidación proteica se mide por la cuantificación de los grupos carbonilo formados durante la incubación con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) en condiciones ácidas, basándose en la reacción equimolar entre ellos, según procedimiento desarrollado por Levine et al. (1980) con algunas modificaciones de Tian et
al. (1998). La DNFH unida a proteínas se cuantifica colorimétricamente
(ε373=21.10-3 M-1 cm-1 ) tras la separación de las proteínas derivatizadas por
precipitación con ácido, lavado y posterior solubilización con guanidina.
La cantidad de proteína utilizada oscila entre 0,5–1 mg/mL, añadiendo
tampón de conservación de mitocondrias hasta 1 mL de volumen final. Centrifugamos a 13.600 rpm durante 10 minutos y al sobrenadante añadimos estreptomicina sulfato 10% con tampón Hepes 50 mM pH:7,2, en una proporción
de 1/9 v/v. Centrifugamos y cogemos 200 µL del sobrenadante y añadimos 400
µL de 2,4 dinitrofenilhidracina (DNFH)10 mM /ClH 2,5 M a las muestras y 400
µL de ClH 2,5 M a los controles. Incubamos 1 hora a temperatura ambiente,
con agitación ocasional. Centrifugamos a 12.600 rpm durante 3 minutos y
añadimos 1 mL de TCA al 20%. Centrifugamos de nuevo a 12.600 rpm durante
3 minutos. Recogemos el pellet y lo lavamos 3 veces con 1 mL de etanol: acetato de etilo (1:1 v/v). Centrifugamos otra vez a 12.600 rpm durante 3 minutos y recogemos el pellet. Finalmente añadimos 1 mL de guanidina 6 N a pH:
2,3, centrifugamos a 12600 rpm y medimos el sobrenadante a una λ= 366 nm
frente a una solución de guanidina.
b. Determinación de α-Tocoferol en plasma. Se utlilizó la técnica de HPLC de
Arnaud et al., 1991. Se toman 200 µL de plasma y se mezclan con 100 µL de
etanol, se añaden 500 µl de hexano, se centrifuga y se recoge la fase orgáni-
66
c
ca, la cual se lleva a secado con N2 seco y finalmente se resuspende con 200
µL de fase movil (diclorometano/acetonitrilo/metanol, 20:70:10). Se mide a
una λ de 291 nm.
c. Tratamiento de la sangre para la determinación de GSH y de hemoglobina en
humanos. Se toma una alícuota de sangre heparinizada y se centrifuga a 3.000
rpm durante 10 minutos. Separamos el plasma y lo congelamos a -80º C. Las células se transfieren a un tubo cónico de vidrio, se le añade aproximadamente la
misma cantidad de agua MiliQ (1.5 mL células + 1.5 mL agua). Posteriormente, dejamos a 4º C durante 2 h para que se hemolice (determinación de Hemoglobina).
A 1.88 mL del hemolizado se añade 0.8 mL de mezcla cloroformo: etanol (3:5 v/v)
frío y 0.3 mL agua MiliQ. Se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos y del sobrenadante determinamos los niveles de GSH (Maral et al.,1977).
Determinación del GSH en sangre. La cuantificación del GSH se llevó a cabo
mediante la técnica de Brigelius et al. (1983), de la glutation-s-transferasa (GSHS-T). El complejo formado (GS-DNB) absorbe luz a una longitud de onda de 340
nm, siendo proporcional el cambio de extinción medido espectrofotométricamente a la cantidad de GSH presente en la muestra.
d. Determinación de TBARS en plasma. La determinación de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico se realizó mediante la técnica de Santos et
al. (1980). Pipeteamos en cada tubo 0.1 ml de plasma, y al blanco 0.1 ml de agua
miliQ. Añadimos 0.4 ml de suero salino al 0.9% a cada tubo seguido de 1 ml de
TCA 100% en HCl 0,6 N y 0,2 ml de TBA 0,12 M en TRIS 0,26 M. Agitamos los tubos en el vórtex, se tapan y se ponen a hervir en un vaso de precipitados durante 30-45 minutos. Transcurrido el tiempo, se dejan enfriar durante 15-20 minutos.
Añadimos 2 ml de agua miliQ. Agitamos en vórtex y se centrifugan a 3.000 rpm
durante 10 minutos. Se mide la absorbancia a una λ= 532 nm.
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4.2.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las distintas repeticiones enunciadas en los respectivos apartados ponen de manifiesto que se obtuvieron datos suficientes como para poder aplicar distintos
tratamientos estadísticos, los cuales se llevaron a cabo con el programa Statgraphcis Plus para Windows (Manugistics Inc, 1997).
4.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
4.3.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA
Se ha estudiado a una población de cincuenta monjas de clausura pertenecientes a tres monasterios: San Miguel de las Dueñas, Carrizo de la Ribera y Sta.
María de Gradefes, todos ellos en la provincia de León. La elección de este grupo
de población, institucionalizado y con una libertad de elección reducida en su
estilo de vida, es un clásico en los estudios epidemiológicos y de investigación
causa-efecto. En este caso, además, la población presenta unas características
que la hacen especialmente interesante: su edad media es elevada (con lo que
podemos encontrar una mayor prevalencia de determinadas enfermedades ligadas al proceso de envejecimiento y, por lo tanto, al estrés oxidativo) y su estilo de vida es ordenado, reglado y homogéneo. En los resultados del estudio
podremos ver cómo la muestra inicial quedó reducida finalmente a 29 monjas,
debido a las exclusiones y bajas producidas durante su elaboración, en la fase
cerveza y a veinticinco en la fase lúpulo.
Por el contrario, la muestra elegida ha sido difícil de seleccionar teniendo en
cuenta el reducido número de colectivos religiosos existentes en la actualidad y
de involucrar a este colectivo en un estudio dado su rechazo a recibir interven-
68
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ciones externas. Finalmente, tras una amplia búsqueda, se han elegido los tres
conventos citados.
4.3.2. DESARROLLO DEL ESTUDIO
Se ha procedido de acuerdo a las siguientes fases:
■ Fase I o inicial. Se realiza el “lavado” de alcohol, eliminando el posible consumo
de bebidas alcohólicas por completo. Duración: 30 días. Al concluir, se procede a
la toma de muestras para realizar la analítica sanguínea y se recopila una historia
dietética de cada individuo.
■ Fase II. La dieta normalizada del grupo se ha suplementado con una cantidad dia-
ria prefijada de cerveza sin alcohol (250 ml dos veces diarias), durante 45 días.
Los pacientes del estudio siguen consumiendo la dieta habitual. Transcurrido el
tiempo de suplementación, se procede a una segunda toma de muestras para analítica sanguínea.
■ Fase III. Tras un periodo de seis meses sin consumir cerveza sin alcohol ni nin-
gún otro tipo de bebida alcohólica, las integrantes del estudio son sometidas a
una nueva analítica de todos los parámetros del estudio.
■ Fase IV. La dieta normalizada del grupo se ha suplementado con lúpulo encapsu-
lado durante 30 días a razón de 2 cápsulas diarias de 200 mg cada una de ellas
conteniendo inflorescencias femeninas. Al cesar la administración de lúpulo, se
realiza una nueva toma de muestras sanguíneas y a su correspondiente analítica.
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RESULTADOS
Previamente a estos estudios en humanos, nuestro grupo de investigación ha
realizado estudios in vitro con hepatocitos aislados de rata, sometidos a un
estrés oxidativo con el antibiótico antitumoral adriamicina en presencia y ausencia de la fracción flavonoidea de la cerveza rubia y negra. Posteriormente, se han
realizado estudios in vivo, se ha determinado la biodisponibilidad de los compuestos fenólicos y actividad antioxidante total en plasma de ratas tras la administración de cerveza con y sin alcohol a diferentes tiempos. Asimismo, se sometieron las ratas a un estrés oxidativo con el antibiótico antitumoral al mismo
tiempo que se suplementó su dieta con cerveza con y sin alcohol.
En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la suplementación de la
cerveza y el lúpulo, componente de la cerveza, en un colectivo dietéticamente
controlado y su relación con el metabolismo oxidativo, parámetros indicadores
de riesgo cardiovascular y de inflamación, propios de la edad avanzada.
Tras las correspondientes pruebas y determinaciones analíticas, se han obtenido los resultados que se ofrecen a continuación en las diferentes fases de
suplementación con cerveza sin alcohol y con lúpulo. Los resultados se han realizado con muestras apareadas y expresados en porcentajes respecto a su control, estudiando los datos antes (Fase I) y después (Fase II) de la suplementación.
5.1. VALORACIÓN NUTRICIONAL Y ENERGÉTICA
En el primer grupo (n = 14), la ingestión energética media es de 2.126 Kcal./día,
en el segundo grupo (n = 22) es de 1.601 Kcal./día y en el tercer grupo (n = 14)
es de 1.750 Kcal./día. En el primer grupo, la ingestión de nutrientes cubre la
recomendación dietética (I.R.) de todos los nutrientes excepto de calcio (89%)
y de retinol (61%). La dieta realizada es ligeramente hipercalórica.
70
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En el segundo grupo, la ingestión de nutrientes cubre la recomendación dietética (I.R.) de todos los nutrientes excepto de calcio (88%), de hierro (69%), de
retinol (76%) y de ácido fólico (89%). La dieta realizada resulta ser hipocalórica,
cubriendo ésta únicamente el 85% de las necesidades diarias. En el tercer grupo,
la ingestión de nutrientes cubre la recomendación dietética (I.R.) de todos los
nutrientes excepto de retinol (68%). La dieta realizada es ligeramente hipocalórica.
La ingestión media de todos los grupos (n=50) es de un 14% en proteínas, de
un 40,5% en lípidos y de un 45,5% en carbohidratos (Figura 9). Asimismo, se
observa una insuficiente ingestión de fibra (14.5 g diarios de media), siendo el
origen de la energía claramente desequilibrado con un exceso de lípidos.
Figura 9. Dieta ingerida por los sujetos del estudio: valor medio de los tres grupos.
Origen de la energía diaria ingerida (Kcal. en %)
14,0% % kcal. prot
45,5% % kcal. H de C
40,5% % kcal. lip
Energía total = 1826 Kcal./día
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5.2. SUPLEMENTACIÓN DIETÉTICA: CERVEZA SIN ALCOHOL
Los resultados se han obtenido en un colectivo de monjas de clausura a las que se
les suplementó diariamente su dieta con 500 ml de cerveza sin alcohol (de fabricación española). Se realizó con cerveza sin debido a que este colectivo suele ser de
edad avanzada que toma medicamentos en los que el alcohol está contraindicado.
La suplementación tuvo lugar durante un periodo de 45 días sin que se ordenara
modificación dietética alguna en paralelo. La dieta de las monjas de clausura era la
que seguían motu propio de forma habitual.
5.2.1. METABOLISMO OXIDATIVO: DAÑO A MACROMOLÉCULAS
En este estudio hemos valorado la capacidad del aporte suplementario de cerveza
sin alcohol en un colectivo de humanos y hemos determinado los niveles de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) y contenido en grupos
carbonilo antes y después de la suplementación, puesto que es uno de los mejores
indicadores de daño oxidativo.
El daño oxidativo a lípidos se evaluó mediante la producción de TBARS en plasma, puesto que son productos formados directamente en la reacción de peroxidación lipídica, responsable de la mayoría de los efectos fisiopatológicos relacionados
con el estrés oxidativo. En la tabla 2 podemos observar que los valores medios de
TBARS antes de la suplementación con cerveza sin alcohol (40,59 ± 8,41) respecto
a (33,34 ± 6,20) después de la suplementación. Cuando expresamos los resultados
en porcentajes respecto a su control se produce una disminución significativa de un
16% (p<0,005) (Figura 10).
Cuando determinamos el contenido en grupos carbonilo, observamos que los
valores medios previos a la suplementación son de 4,04 ± 0,79 respecto a 3,32 ±
0,66 después del suplemento con cerveza sin alcohol (Tabla 2). Si expresamos los
72
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resultados en porcentaje se observa una diferencia significativa de un 18% con
p<0,005 después del periodo de suplementación (Figura 10), resultados que ponen
de manifiesto el efecto que está ejerciendo la cerveza sobre el daño inducido a lípidos y proteínas.
Tabla 2. Niveles medios de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico procedentes de la peroxidación lipídica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo (GC).
Parámetros
Valores medios
Cerveza sin alcohol
TBARS (nmol/mL plasma)
Grupos Carbonilo (nmol/mg prot)
Fase I
Fase II
40,59 ± 8,41
4,04 ± 0,79
33,34 ± 6,20
3,32 ± 0,66
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con cerveza sin alcohol.
Figura 10. Niveles de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico procedentes de la peroxidación lipídica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo de
las proteínas (GC) antes y después de la suplementación con cerveza sin alcohol.
TBARS (nmol/mL plasma)
(84)**
GC (nmol/mL prot.)
(82)**
% Respecto a su control
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
**P<0.005 – Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
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i
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5.2.2. DEFENSA ANTIOXIDANTE: NIVELES DE GLUTATION REDUCIDO
Y α-TOCOFEROL
En primer lugar, determinamos los niveles de glutation eritrocitario antes y después de la suplementación. Su principal papel lo ejerce a través de una acción
como barredor (scavenger) de los radicales libres ya formados. Su disminución,
por lo tanto, nos indica una formación excesiva de radicales oxigénicos que precisan ser contrarrestados con el consiguiente aumento en el consumo orgánico
de este antioxidante.
En los resultados, podemos observar (Tabla 3) que los valores medios de glutation previos a la suplementación son de 1,30 ± 0,29 respecto a 1,71 ± 0,18
obtenidos después de la suplementación. Cuando determinamos los porcentajes,
observamos que se produce un aumento significativo de un 21%, p<0,005 respecto a su control (Figura 11).
La vitamina E, en su forma de α-tocoferol, es un antioxidante natural que
actúa en fase lipídica. Cuando observamos los resultados medios obtenidos en
nuestro estudio, vemos como antes de la suplementación la cifra era de 60,95
± 13,33, siendo finalmente de 66,94 ± 11,69, lo que representa una variación
del 12% (Figura 11).
Tabla 3. Niveles medios de glutation (GSH) y α-tocoferol antes y después de la suplementación con cerveza sin alcohol.
Parámetros
Cerveza sin alcohol
GSH (µmol/g Hb)
α-tocoferol (nmol/ml plasma)
Valores medios
Fase I
Fase II
1,30 ± 0,29
60,95 ± 13,33
1,71 ± 0,18
66,94 ± 11,69
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con cerveza sin alcohol.
74
c
Figura 11. Niveles de glutatión y a-tocoferol antes y después de la suplementación
con cerveza sin alcohol.
GSH (µmol/g Hb)
(121)**
α-tocoferol (nmol/ml plasma)
(112)**
% Respecto a su control
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
**P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
5.2.3. METABOLISMO LIPÍDICO
Respecto al metabolismo lipídico, hemos determinado los niveles medios antes
(Fase I) y después de la suplementación (Fase II) (Tabla 4) de los diferentes parámetros estudiados: triglicéridos, colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol y
LDL oxidada. Asimismo, hemos estudiado separadamente los datos del colesterol
total de aquellos sujetos que eran superiores a los 240 mg/dL.
En lo referente a los niveles de triglicéridos, los resultados obtenidos nos permiten observar (Figura 12) cómo no se producen cambios significativos al final del
periodo de suplementación. Asimismo, tampoco se observan cambios en los niveles de colesterol total; sin embargo, cuando los niveles de colesterol en los sujetos del estudio eran superiores a 240 mg/dL, sí que observamos una disminución
75
i
n
c
o
c
i
n
c
o
significativa (Figura 12) del colesterol total (un 6% con una p<0,05 y unos valores medios iniciales de 265,42 ± 13,53 y de 251,83 ± 19,57 al final del periodo)
tras el periodo de suplementación, lo que nos indicaría que la cerveza sin alcohol
está ejerciendo un efecto sobre la hipercolesterolemia.
No se producen modificaciones significativas en las cifras de HDL-c (Figura 13)
ni en las de LDL-c. Sin embargo, se observa una disminución de un 8% (p< 0,05)
en el caso de la LDL-c oxidada. Esto nos indica que la cerveza sin alcohol protege
a las LDL de su oxidación, lo que puede tener interés dado que se trata de un
importante factor de riesgo en la patología cardiovascular.
Tabla 4. Suplementación con cerveza sin alcohol: Niveles medios de triglicéridos,
colesterol total, HDL-c, LDl-c y LDL oxidada.
Parámetros
Cerveza sin alcohol
Triglicéridos
(mg/dL)
Colesterol
(mg/dL)
Colesterol > 240
(mg/dL)
HDL
(mg/dL)
LDL
(mg/dL)
LDLoxidada
(mU/mL)
Valores medios
Fase I
Fase II
93,07 ± 57,30
96,96 ± 37,42
236,79 ± 31,93
236,74 ± 30,21
265,42 ± 13,53
251,83 ± 19,57
75,46 ± 17,28
74,04 ± 19,18
146,00 ± 31,18
147,08 ± 27,35
898,59 ± 192,00
883,84 ± 175,50
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con cerveza sin alcohol.
76
c
Figura 12. Determinación de los niveles de triglicéridos, colesterol total y colesterol > 240 mg/dL antes y después de la suplementación con cerveza sin alcohol.
% Respecto a su control
Col Total (mg/dL) Col Total > 240 (mg/dL)
(100)
(94)*
TG (mg/dL)
(100)
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
*P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
Figura 13. Determinación de los niveles de HDL colesterol, LDL colesterol y LDL oxidada antes y después de la suplementación con cerveza sin alcohol.
% Respecto a su control
HDL (mg/dL)
(98)
LDL (mg/dL)
(95)
LDLox (mU/mL)
(92)*
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
*P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
77
i
n
c
o
c
i
n
c
o
5.2.4. PARÁMETROS DE INFLAMACIÓN
Se ha procedido a determinar los parámetros correspondientes a los complementos C3 y C4, la proteína C reactiva (PCR), las interleukinas 1-α y 6 y el factor de
necrosis tumoral (TNF-α). Todos estos datos están disponibles en la Tabla correspondiente (Tabla 5) así como en las figuras (Figuras 14, 15).
Tabla 5. Valores medios de los complementos C3 y C4, la proteína C reactiva (PCR),
las interleukinas 1-α y 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-α)
Parámetros
Cerveza sin alcohol
C3 (mg/dl)
C4 (mg/dL)
PCR (mg/dL)
IL-1-α (pg/mL)
IL-6_ (pg/mL)
TNF-α (pg/mL)
Valores medios
Fase I
Fase II
109,04 ± 17,61
21,67 ± 6,09
2,34 ± 1,78
103,93 ± 40,25
3,58 ± 1,58
20,14 ± 5,24
111,74 ± 18,43
21,78 ± 6,04
2,89 ± 1,94
101,87 ± 40,99
3,62 ± 2,02
23,48 ± 5,14
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con cerveza sin alcohol.
No se han encontrado modificaciones significativas, en las diferentes fases, de
estos parámetros. Únicamente cabría destacar el aumento (no significativo) de la
interleukina 6 (un 17% para valores medios iniciales de 3,58 ± 1,58 y de 3,62 ±
2,02 tras la suplementación) y del factor de necrosis tumoral (un 11% para valores iniciales de 20,14 ± 5,24 y de 23,48 ± 5,14 tras la suplementación).
78
c
Figura 14. Niveles de los factores C3, C4 del complemento y PCR antes y después
de la suplementación con cerveza sin alcohol.
% Respecto a su control
C3 (mg/dL)
(101)
C4 (mg/dL)
(99)
PCR (mg/dL)
(102)
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
Figura 15. Niveles de las interleukinas 1-α, 6 y TNF-α antes y después de la suplementación con cerveza sin alcohol
% Respecto a su control
IL-1α (pg/mL)
(99)
IL6 (pg/mL)
(117)
TNF-α (pg/mL)
(111)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
79
i
n
c
o
c
i
n
c
o
5.3. SUPLEMENTACIÓN DIETÉTICA: LÚPULO
Los resultados se han obtenido en un colectivo de monjas de clausura a las que se
les suplementó diariamente su dieta con lúpulo (dos cápsulas de 200 mg cada una
conteniendo las inflorescencias femeninas). La suplementación tuvo lugar durante un periodo de 30 días.
Las correspondientes analíticas sanguíneas nos han permitido estudiar las posibles variaciones de parámetros relacionados con el metabolismo oxidativo, lipídico y parámetros de inflamación.
5.3.1. METABOLISMO OXIDATIVO: DAÑO A MACROMOLÉCULAS
Durante la realización de este trabajo, hemos valorado el efecto del aporte suplementario de lúpulo en un colectivo de humanos, determinando para ello los niveles de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) así como
el contenido en grupos carbonilo antes y después de la suplementación, ya que se
trata de uno de los mejores indicadores del daño oxidativo.
El daño oxidativo a lípidos se evaluó mediante la producción de TBARS en plasma, puesto que son productos formados directamente en la reacción de peroxidación lipídica, responsable de la mayoría de los efectos fisiopatológicos relacionados con el estrés oxidativo. En la tabla 6 podemos observar que los valores de
TBARS antes de la suplementación con lúpulo eran de 37,45 ± 5,61 respecto a un
valor de 31,29 ± 5,61 después de la suplementación. Cuando expresamos los resultados en porcentajes respecto a su control, se produce una disminución significativa de un 15% (p<0,005) (Figura 16).
Cuando determinamos el contenido en grupos carbonilo, observamos que los
valores medios previos a la suplementación eran de 1,69 ± 0,84 respecto a 1,42 ±
0,53 después del suplemento con cerveza sin alcohol (Tabla 6). Si expresamos los
80
c
resultados en porcentaje, se observa una diferencia significativa de un 17% con
p<0,005 después del periodo de suplementación (Figura 16). Éstos ponen de manifiesto el efecto que está ejerciendo el lúpulo soble el daño inducido a lípidos y proteínas.
Tabla 6. Niveles medios de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico procedentes de la peroxidación lipídica (TBARS) y del contenido de grupos carbonilo (GC) antes y después de la suplementación con lúpulo
Parámetros
Valores medios
lúpulo
TBARS (nmol/mL plasma)
GC (nmol/mg prot)
Fase I
Fase II
37,45 ± 5,61
1,69 ± 0,84
31,29 ± 5,61
1,42 ± 0,53
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con lúpulo.
Figura 16. Niveles de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico procedentes de la peroxidación lipídica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo de
las proteínas (GC) antes y después de la suplementación con lúpulo.
TBARS (nmol/mL plasma)
(85)**
GC (nmol/mg prot.)
(83)**
% Respecto a su control
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
**P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
81
i
n
c
o
c
i
n
c
o
5.3.2. DEFENSA ANTIOXIDANTE
Hemos procedido a la determinación de glutation eritrocitario antes y después de
la suplementación. El papel principal lo ejerce a través de su acción como scavenger de radicales libres. Consecuentemente, su disminución nos indicará una formación excesiva de radicales oxigénicos con el consiguiente aumento del consumo de
antioxidantes.
Como podemos observar en los resultados, (Tabla 7) los valores medios previos
a la suplementación son de 1,51 ± 0,31 respecto a 1,72 ± 0,49 después de la suplementación. Expresado en porcentaje, comprobamos que se produce un aumento
significativo de un 16%, p<0,005 respecto a su control (Figura 17).
Respecto a los niveles plasmáticos de α-tocoferol observamos los resultados
medios (Tabla 7), identificamos unas cifras iniciales de 56,97 ± 10,05 con respecto a unas cifras finales de 63,25 ± 10,48. En consecuencia, el cambio global es del
13% (p<0.005), lo que señala un ahorro en el consumo orgánico de sustancias
antioxidantes como el α-tocoferol (Figura 17).
Tabla 7. Niveles medios de glutation (GSH) y α-tocoferol antes y después de la suplementación con lúpulo.
Parámetros
lúpulo
GSH (µmol/g Hb)
α-Tocoferol (nmol/ml plasma)
Valores medios
Fase I
Fase II
1,51 ± 0,31
56,97± 10,05
1,72 ± 0,49
63,25 ± 10,48
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con lúpulo.
82
c
Figura 17. Niveles de glutation y α-tocoferol antes y después de la suplementación
con lúpulo.
GSH (µmol/g Hb)
(116)**
α-tocoferol (nmol/ml plasma)
(113)**
% Respecto a su control
140
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
**P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
5.3.3. METABOLISMO LIPÍDICO
Es factible consultar los niveles medios antes y después de la suplementación (Tabla
8) de todos los parámetros estudiados: triglicéridos, colesterol total, HDL-colesterol,
LDL-colesterol y LDL oxidada.
En lo que respecta a los triglicéridos (Figura 18), los valores iniciales medios
(90,56 ± 24,41 mg/dL) se convierten en 75,35 ± 22,86 tras el periodo de suplementación lo que representa una disminución del 16% (p<0.005). En lo que respecta al
colesterol total, las cifras iniciales (218,48 ± 34,09) pasan a ser finalmente de 211,00
± 32,41, lo que significa una disminución del 3% (p<0.05).
Se modifican, asimismo, las cifras de HDL-c (Figura 19) (valores iniciales de 72,56
± 12,09 y finales de 70,96 ± 12,97), lo que no conlleva una variación significativa
estadísticamente), de LDL-c (valores iniciales de 127,80 ± 32,50 y finales de 124,97
83
i
n
c
o
i
n
c
o
± 29,28), lo que conlleva una disminución del 3% (p<0,05). Respecto a los niveles
de anticuerpos frente a las LDL oxidadas, observamos unos valores medios iniciales
700 ± 464 y finales de 602 ± 406, lo que implica, cuando expresamos los resultados
en muestras apareadas y porcentajes respecto a su control, una disminución significativa de un 18% (p<0,005) (Figura 19).
Tabla 8. Niveles medios de triglicéridos, colesterol total, HDL-c, LDL-c y LDL oxidada
antes y después de la suplementación con lúpulo.
Parámetros
Valores medios
lúpulo
Triglicéridos (mg/dL)
Colesterol (mg/dL)
HDL (mg/dL)
LDL (mg/dL)
LDLoxidada (mU/mL)
Fase I
Fase II
90,56 ± 24,41
218,48 ± 34,09
72,56 ± 12,09
127,80 ± 32,50
700 ± 464
75,35 ± 22,86
211,00 ± 32,41
70,96 ± 12,97
124,97 ± 29,28
602 ± 406
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con lúpulo.
Figura 18. Determinación de los niveles de triglicéridos y colesterol total antes y
después de la suplementación con lúpulo.
TG (mg/dL)
(84)**
Col Total (mg/dL)
(97)**
120
% Respecto a su control
c
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
**P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
84
c
Figura 19. Determinación de HDL colesterol, LDL colesterol y LDL oxidasa antes y
después de la suplementación con lúpulo.
HDL (mg/dL)
(98)
LDL (mg/dL)
(97)*
LDLox (mU/mL)
(82)*
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
*P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
5.3.4. PARÁMETROS DE INFLAMACIÓN
Se ha procedido a determinar como marcadores de inflamación los complementos C3 y C4, la proteína C reactiva (PCR), las interleukinas 1-a y 6 y el factor de
necrosis tumoral (TNF-a).
Los parámetros estudiados reflejan modificaciones en el caso de los factores
de complemento C3 (con unos valores iniciales de 121,60 ± 17,30 y unos valores finales de 106,44 ± 13,40) y C4 (con unos valores iniciales de 19,00 ± 7,50
y unos valores finales de 20,00 ± 1,41),(Tabla 9). Cuando expresamos los resultados en porcentajes podemos observar una disminución significativa de un
12%, no siendo significativa (p<0,005) para el C3, ni para el C4 (Figura 20).
85
i
n
c
o
c
i
n
c
o
Destacamos como más significativo lo ocurrido en el caso de la proteína C
reactiva (con unos valores iniciales de 3,83 ± 2,63 y unos valores finales de
2,935 ± 1,57), con una disminución (Figura 20) de un 31% (p<0.005).
La interleukina 6 (con unos valores iniciales de 2,91 ± 0,85 y unos valores
finales de 2,42 ± 0,64) disminuye sus tasas (Figura 21) en un 13% (p<0.005).
En el caso de la interleukina 1 (con unos valores iniciales de 77,02 ± 16,28
y unos valores finales de 77,58 ± 10,99) y del factor de necrosis tumoral (con
unos valores iniciales de 21,29± 9,4 y unos valores finales de 21,63 ± 6,02), no
se han producido cambios significativos (Figura 21).
Tabla 9. Valores medios de los complementos C3 y C4, la proteína C reactiva
(PCR), interleukinas IL 1- α e IL 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-α) antes y después de la suplementación con lúpulo.
Valores medios
Parámetros
lúpulo
C3 (mg/dL)
C4 (mg/dL)
PCR (mg/dl)
IL 1 - α (pg/mL)
IL-6 (pg/mL)
TNF - α (pg/mL)
Fase I
Fase II
121,60 ± 17,30
19,00 ± 7,50
3,83 ± 2,63
77,02 ± 16,28
2,91 ± 0,85
21,29± 9,4
106,44 ± 13,40
20,00 ± 1,41
2,935 ± 1,57
77,58 ± 10,99
2,42 ± 0,64
21,63 ± 6,02
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y después (Fase II) de la
suplementación con lúpulo.
86
c
Figura 20. Niveles del factor C3, C4 del complemento y de la proteína C reactiva antes y después de la suplementación con lúpulo.
C3 (mg/dL)
(88)**
C4 (mg/dL)
(104)
PCR (mg/dL)
(69)*
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
*P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
**P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
Figura 21. Niveles de interleukina 1- α, interleukina 6 y TNF-α antes y después de
la suplementación con lúpulo.
IL-1α (pg/mL)
(99)
IL-6 (pg/mL)
(87)*
TNF-α (pg/mL)
(104)
120
100
80
60
40
20
0
Fase I
Fase II
Diseño experimental en material y métodos.
Los resultados están expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el cálculo de la
significancia estadística se aplicó el test de la t de Student para muestras apareadas.
*P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y después de la suplementación (Fase II).
87
i
n
c
o
c
i
n
c
o
5.4. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA SUPLEMENTACIÓN
CON CERVEZA SIN ALCOHOL Y LÚPULO
En este estudio hemos puesto en evidencia el efecto de la cerveza sin alcohol y
del lúpulo sobre los diferentes parámetros medidos. Cuando hacemos la correlación entre los resultados analíticos obtenidos tras la suplementación con cerveza sin alcohol y con lúpulo (Tabla 10) observamos diferencias que son significativas en varios de los parámetros considerados.
Así ocurre en los niveles de triglicéridos y en los parámetros marcadores de
inflamación. En el primer caso, la diferencia es claramente significativa (con una
p<0,005). En lo que respecta a los datos de inflamación, existen también diferencias en lo relativo al factor C3 del complemento (p<0,005) y a la proteína C
reactiva (p<0,005), siempre y en todos los casos de forma favorable al lúpulo.
Sin embargo, en lo que respecta a la posible aplicación práctica de estos
resultados, lo más sencillo parece decantarse hacia el uso de la cerveza sin alcohol dada la facilidad de su consumo y el volumen que puede ingerirse de la
misma sin incomodidad. Además, no presenta prácticamente contraindicaciones
en su ingestión por parte de adultos de todas las edades. Por el contrario, el
lúpulo únicamente podría formar parte de la dieta en su presentación farmacéutica (cápsulas, etc.) lo que restringiría sin duda su uso.
En cualquier caso, dada la cantidad de lúpulo presente en la cerveza (y, por
lo tanto, de sus principios activos), es probable que las consecuencias de la
ingestión de esta bebida sobre la fisiología se deban más a componentes derivados de los cereales que a los del propio lúpulo, aun siendo estos importantes.
Esto no obsta para que sea posible y aún recomendable aumentar la capacidad
antioxidante de las cervezas recurriendo a diferentes técnicas cerveceras y a
lúpulos especialmente seleccionados con este fin.
88
c
Tabla 10. Estudio comparativo entre la cerveza sin alcohol y el lúpulo.
Metabolismo oxidativo
TBARS
ND
Grupos carbonilo
ND
GSH
ND
α-tocoferol
ND
Metabolismo lipídico
Colesterol total
ND
Triglicéridos
P<0,005
HDL-c
ND
LDL-c
ND
LDLoxidada
ND
Parámetros de inflamación
C3
P<0,005
C4
ND
PCR
P<0,005
IL-1α
ND
IL-6
ND
TNF-α
ND
Se reflejan en la Tabla lo significativo de la diferencia entre las determinaciones del Estudio tras la suplementación con
cerveza sin alcohol y lúpulo.
ND: diferencia no significativa.
89
i
n
c
o
s
e
i
s
DISCUSIÓN
En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la suplementación de la dieta,
tanto con cerveza sin alcohol como con cápsulas de lúpulo (Elusan®), en un colectivo dietéticamente controlado, y su relación con el metabolismo oxidativo, y con
parámetros indicadores de riesgo cardiovascular y de inflamación propios de la edad
avanzada.
De los resultados de nuestro trabajo se deduce un papel antioxidante in vivo de
la cerveza sin alcohol y del lúpulo. La primera consecuencia que se deriva de ello es
que los posibles beneficios obtenidos del consumo moderado de ciertas bebidas alcohólicas fermentadas (cerveza, vino, sidra) que se han referido en estudios anteriores, no se deben exclusivamente a la presencia del alcohol en estas bebidas, si bien
están documentados los efectos específicos del alcohol sobre ciertos parámetros,
como por ejemplo sobre los marcadores de inflamación en adultos sanos (Mulkamal,
2004). Existen otros compuestos, como los polifenoles y las melanoidinas, en el caso
de la cerveza, que son responsables, al menos, de una parte significativa de sus efectos. Es decir, el consumo moderado de las versiones sin alcohol de estas bebidas, en
el contexto de una dieta variada y equilibrada, puede tener un efecto beneficioso
ante el estrés oxidativo y patologías relacionadas.
El envejecimiento es un proceso degenerativo, en el cual participan los radicales
libres, y por ello relacionado con patologías tales como problemas cardiovasculares,
trastornos neurológicos, procesos inflamatorios, hipertensión, diabetes, cáncer, etc.,
en las que también está implicado el estrés oxidativo (Dalle-Donne et al., 2006,
Sarkar y Fisher, 2006).
6.1. METABOLISMO OXIDATIVO
En lo que respecta a los datos obtenidos en este estudio, tras la suplementación
con cerveza sin alcohol se produce una disminución significativa en el daño indu-
90
s
cido a macromoléculas: lípidos y proteínas, y un aumento significativo en la defensa antioxidante: niveles de glutation reducido (GHS) y alfa-tocoferol. Dichos resultados obtenidos en humanos están corroborados por otros estudios realizados en
nuestro grupo, en experimentación animal, con suplementos de cerveza y extractos
flavonoideos de la harina de la semilla de uva tras la inducción de un estrés oxidativo a consecuencia de la adriamicina (González-SanJosé et al., 2001; Valls et al.,
2005) y a los obtenidos por otros autores (Navarro, 2003; Ameen, 2004; Sahin,
2004; Husain, 2005). Cuando suplementamos con lúpulo obtenemos resultados
similares a los de la cerveza, lo que nos indica que existen compuestos con actividad antioxidante que se encuentran específicamente en esta leguminosa.
Hay evidencias de que, en animales, los flavonoides se localizan cerca de la
superficie de la membrana lipídica para captar los radicales libres y por ello, previenen a ésta de la peroxidación lipídica a consecuencia de radicales oxigénicos acuosos (Terao, 1994). Además, parece demostrada la hipótesis (Verstraeten, 2003) de
que las proantocianidinas, precisamente uno de los flavonoides más abundante en
la cerveza, podrían ser absorbidas por las membranas celulares, creándose así un
medio que limitaría el acceso a las especies radicales a la membrana así como su
consiguiente propagación.
Esta relación entre el consumo de alimentos o bebidas ricas en polifenoles y el
aumento significativo de la capacidad antioxidante del plasma y del contenido de
polifenoles en el mismo (Serafini, 1998; Wang, 2000; Rechner, 2002) ha sido previamente documentado por diversos autores, incluyendo su capacidad de inhibir la
peroxidación lipídica y de captar radicales libres como el radical hidroxilo, ión supéroxido y radical alcoxilo (Sichel y col., 1991). De hecho, los efectos de la ingestión
de alimentos ricos en compuestos fenólicos, como fresas, espinacas, vino tinto, cerveza, etc., se pueden evaluar a corto plazo ya que aumentan de forma evidente la
capacidad antioxidante del suero (Cao y col., 1998; Velioglu y col., 1998; Kähkönen
y col., 1999), lo que explica en definitiva el creciente interés científico por el papel
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dietético de alimentos y bebidas ricos en estos compuestos (Hertog y col., 1995).
Dentro de las bebidas que contienen polifenoles hay que destacar la cerveza,
cuya actividad antioxidante global oscila entre unos valores mínimos y máximos
comprendidos en el intervalo 2-56 mg según la capacidad antioxidante equivalente a la vitamina C (CEAC). Estos resultados indican que se trata de una bebida con
una capacidad antioxidante global significativa, ya que posee valores similares a
otras bebidas alcohólicas, como el vino, y no alcohólicas, como el mosto. De los
estudios realizados se desprende que el tipo de cerveza no influye en el poder antioxidante, ya que cervezas negras, rubias y sin alcohol presentan valores similares
(González San José et al., 2001).
Cuando nos referimos a la capacidad antioxidante de los polifenoles de la cerveza sin alcohol, es habitual referirse al problema de su biodisponibilidad. En nuestro caso, esta absorción de los polifenoles viene corroborada por trabajos anteriores de nuestro mismo grupo y de otros realizados con cerveza con y sin alcohol. Así,
sabemos que los polifenoles junto con alcohol pasan más rápidamente al plasma
que cuando proceden de un producto sin alcohol (Lee, 1995; Unno, 1996; Hollman
y Katan, 1998; Kivits, 1997; Aziz, 1998; Williamson, 2000). Evaluando la capacidad
antioxidante total del plasma en diferentes tiempos (30, 60 y 90 minutos) tras la
suplementación con un concentrado de cerveza a animales de experimentación
(Valls et al., 2004), se observaba que la actividad antioxidante total era significativamente mayor a los 90 minutos de la ingestión de la cerveza.
Estos datos están en concordancia con los datos aportados por Miyagi y colaboradores y Giselli y colaboradores los cuales han demostrado que la cerveza sin
alcohol muestra una ligera tendencia a incrementar la actividad antioxidante a los
90 minutos. Sin embargo, durante los primeros 30 minutos, al igual, que ocurre en
otros estudios, no existen diferencias entre cerveza con alcohol o sin alcohol. A
los 60 minutos hay un menor aumento para la actividad cuando la cerveza es sin
alcohol, pero la actividad se recupera e, incluso, aumenta a partir de los 90 minu-
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tos (Miyagi, 1997; Ghiselli, 2000; Gorinstein, 2004). Nardini et al. encontraron que
esta absorción de ácidos fenólicos se realiza mediante conjugación, dependiendo
su grado de la forma química de estos polifenoles: los monohidroxiderivados requieren una conjugación menos intensa que los dehidroxiderivados (Nardini et al.,
2006).
6.2. METABOLISMO LIPÍDICO
La consecuencia clínica del aumento de lípidos en sangre está relacionada con la
posibilidad de desarrollo de lesión vascular. De hecho, el daño vascular puede
tener un profundo impacto sobre distintas funciones orgánicas y acabar produciendo numerosas patologías vinculadas a la edad (diabetes, aterosclerosis,
hipertensión, etc.). Las células endoteliales de los vasos, debido a su localización, son especialmente vulnerables a las sustancias circulantes agresivas como,
por ejemplo, las macromoléculas oxidadas y las citoquinas proinflamatorias. La
disfunción endotelial puede aumentar cuando el estrés oxidativo reduce la disponibilidad de óxido nítrico (NO), siendo este un factor esencial para el adecuado tono vascular.
En nuestro estudio, observamos que en los niveles de triglicéridos no se producen cambios significativos tras el periodo de suplementación con cerveza sin
alcohol. Tampoco se observaron cambios en los niveles de colesterol total, excepto cuando los niveles de colesterol en los sujetos eran superiores a 240 mg/dL, sí
podíamos observar una disminución significativa de un 6%, lo que nos indicaría
que la cerveza sin alcohol está ejerciendo un efecto sobre la hipercolesterolemia.
Resultados que vienen corroborados por otros estudios (Gasowski et al., 2004,
Winkler et al., 2006). Para algunos autores, su efecto sería incluso similar al del
vino tinto (Kondo, 2004).
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En este punto hay que señalar que Degrace et al., en 2006, afirma que dosis
moderadas de cerveza ingeridas de forma continuada podía tener un efecto beneficioso frente al desarrollo de la aterosclerosis (Degrace et al., 2006).
Adicionalmente a los niveles elevados de colesterol sanguíneo, la presencia de
LDL oxidada se ha revelado como la clave del desarrollo de la aterosclerosis (Podrez
et al., 2000). Las lipoproteínas oxidadas se han vinculado con la formación de superóxidos.
Respecto a los niveles de LDL oxidada, sí que se observaba con la suplementación con cerveza sin alcohol una disminución de un 8% respecto a su control
(p<0,05). Esto nos podría indicar que la cerveza sin alcohol protege a las LDL de su
oxidación, lo que puede tener interés dado que esta lipoproteína es un importante
factor de riesgo en la patología cardiovascular.
No conviene olvidar que la capacidad antioxidante de la cerveza sobre las lipoproteínas es mayor que cuando se estudia este efecto con polifenoles extraídos de
la cerveza, lo que sugiere una posible sinergia entre las sustancias naturalmente
presentes en la bebida, como podrían ser el caso de los folatos (Vinson et al.,
2003).
Cuando suplementamos con lúpulo, pudimos observar una disminución significativa (p<0,005) en los niveles de triglicéridos y en el colesterol total (p<0,05).
Este hallazgo ha sido confirmado por otros autores, como Shimura, que realizaron
estudios utilizando animales de experimentación y comprobando en ellos cómo el
lúpulo reducía los niveles de triglicéridos plasmáticos (Shimura et al., 2005), sugiriendo incluso que este efecto podría deberse a la acción reguladora del lúpulo
sobre la expresión de genes implicados en la oxidación hepática de los lípidos.
Las lipoproteínas HDL-c no experimentaban modificaciones significativas, pero
sí es cierto que en lo que respecta a las LDL-c hay una disminución significativa
(p<0,05) del 3% que llega hasta el 18% cuando se considera a la LDL oxidada
(p<0,005). En experimentación animal, este efecto no se ha confirmado por otros
autores que sí lo han hecho en relación con el efecto sobre las HDL-c incremen-
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tando sus concentraciones (Miura et al., 2005) o, más genéricamente, mejorando el
metabolismo lipídico (Kondo, 2004).
A este respecto, recordemos que es conocida la habilidad de los polifenoles para
reducir la sensibilidad de los lípidos a la oxidación. Así, la ingestión de zumo de uva
ha demostrado que reduce la susceptibilidad de la LDL a oxidarse en pacientes con
enfermedad coronaria (Stein et al., 1999). También hay evidencias concluyentes, in
vitro, del efecto del extracto de vino tinto, vino blanco, mosto y cerveza sobre la
inhibición de la oxidación de la LDL-c (Puddey et al., 1998), una inhibición que es
proporcional al contenido de polifenoles de las bebidas citadas y que coincide con
la hallada por otros autores que detallaron la inhibición de la oxidación de la LDL
por el resveratrol (Frankel et al., 1993). Hemos hallado referencias al posible efecto positivo de diferentes tipos de cerveza, incluyendo las cervezas sin alcohol, sobre
ciertos parámetros del metabolismo lipídico (Winkler et al., 2006).
También en este caso se plantean discordancias al haberse publicado estudios
donde no se observaban modificaciones en la oxidación de la LDL pese a la ingestión de polifenoles (Zenebe et al., 2003).
Esto nos hace suponer que el efecto de los polifenoles sobre la oxidación de la
LDL puede variar en función de su estructura, el tipo de dieta, la dosis ingerida y
otros factores aún no bien conocidos.
A este respecto, los estudios epidemiológicos han mostrado una correlación inversa entre el contenido en polifenoles de la dieta y un menor riesgo de enfermedades
cardiovasculares (Ulbricht y Southgate, 1991; Curin y Andriantsitohaina, 2005).
6.3. PARÁMETROS MARCADORES
DE INFLAMACIÓN
En personas de edad avanzada se han observado, en plasma, concentraciones
más elevadas de sustancias como las interleukinas (IL-1, IL-6) y el factor de
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necrosis tumoral (TNF) que en el de personas más jóvenes (Pedersen et al.,
2000).
En nuestro trabajo, observamos que no se producen cambios significativos en
los factores de complemento (C3 y C4), proteína C reactiva (PCR), interleukinas
1-α y 6 y factor de necrosis tumoral (TNF-α), tras la suplementación con cerveza sin alcohol.
Cuando la suplementación la realizamos con lúpulo, los parámetros estudiados reflejan modificaciones en el caso de los factores de complemento C3 y C4,
significativamente (p<0,005) en el caso del C3, con una disminución del 12%, y
no significativamente en el C4. Más significativo aún es lo ocurrido en el caso
de la proteína C reactiva, la cual disminuye en un 31% (p<0,005). La interleukina 6 disminuye sus tasas en un 13% (p<0,005) sin que haya cambios apreciables en el resto de los parámetros. Los polifenoles pueden disminuir algunos
marcadores de inflamación como son TNF-α, IL-1 e IL-6 (Eugui et al., 1993) o
aumentar los antagonistas de ciertos receptores como los de IL-1 (Waters et al.,
1993). También que la suplementación mediante extractos vegetales ricos en
polifenoles pueden inhibir la formación de TNF-α (Yuan et al., 2006; Zi et al.,
1997).
En relación con todo esto, sabemos desde tiempo atrás que la presencia en
la dieta de ciertos antioxidantes, entre ellos los polifenoles, puede tener una
actividad antiinflamatoria (Manthey et al., 2001), tal vez al modular la producción de óxido nítrico a partir del endotelio vascular así como por interferir en
los mecanismos de inflamación que conducirían a la disfunción endotelial (Curin
y Andriantsitohaina, 2005). De hecho, tanto la ciclooxigenasa (COX) como la
lipooxigenasa están implicadas en la liberación de ácido araquidónico, el cual es
responsable de la producción, por parte de células inflamatorias como los neutrófilos, de citoquinas como la IL-1. Algunos polifenoles, como la quercetina,
han demostrado que son capaces de inhibir la ciclooxigenasa y lipooxigenasa
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(Kim et al., 1998). Otro polifenol, como el resveratrol, pueden tener una acción
antiinflamatoria al inhibir la síntesis de prostaglandinas (Martínez y Moreno,
2000).
En lo que respecta al posible papel de la cerveza sobre los parámetros de inflamación, algunos autores afirman haber encontrado en sus estudios evidencias
suficientes (Winkler et al. en 2006 y Gasowski et al. en 2004) de su actuación.
Para Levitan et al., el efecto sobre la PCR (en forma de “U” en su representación
gráfica de la correlación inversa que se daría entre ingestión de alcohol y PCR) se
debería exclusivamente a la presencia de alcohol en la dieta, siendo además este
efecto independiente del tipo de bebida (Levitan et al., 2005). Es la misma conclusión a la que llegó Imhof en 2004 al estudiar los marcadores de inflamación en
tres diferentes regiones europeas dentro del estudio MONICA (Imhof et al., 2004).
Los datos de nuestro trabajo ponen de manifiesto que otros compuestos, diferentes al alcohol, ejercen un papel significativo sobre los marcadores de inflamación,
estando estos compuestos, principalmente contenidos en el lúpulo.
6.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE COMPARADA
DE LA CERVEZA SIN ALCOHOL Y DEL LÚPULO
Si comparamos ambos resultados, observamos como la suplementación con cerveza sin alcohol modifica los parámetros marcadores del metabolismo oxidativo
y lipídico (LDL oxidada), mientras que tras la suplementación con lúpulo se modifican, además, otros parámetros del metabolismo lipídico (triglicéridos, colesterol total y LDL), y parámetros de inflamación, tales como: factor de complemento C3, proteína C reactiva, interleukina 6.
Cuando se correlacionan ambos resultados (Tabla 10), se comprueba que la
diferencia entre ambos modos es significativa, a favor del lúpulo, únicamente en
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lo que respecta a los resultados de triglicéridos, proteína C reactiva y factor C3
del complemento.
Dichos resultados nos indican que en el caso del lúpulo, materia prima de la
cerveza, existen componentes que no se extraen en el transcurso del proceso
tecnológico de producción cervecera. Estas sustancias pueden jugar un papel
importante en determinadas patologías. En cualquier caso, las diferencias existentes entre cerveza y lúpulo no son finalmente tan considerables, teniendo en
cuenta además que se trata de un proceso de extracción, y que, por otra parte,
la cerveza es una bebida de un gran consumo y de más fácil ingestión que el
lúpulo.
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CONCLUSIONES
Basándonos en los datos obtenidos en este estudio estadístico llegamos a las conclusiones que se enumeran a continuación:
1. En las condiciones de nuestra investigación, tanto la ingestión de cerveza
sin alcohol como la de lúpulo conllevan beneficios sobre el metabolismo
oxidativo, aumentando las concentraciones de GSH y α-tocoferol y disminuyendo el daño inducido a lípidos y proteínas.
2. Respecto al metabolismo lipídico, la ingestión de cerveza sin alcohol disminuye los niveles de colesterol total (en aquellos sujetos que tenían tasas
de colesterol, al inicio, superiores a 240 mg/dL) así como los niveles de
LDL oxidada. Por su parte, el lúpulo disminuye, además, los niveles de triglicéridos, colesterol total y de las LDL colesterol.
3. En lo que se refiere a los parámetros de inflamación, la ingestión de cerveza sin alcohol no produce ningún efecto. En cambio, la suplementación
con lúpulo conlleva beneficios sobre ciertos parámetros marcadores de
inflamación, disminuyendo las concentraciones de la fracción C3 del complemento, la proteína C reactiva y la interleukina 6.
4. El consumo regular, en el contexto de una dieta equilibrada, de cerveza sin
alcohol puede ser beneficioso al disminuir alguno de los factores de riesgo
cardiovascular (LDL-oxidadas). Este beneficio puede manifestarse tanto en
el ámbito de la prevención como al incorporarse en la dieta de los pacientes dislipémicos.
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5. El efecto beneficioso sobre la salud atribuido a las bebidas tradicionales
fermentadas, y en este caso a la cerveza, no se debe únicamente a la presencia de alcohol sino, fundamentalmente, a su contenido en antioxidantes.
6. Para mejorar la capacidad antioxidante de la cerveza sin alcohol, los fabricantes deberían controlar los procesos tecnológicos para obtener una
mejor extracción de estos compuestos, con actividad oxidante, procedentes del lúpulo.
7. En una dieta adecuada, el consumo de cerveza sin alcohol por parte de
adultos sanos puede contribuir a la reducción de patologías asociadas con
la edad y, por lo tanto, conseguir un envejecimiento más saludable.
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