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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –FONACYTUNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
Caracterización de papaya criolla y papaya silvestre (Carica papaya L.)
guatemaltecas mediante la técnica de Polimorfismo de Longitud de Fragmento
Amplificado
(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)
Proyecto FODECYT 024-2007
Licda. Dinora Roche Recinos
Investigador principal
Guatemala, diciembre 2010
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de
Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONCYT-.
ii
ÍNDICE
Página
RESUMEN
v
ABSTRACT
vi
PARTE I:
I.1 INTRODUCCIÓN
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
ANTECEDENTES EN GUATEMALA
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
I.3 OBJETIVOS
GENERAL
ESPECÍFICOS
I.4 MÉTODOLOGÍA
I.4.1. LOCALIZACIÓN
A. DISEÑO DEL ESTUDIO
B. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
C. PROTOCOLO PARA EL ENSAYO ENZIMA-LIGADO
INMUNOSORBENTE DIRECTO
D. PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO DE
PAPAYA
1
4
7
8
PARTE II:
II.1 MARCO TEÓRICO
20
PARTE III:
III.1 RESULTADOS
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
40
50
PARTE IV:
IV.1 CONCLUSIONES
IV.2 RECOMENDACIONES
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
IV.4 ANEXOS
53
54
55
59
PARTE V:
V.1 INFORME FINANCIERO
61
iii
Cuadro
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
ÍNDICE DE CUADROS
Reactivos para la digestión de ADN genómico del Analysis System I & Starter Primer
Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Reactivos para la ligación de adaptadores del Analysis System I & Starter Primer Kit
(version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Reactivos para la reacción de preamplificación del Analysis System I & Starter Primer
Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Programa para PCR de la ligación de adaptadores del Analysis System I & Starter
Primer Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Descripción botánica de la papaya.
Zonas de producción de papaya en Guatemala y su potencial
Exportaciones hacia el Salvador.
Exportaciones hacia Honduras.
Exportaciones hacia Nicaragua.
Principio de Hardi-Weinberg.
Muestras de papaya criolla analizadas por medio de la técnica de ELISA para la
detección de PRSV.
Muestras de papaya silvestre analizadas por medio de la técnica de ELISA para la
detección de PRSV, probados por Illescas, 2006.
Cebadores probados por Illescas, 2006.
Combinaciones de cebadores probados para el estudio, incluyendo a los ya probados
por Illescas, 2006.
Proporción binomial de muestras de papaya criolla y silvestre.
Homología presentada entre las muestras.
iv
Página
14
14
15
15
20
25
28
28
28
31
42
43
43
43
45
49
Figura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.a.
15.b.
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Flor femenina de Carica papaya.
Flor masculina de Carica papaya.
Hoja de papaya con amarillamiento y moteado en el follaje, signo característico de PRSV.
Áfidos, comúnmente llamados pulgones, fotografía a través de un estereoscopio.
Área potencial del cultivo de papaya
Principio del ensayo inmunosorbente enzima-ligado (enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA)
Representación del principio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Representación del principio de análisis de AFLP.
Frutos de papaya, planta de papaya y plantación muestreada en las Trochas No.5, Nueva
Concepción Escuintla.
Frutos de papaya, planta de papaya y plantación muestreada en El Paraíso, Nueva
Concepción Escuintla.
Vivero de papaya criolla ubicado en Pozas, Nueva Concepción, junto con su propietario,
Don Víctor Ilopapa.
Hoja con inflorescencia de papaya silvestre de El Caoba (El Petén), hoja y fruto de papaya
silvestre de El Pesquero (El Petén).
Fruto de papaya con anillos oscuros en su superficie, signo característico de infección con
PRSV, Nueva Concepción, Escuintla.
Gel A, utilizando los cebadores E-AGG / M-CAT y Gel B, utilizando los cebadores E-AAC
/ M-CAA.
Dendrograma UPGMA que muestra los polimorfismos y la similitud genética entre las
muestras de papaya criolla obtenidas del vivero de Pozas, Nueva Concepción, Escuintla y
cuatro muestras de papaya silvestre obtenidas de El Petén.
Bandas utilizadas para la elaboración del dendrograma UPGMA
v
21
21
24
25
26
32
33
36
59
59
60
60
41
44
47
48
RESUMEN
Para países en desarrollo, la exportación de frutas se ha convertido en una actividad muy
importante en cuanto a la generación de divisas se refiere. Entre 1992 y 2002 Guatemala aumentó
en un 10% el valor de las exportaciones. Debido principalmente a que éste es un estudio de tipo
exploratorio, no estadísticamente significativo, el objetivo principal del estudio consistió en conocer
la diversidad genética de la papaya criolla y silvestre de Guatemala. Investigaciones de este tipo son
necesarias debido a que su carácter exploratorio nos sirve para iniciar la investigación del genoma
de las plantas nativas guatemaltecas para poder encontrar en ellas, y con otros estudios posteriores,
un gen que pueda ayudar a proporcionar una cierta resistencia a plagas, enfermedades o climas
extremos, que afectan a los cultivos de papaya de exportación del país. Con ello se podría evitar las
pérdidas económicas que dichas plagas y enfermedades provocan en los cultivos. Los objetivos
específicos de este estudio incluyeron la estandarización de la técnica de AFLP para obtener de un
dendrograma que mostrara las relaciones entre las muestras recolectadas.
El estudio se dividió en dos fases: el análisis de las muestras por medio de ELISA para
determinar cuáles se podían utilizar para el posterior análisis por medio de la técnica ya
estandarizada de AFLP para la obtención del dendrograma con las relaciones filogenéticas entre las
muestras. De esta manera se escogieron 26 muestras de papaya criolla y 4 muestras de papaya
silvestre. Luego de la estandarización de la técnica de AFLP para papaya silvestre, ya que se tenía
información previa de protocolos para la criolla, se encontró que la combinación de cebadores EAGG / M-CAT, al igual que en papaya criolla también producían una mayor cantidad de bandas
para mostrar los polimorfismos en las muestras de papaya silvestre. Además la estandarización de
esta técnica produjo un dendrograma en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre ambos
tipos de muestras. Este estudio también aportó 26 plántulas de papaya criolla sana para el inicio de
un germoplasma en los viveros de la Universidad del Valle de Guatemala. Alcanzándose de esta
manera los objetivos plantados en este estudio explorativo.
vi
ABSTRACT
For developing countries, fruit exportation has become a very important activity in terms of
generating foreign exchange concerns. Between 1992 and 2002 Guatemala increased by 10% the
value of exports. Mainly because this is an exploratory study, no statistically significant, the main
objective of the study was know the genetic diversity of the creole and wyld papaya of Guatemala.
Research of this kind is necessary because of its exploratory nature serves to initiate genome
research of Guatemalan native plants in order to find in subsequent studies, a gene that will help
provide some resistance to pests, diseases and extreme weather, affecting the papaya crop exports in
the country. This could avoid economic losses caused by pests and diseases. The specific objectives
of this study included the standardization of the technique of AFLP to obtain a dendrogram that
shows the relationships between the samples collected.
The study was divided into two phases: the analysis of samples by ELISA to determine
which could be used for further analysis using the standardized AFLP technique obtain the
dendrogram with the phylogenetic relationships among the samples. For this will 26 samples of
creole papaya were chose and 4 samples of wild papaya. After AFLP technique standardization for
papaya wild, as we had prior information of protocols for the creole papaya, the combination of
primers E-AGG / M-CAT, as in native papaya also produced greater number of bands to show
polymorphisms in wild papaya samples. The standardization of this technique produced a
dendrogram wich shows the phylogenetic relationships between both types of samples. This study
also brings 26 healthy native papaya seedlings to the start of a germplasm nursery at the University
del Valle de Guatemala. Thus achieving the goals outlined in this exploratory study.
vii
PARTE I
I.1. INTRODUCCIÓN
La diversidad de los materiales nativos de la mayoría de plantas cultivadas en Guatemala
aún se desconoce, por lo que se debe encaminar la investigación hacia este tipo de conocimiento. Al
conocer la diversidad de los materiales nativos se podrá recurrir a los mismos como fuente de genes
para resistencia o tolerancia a enfermedades, como papaya bunchy top, fitoplasmas, para el caso de
la papaya, o para tolerancia a climas extremos (sequías o alta pluviosidad). Se desconoce también la
diversidad de papayas silvestres, por lo que este proyecto permitirá establecer localidades donde
esta diversidad sea mayor para tomarlas en cuenta en programas de conservación.
En Guatemala, la producción de frutas como medio de subsistencia del sector campesino
contribuye en forma importante a la seguridad alimentaria y a la mejora de la situación nutricional
de la población de las zonas rurales. Además, el desarrollo de la horticultura de exportación se ha
basado en la pequeña agricultura, con promedios de 0,6 hectáreas sembradas por agricultor en 1979
que han pasado a un promedio de 5 hectáreas en 1993 y siguen en aumento. Para países en
desarrollo, la exportación de frutas se ha convertido en una actividad muy importante en cuanto a la
generación de divisas se refiere. Entre 1992 y 2002 Guatemala aumentó en un 10% el valor de las
exportaciones.
Sin lugar a dudas la herramienta indicada para realizar este tipo de estudio de manera
sistemática es la biología molecular, más específicamente, la caracterización utilizando secuencias
conocidas del genoma. Afortunadamente, en el pasado reciente, se ha apoyado a la investigación en
este campo, en estudios de cultivos como el frijol, el maíz, el ajo, el tomate, la anona, la mora y la
caña de azúcar; pero dada la diversidad de cultivos económicamente importantes para Guatemala,
este tipo de estudios debe seguir siendo de prioridad media a prioridad alta, más aún cuando
estamos a las puertas del TLC con EEUU, y todas sus implicaciones. Fortalecer al país en técnicas
de caracterización molecular hará que nuestra agricultura sea más competitiva a nivel internacional.
Este conocimiento de los materiales nativos es el primer paso hacia la formación de colecciones
núcleo y posterior conservación en bancos de germoplasma.
1
Con el objetivo de establecer la relación filogenética entre la variedad guatemalteca
considerada criolla y la silvestre, se utilizó la técnica molecular de genotipado llamada
polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (Amplified Fragment Length Polymorphism,
AFLP). El carácter explorativo, no estadísticamente significativo, de este estudio consistió en
establecer la relación filogenética entre la variedad de papaya guatemalteca considerada criolla y la
papaya silvestre, utilizando para ello la técnica molecular de genotipado llamada polimorfismo de
longitud de fragmento amplificado (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP).
Investigaciones de este tipo son necesarias debido a que su carácter explorativo nos sirve
para iniciar la investigación del genoma de las plantas nativas guatemaltecas para poder encontrar
en ellas, más adelante y con otros estudios, un gen que pueda ayudar a proporcionar una cierta
resistencia a las plagas y enfermedades, que afectan a los cultivos de papaya de exportación del
país. Con ello se podría evitar las pérdidas económicas que dichas plagas y enfermedades provocan
en los cultivos. Los objetivos específicos de este estudio incluyeron la estandarización de la técnica
y la obtención de un dendrograma que muestra las relaciones entre las muestras recolectadas.
Las muestras de papaya criolla fueron recolectadas en el municipio de Nueva Concepción,
departamento de Escuintla, en dos plantaciones y en un vivero. Las muestras de papaya silvestre
fueron obtenidas de dos aldeas del departamento de El Petén, El Caoba y El Pesquero. El estudio se
dividió en dos fases: el análisis de las muestras por medio del Ensayo enzima-ligado
inmunosorbente (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) directo para determinar cuáles se
podían utilizar al no estar infectadas con el virus de papaya ringspot (PRSV) y el análisis por medio
de la técnica de genotipado molecular (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) para la
obtención del dendrograma con las relaciones filogenéticas entre las muestras.
De acuerdo al protocolo se estimaron un total de 90 muestras tanto de papaya criolla como
de silvestre. Para que la muestra fuera analizada por medio de AFLP, debía estar libre de infección
por PRSV. De las muestras colectadas, se escogieron 26 muestras de papaya criolla y 4 muestras de
papaya silvestre, todas libres de infección por PRSV. De acuerdo a estudios anteriores (Illescas,
2006) realizados con papaya criolla se tenía ya un protocolo establecido para el análisis molecular
de esta variedad, mientras que no se tenía información de otros estudios realizados con la técnica de
AFLP en papaya silvestre guatemalteca. Debido a esto se estandarizó la técnica de AFLP para la
variedad silvestre y se encontró que la combinación de cebadores E-AGG / M-CAT, también
producía una mayor cantidad de bandas para mostrar los polimorfismos en este tipo de papayas. Se
2
produjo un dendrograma que muestra las relaciones filogenéticas encontradas entre las muestras.
Con este proyecto se inició una pequeña colección de germoplasma de papaya criolla en los viveros
de la Universidad del Valle de Guatemala.
3
I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
ANTECEDENTES EN GUATEMALA
Este estudio, es más bien exploratorio para la estandarización de la técnica de AFLP para
papayas silvestres y reproduce resultados de estudios previos para las papayas criollas.
Mencionando la optimización de cebadores, la cantidad de polimorfismos encontrados y los
protocolos utilizados.
El objetivo de este estudio fue estandarizar la técnica para la técnica molecular de
genotipado llamada polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (Amplified Fragment
Length Polymorphism, AFLP), para la variedad guatemalteca de papaya criolla y silvestre. Este
estudio determinó luego de varias pruebas que el par de cebadores que obtuvieron la mayor cantidad
de bandas para ambas variedades, ver figura 15.b., fue: E-AGG / M-CAT. De acuerdo a uno de los
objetivos del estudio, a partir de la estandarización de la técnica, AFLP, se obtuvo como resultado
un dendrograma que permite conocer las relaciones filogenéticas entre ambos tipos de muestras, ver
figura 15.a.
La diversidad de los materiales nativos de la mayoría de plantas cultivadas en Guatemala
aún se desconoce, por lo que se debe encaminar la investigación hacia este tipo de conocimiento. Al
conocer la diversidad de los materiales nativos se podrá recurrir a los mismos como fuente de genes
para resistencia, tolerancia a enfermedades o a climas extremos (sequías o alta pluviosidad). Se
desconoce también la diversidad de papayas silvestres, por lo que con este proyecto permitirá
establecer localidades donde esta diversidad sea mayor para tomarlas en cuenta en programas de
conservación.
Sin lugar a dudas la herramienta indicada para realizar este tipo de estudio de manera
sistemática es la biología molecular, más específicamente, la caracterización utilizando secuencias
conocidas del genoma. Afortunadamente, en el pasado reciente, se ha apoyado a la investigación en
este campo, en estudios de cultivos como el frijol, el maíz, el ajo, el tomate, la anona, la mora y la
caña de azúcar; pero dada la diversidad de cultivos económicamente importantes para Guatemala,
este tipo de estudios debe seguir siendo de prioridad media a prioridad alta, más aún cuando
estamos a las puertas del TLC con EEUU, y todas sus implicaciones. Fortalecer al país en técnicas
de caracterización molecular hará que nuestra agricultura sea más competitiva a nivel internacional.
Este conocimiento de los materiales nativos es el primer paso hacia la formación de colecciones
4
núcleo y posterior conservación en bancos de germoplasma. La importancia y la novedad de este
estudio radica en que es un estudio que utilizó materiales silvestres del país y que de éstos no se
tenían noticias de estudios previos en Guatemala.
5
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
La diversidad de los materiales nativos de la mayoría de plantas cultivadas en Guatemala
aún se desconoce, por lo que se debe encaminar la investigación hacia este tipo de conocimiento. Al
conocer la diversidad de los materiales nativos se podrá recurrir a los mismos como fuente de genes
para resistencia o tolerancia a enfermedades, como papaya bunchy top, fitoplasmas, para el caso de
la papaya, o para tolerancia a climas extremos (sequías o alta pluviosidad). Se desconoce también la
diversidad de papayas silvestres, por lo que con este proyecto permitirá establecer localidades
donde esta diversidad sea mayor para tomarlas en cuenta en programas de conservación. En
Guatemala, la producción de frutas como medio de subsistencia del sector campesino contribuye en
forma importante a la seguridad alimentaria y la mejora de la situación nutricional de la población
de las zonas rurales. Además, el desarrollo de la horticultura de exportación se ha basado en la
pequeña agricultura, con promedios de 0,6 hectáreas sembradas por agricultor en 1979 que han
pasado a un promedio de 5 hectáreas en 1993 y siguen en aumento. Para países en desarrollo como
Guatemala, la exportación de frutas se ha convertido en una actividad muy importante en cuanto a
la generación de divisas se refiere. Entre 1992 y 2002 Guatemala aumentó en un 10% el valor de las
exportaciones (Piñero, 2004).
Sin lugar a dudas la herramienta indicada para realizar este tipo de estudio de manera
sistemática es la biología molecular, más específicamente, la caracterización utilizando secuencias
conocidas del genoma. Afortunadamente, en el pasado reciente, se ha apoyado a la investigación en
este campo, en estudios de cultivos como el frijol, el maíz, el ajo, el tomate, la anona, la mora y la
caña de azúcar; pero dada la diversidad de cultivos económicamente importantes para Guatemala,
este tipo de estudios debe seguir siendo de prioridad media a prioridad alta, más aún cuando
estamos a las puertas del TLC con EEUU, y todas sus implicaciones. Fortalecer al país en técnicas
de caracterización molecular hará que nuestra agricultura sea más competitiva a nivel internacional.
Este conocimiento de los materiales nativos es el primer paso hacia la formación de colecciones
núcleo y posterior conservación en bancos de germoplasma.
6
I.3. OBJETIVOS
OBJETIVOS GENERALES
•
Conocer la diversidad genética de la papaya criolla y silvestre de Guatemala.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Estandarizar la técnica de AFLP para determinar la diversidad genética de las muestras de
papaya criollas y silvestres colectadas.
•
Elaborar un dendrograma que muestre las relaciones filogenéticas entre las muestras
recolectadas.
7
I. 4. MÉTODOLOGÍA
I.4.1. Localización
Este proyecto utilizó muestras de papaya criolla que se colectaron en el municipio de Nueva
Concepción, Escuintla. Durante el mes de julio 2008, para ello se visitaron fincas de papaya criolla,
específicamente en las plantaciones de Las Trochas (N 14°03’27.7”, O 91°19’47.4”), El paraíso (N
14°09’26.3”, O 91°17’22.7”) y en un vivero ubicado también en Nueva Concepción llamado Las
Pozas (N 14°09’48.7”, O 91°16’26.0”), ver anexo.
Las muestras de papaya silvestre fueron proporcionadas por el departamento de Ciencias
Agroforestales de la Universidad del Valle, procedentes del departamento de El Petén,
específicamente de la localidad de El Caoba (N18°84’74.5”, E16°22’02.93”) y El Pesquero (La
Libertad, sin coordenadas disponibles), las cuales fueron colectadas durante el mes de agosto, 2008,
ver anexo.
A todas las muestras de papaya, tanto criolla como silvestre, se les realizó la prueba de
ensayo enzimático ELISA (Enzyme-linked Inmunosorbent Assay), ver figura 12. Seguidamente se
realizó la prueba de AFLP para su estandarización.
A. Diseño del Estudio
Este trabajo consistió en una investigación no experimental de tipo transversal descriptiva,
es un estudio en donde no se hacen cambiar en forma intencional las variables independientes para
determinar su efecto sobre otras variables. Se recolectaron datos en un solo momento, en un tiempo
único. Su propósito fue describir variables y analizar su recurrencia o interrelación en un momento
dado. Su objetivo principal es indagar la incidencia de las modalidades o niveles de una o más
variables en una población. Por lo tanto es un estudio puramente descriptivo (Hernández et al.,
2006).
El propósito de este estudio fue estandarizar la técnica de AFLP para poder realizar un
dendrograma que mostrara las relaciones filogenéticas entre la papaya criolla y la silvestre. Por lo
que la estadística presentada solo se aplicó de manera descriptiva para los resultados obtenidos por
medio de la prueba de ELISA para las muestras de papaya criolla y silvestre.
8
B. Análisis estadístico
a. Análisis de datos enzimológicos. Para el análisis de los datos obtenidos luego de la prueba
enzimológica de ELISA se utiliza:
1) Proporciones binomiales. Muchas variables en la investigación son binarias, teniendo dos
posibles valores. Cuando una variable binaria es adjuntada para cada individuo o unidad en una
muestra, usualmente se reporta la proporción que cae en un grupo particular, casi siempre expresado
como un porcentaje (Newcombe, 2000).
2) Intervalos de confianza. Se ha formulado una variedad de métodos alternativos, pero el
más recomendado es el método debido a Wilson (1927), conocido como el método de puntuación o
“score method”, que tiene muy buenas propiedades para cualquier tipo de datos y es
razonablemente fácil de calcular. Entonces de acuerdo al método de Wilson, esto se hace de la
siguiente manera:
Suponga que de n individuos o unidades, r son positivos para la característica de interés y z
es 1.96 para un intervalo de confianza del 95%. Entonces la proporción de respuestas positivas está
dado por, p:
r
p= 
n
Para calcular el intervalo de confianza correspondiente a la proporción en la población de
donde la muestra se tomó, se deben calcular primero tres cantidades (Newcombe, 2000),
A = 2r + z 2

  r  
B = z z 2 + 4r1 −   
  n  

(
C = 2 n + z2
)
Luego, el intervalo de confianza para la proporción está dado por (Newcombe, 2000),
9
 A − B   A + B 
, 


 C   C 
b. Análisis de perfiles genéticos obtenidos por medio de AFLP. Luego de procesar las muestras
por medio de AFLP, se tomó una foto de los geles. A partir de esta foto y utilizando el programa
TotalLab, Nonlinear Dynamics TL120 DM (version 2006f, United Kingdom) se obtiene un
dendrograma de las muestras trabajadas.
c. Análisis y almacenamiento de datos. Los datos pertenecientes a los resultados por medio de
ELISA, fueron almacenados y analizados por medio del programa Excel perteneciente al paquete de
Windows office 2003. Luego de procesar las muestras por medio de AFLP se obtuvo un
dendrograma utilizando el programa TotalLab, Nonlinear Dynamics TL120 DM (version 2006f,
United Kingdom).
A continuación se presenta a detalle el procedimiento utilizado para llevar a cabo el estudio.
C. Protocolo para el Ensayo enzima-ligado inmunosorbente (Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay, ELISA) directo
1. Muestreo de follaje de papaya criolla. Se consultó vía telefónica, previo al inicio del
muestreo, con el proyecto desarrollo de la fruticultura y agroindustria (PROFRUTA) y con su ayuda
se identificaron tres lugares para el muestreo de papaya criolla.
a. Materiales
•
Bolsa de polietileno de cremallera plástica
•
Guantes de látex
•
Tijeras de podar pequeñas
•
Solución de etanol al 80% (80 mL de etanol absoluto y 20 mL de H2Od, para
100 mL totales).
Las muestras de hojas se obtuvieron a una altura de aproximadamente 1.50 -2.00 m sobre el
suelo. A partir de plantas de papaya escogidas al azar. La
contaminación
cruzada
entre
las
muestras, se evitó al desinfectar la tijera podadora que se usó con etanol al 80%, luego de tomar
cada hoja y utilizando guantes para tomar las muestras. Las hojas tomadas de las plantas fueron
10
colocadas en bolsas de polietileno de cremallera plástica y cada bolsa fue debidamente marcada con
el número de muestra, fecha, lugar de muestreo y coordenadas.
2. Tratamiento de las muestras
a. Todas las muestras obtenidas fueron guardadas en una bolsa de polietileno de
cremallera plástica en una hielera con ice packs y hielo luego de su recolección y en un refrigerador
a 2-4°C hasta que se procesaron en el laboratorio. El material para el análisis molecular se almacenó
a -40°C durante tres días y liofilizado.
3. Prueba de ELISA
a. Materiales.
•
Material vegetal.
•
Buffer de cobertura directo
•
Anticuerpo
•
Placa con 96 pozos para ELISA.
•
Buffer de lavado
•
Buffer conjugado
•
Anticuerpo conjugado.
•
Fosfatasa alcalina
•
Buffer de revelado
En un beaker se colocaron (suficiente para 96 pozos): 10 mL de buffer de cobertura y 50 uL
Anticuerpo (Agdia®), se agitó por 5 min. Se agregaron 100 uL de esta mezcla a cada pozo y se
cubrieron con tape. Se incubó en cámara húmeda por 4 h o toda la noche (ON) a 4°C. Todas las
muestras se trabajaron en duplicado (se pueden trabajar 46 muestras como máximo por placa
contando los controles positivos, negativos y blancos). En un tubo: se pesaron 0.1 g de cada
muestra, se le agregaron 1.0 mL de buffer de extracción directo y se maceró.
Lavado de la placa. Se utilizó el lavador de placas automático BIORAD Immuno Wash
modelo 1575, usando PBST como solución de lavado. Se colocó en 2 pozos, buffer de extracción
directo, el cual se usó como blanco. Se hizo el mapa en duplicado: Se colocó el control positivo de
Agdia® y seguidamente el control negativo de Agdia®. Se colocaron 100 uL de cada muestra en su
11
pozo respectivo y en duplicado. Se cubrió con tape. Se incubó 2 h en cámara húmeda a temperatura
ambiente o también se puede dejar toda la noche a 4°C. Para el lavado de la placa se repitió el
procedimiento ya descrito.
En un beaker se colocó (suficiente para 96 pozos): 10 mL de buffer conjugado y 50 uL de
anticuerpo conjugado. Se agitó por 10 min. Se agregó 100 uL a cada pozo, y se cubrió con tape. Se
incubó por 2 h en cámara húmeda a temperatura ambiente. Para el lavado de la placa se repitió el
procedimiento ya descrito. Para el revelado de la placa se agregó una pastilla de PNP (fosfatasa
alcalina) para cada 5 mL de buffer de revelado agitando para disolver. Se agregaron 100 uL de esta
preparación a cada pozo y se colocó la placa en cámara oscura (sin tape) por 1 hora.
Se hacen 2-3 lecturas (1 h, 2 h o hasta 3 h después de agregado el sustrato y si es necesario) a 405
nm.
D. Protocolo para la extracción del ADN genómico de papaya
Se utilizó DNAzol reagent (100 mL, INVITROGEN, Cat. No. 10978-021). El protocolo fue
escrito para aislar 0.1 g de tejido de planta, para cantidades mayores se deberán hacer las
conversiones necesarias (GIBCO BRL 2001)
1. Procedimiento
Se liofilizó dos días antes el tejido de la planta y se molió con mortero y pistilo hasta que se
obtuvo un polvo fino y homogéneo. Usando una espátula se transfirió el polvo a un tubo de
microcentrífuga con DNAzol (usar 0.5 mL por cada 0.1 g de tejido de planta). Se mezcló
cuidadosamente por inversión y se incubó con movimiento a 25°C por 5 min. Se adicionaron 0.3
mL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se mezcló vigorosamente e incubó con movimiento a
25°C por 5 min. Se centrifugó el extracto a 12,000 × g por 5 min, y se transfirió el sobrenadante o
fase acuosa a otro tubo. Se precipitó el ADN mediante la adición de 0.3 mL de etanol absoluto
grado reactivo, se mezcló por inversión 6 a 8 veces y se almacenó a temperatura ambiente por 5
min. Se centrifugó nuevamente a 12,000 × g por 5 min para sedimentar el ADN y luego remover el
sobrenadante.
12
Se lavó el ADN precipitado mezclando un volumen de Plant DNAzol reagent con 0.75
volumen de etanol al 100%. Adicionando 0.3 mL de la mezcla de lavado y mezclando utilizando
vortex.
Se incubaron las muestras a 25°C por 5 min y luego se centrifugaron a 12,000 × g por 5 min.
Se removió la solución de lavado mediante la adición de 0.3 mL de etanol al 75%. Se mezcló
vigorosamente y se centrifugó a 12,000 × g por 5 min. Si era necesario se debe realizar un segundo
lavado.
Se decantó el etanol y se dejó secar el precipitado a temperatura ambiente, colocando el tubo en
forma vertical de 1-2 min. El exceso de etanol remanente también se podía remover con una
micropipeta.
Se disolvió el precipitado de ADN en 70 uL de H2Odd estéril, y se almacenó a -20°C.
E. Protocolo de AFLP, Analysis System I & Starter Primer Kit (version B)
Se usó el Analysis System I & Starter Primer Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544013 y 10483-014).
1. Digestión de ADN genómico
a.
Materiales
•
Agua
•
Buffer de reacción 5X
•
Mezcla de enzimas: EcoR I/ Mse I
•
Muestra de ADN
Se agregaron los siguientes reactivos a un tubo de microcentrifuga:
13
Cuadro 1: Reactivos para la digestión de ADN genómico del Analysis System I & Starter Primer
Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Componente
Concentración
Volumen
Agua destilada
---11.5 uL
Buffer de reacción
5X
5 uL
Mezcla de enzimas
1.25 U/uL
2.5 uL
Muestra de ADN
50 ng/ uL
12 uL
31 uL
Volumen total
Fuente: FODECYT 024-2007.
Se mezcló suavemente y centrifugó brevemente los tubos de reacción. Se incubó la mezcla durante
2 h a 37°C. Al cabo de las 2 h, se incubó la mezcla por 15 min a 70°C para inactivar las
endonucleasas de restricción. Se colocó el tubo en hielo y se centrifugó brevemente.
2. Ligación de Adaptadores
a.
Materiales
•
Solución de adaptador
•
T4 ADN ligasa
•
Tubos con el ADN digerido (paso 1)
Se agregaron los componentes del cuadro 2 al ADN digerido del paso anterior (Digestión de
ADN genómico, cuadro 1).
Cuadro 2: Reactivos para la ligación de adaptadores del Analysis System I & Starter Primer Kit
(version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Componente
Volumen
Solución de adaptador
24 uL
T4 ADN ligasa
1 uL
25 uL
Volumen total
Fuente: FODECYT 024-2007.
Se mezcló suavemente a temperatura ambiente y se centrifugó brevemente los tubos de reacción. Se
incubó la mezcla durante 2 h a 20°C. Al cabo de las 2 h, se realizó una dilución 1:10 de la mezcla
de ligación como sigue:
14
Se tomaron 10 uL de la mezcla de reacción y se transfirieron a un tubo de 0.2 mL. Se agregaron 90
uL de buffer TE y se mezcló bien. La porción no utilizada de mezcla de reacción se almacenó a 20°C.
3. Reacción de Preamplificación
a.
Materiales
•
Mezcla de pre-amplificación.
•
Buffer de PCR con Mg 10 X
•
ADN Taq polimerasa
•
Tubos con el ADN diluido (paso 2)
Se agregaron los componentes del cuadro 3, a un tubo de 0.2 mL.
Cuadro 3: Reactivos para la reacción de preamplificación del Analysis System I & Starter Primer
Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Componente
Volumen
Mezcla de pre-amplificación
40 uL
Buffer de PCR con Mg 10 X
5 uL
ADN Taq polimerasa
1 uL
Muestra de ADN diluido (paso 3)
5 uL
51 uL
Volumen total
Fuente: FODECYT 024-2007.
Se mezcló suavemente a temperatura ambiente y centrifugó brevemente los tubos de reacción. Se
colocaron los tubos en un termociclador siguiendo el programa, cuadro 4:
Cuadro 4: Programa para PCR de la ligación de adaptadores del Analysis System I & Starter Primer
Kit (version B) INVITROGEN (Cat. No. 10544-013 y 10483-014).
Temp.
Función
Tiempo
Ciclos
(°C)
94
Desnaturalización
30 s
56
Annealing
1 min
20
72
Elongación
1 min
Fuente: FODECYT 024-2007.
Se hizo una dilución 1:25 como sigue:
15
Se transfirieron 6uL de ADN a un tubo que tenía 144 uL de buffer TE. Esto es suficiente para 30
amplificaciones selectivas. Si fuera necesario hacer diluciones, éstas pueden ser hechas a partir de
las reacciones de preamplificación. La porción no utilizada de esta mezcla de reacción puede ser
almacenada a -20°C.
4. Selección de los cebadores
Debido a que la técnica de AFLP, es un procedimiento de laboratorio ya optimizado se decidió
utilizar luego de pruebas con otros cebadores, los cebadores recomendados por Illescas, 2006:
E-ACT / M-CAG
E-AGG / M-CAT
E-AGC / M-CAT
E-AGG / M-CTT
E-AGG / M-CAT, es la combinación de cebadores con los que Illescas, 2006, obtuvo una mayor
cantidad de bandas para los tres tipos de papaya que probó para su trabajo de tesis, incluyendo
papaya criolla. Por lo que se decidió utilizarlo en este estudio e incluirlo en la lista a la papaya
silvestre.
5. Geles de poliacrilamida
a. Preparación de las placas de vidrio para electroforesis
1) Materiales
•
Solución de hidróxido de sodio al 10% (10 g NaOH en 100 mL
•
Detergente
•
agua destilada
•
Solución de etanol al 70% (70 mL de etanol absoluto en 100 mL
•
Dilución de bind silane (6 uL de bind silane en 1 mL de H2Odd)
•
1 mL de sigmacote
•
Kimwipes
H2Odd)
H2Odd)
16
Se remojaron las dos placas de vidrio durante 30 minutos en solución de hidróxido de sodio
al 10%. Se lavó con detergente común y esponja. Se enjuagó con agua destilada y alcohol al 70%.
Se dejó secar.
Se aplicó solución de bind silane y sigmacote. El sigmacote se aplicó solamente a la placa
grande con un kimwipe. Dejar secar ambas placas. Se repitió nuevamente la aplicación del bind
silane y sigmacote, se dejó secar.
Se colocaron los separadores a ambos lados y en la parte de abajo del cristal más grande, se
colocó el vidrio pequeño encima (las caras a las que se les aplica el bind y el sigmacote deben
quedar hacia adentro, una frente a la otra). Se sujetó ambos vidrios con pinzas alrededor.
b. Preparación de la solución de acrilamida.
1) Materiales
• 65 mL Acrilamida-bisacrilamida 19:1 al 6% con urea 7.5 M (190 g
de acrilamida, 10 g de bisacrilamida en 500 mL de H2Odd)
• 270.5 uL Persulfato de amonio al 10% (1 g de APS en 10 mL de
H2Odd)
•
86.6 uL TEMED
Se vació la solución anterior entre los cristales evitando que se formaran burbujas.
Inmediatamente se colocó un peine invertido en la parte superior para delimitar la línea superior del
gel. Se dejó polimerizar.
Se retiraron las pinzas, el peine superior y el separador inferior, se limpió con etanol al 70%
lo que hubiera caído en la parte exterior de los cristales. Se lavó y enjuagó con agua destilada.
c. Pre-corrida del gel de poliacrilamida.
1) Materiales
•
Vaselina.
•
0.05 L de TBE 10X (conc final 0.5X) (108.0 g de Tris Base,
55.0 g de Ácido Bórico, 40 mL de EDTA 0.5 M (pH 8.0) en 1000 mL de H2Odd totales).
17
Se aplicó vaselina en la parte superior de la cámara de electroforesis vertical para evitar
fugas del buffer de corrida. Se colocaron los cristales en la cámara de electroforesis. Se agregó 1 L
de TBE 0.5X, repartiendo 500 mL en la parte superior y 500 mL en la parte inferior. Se verificó que
no hubiera fugas. Se corrió el gel durante media hora a 1425 V constantes.
d. Preparación de las muestras.
1) Materiales
•
Tampón de carga (NaOH 10 mM, Formamida 95%, Azul de
bromofenol y naranja G al 0.05%).
Durante el tiempo de la precorrida se prepararon las muestras que se agregaron al gel. Se le
agregó a cada muestra tampón de carga en relación 1:1. Se desanaturalizaron las muestras
calentándolas a 94°C por 5 minutos en el termociclador.
e. Cargado de las muestras en el gel de poliacrilamida.
1) Materiales
•
Muestras desnaturalizadas.
•
Marcador molecular 800 -50 pb.
Luego de terminar la pre-corrida del gel y la desnaturalización de las muestras, se retiró el
peine que se colocó y se lavó el pozo con buffer de corrida. Se colocó nuevamente el peine solo que
utilizando la parte dentada del mismo para crear los pozos en donde se cargaron las muestras.
Se procedió a cargar 5 uL de cada una de las muestras que se deseaba correr en el orden
adecuado y 3 uL de marcador molecular. Una vez cargado el gel se inició la corrida, durante 2 horas
a 1425 V constantes.
f. Tinción del gel con solución de nitrato de plata.
1) Materiales
18
•
Solución de ácido acético al 10% (150 mL de ácido acético en
•
Solución de nitrato de plata1 (1.5 g de nitrato de plata, 2.225
1350 mL de H2Odd).
mL de formaldehído al 37% en 1500 mL de H2Odd).
•
Solución de carbonato de sodio2 (45 g de carbonato de sodio,
3.75 uL de tiosulfato de sodio al 2%3, 2.25 uL de fomaldehído al 37%4)
Una vez finalizada la corrida se procedió a la tinción del gel. Se desmontó la placa del
aparato de electroforesis, se limpió perfectamente los vidrios para evitar posibles interferencias en
la tinción, el exceso de vaselina se quitó con alcohol al 70% y papel. Luego se le pasó agua
destilada y se secó.
Se separaron los cristales. Una vez separados la placa que tiene el gel se sumerge en
solución de ácido acético al 10% por 30 minutos en agitación. Luego de los 30 minutos en solución
de ácido acético, se lavó por dos minutos en agua destilada estéril. Se repitió este lavado hasta
completar 3 lavados.
Sumergir la placa por 30 minutos en solución fría de nitrato de plata en agitación. Luego de
los 30 minutos se lavó rápidamente con agua destilada. Se reveló con solución de carbonato de
sodio fría durante 30 minutos. Para detener el revelado se agregó solución de ácido acético hasta
que se neutralizó la reacción. Se lavó con agua destilada y se dejó escurrir.
1
Debe almacenarse a 2-4°C.
Debe almacenarse a 2-4°C.
3
Se agrega al momento de utilizar la solución de carbonato.
4
Se agrega al momento de utilizar la solución de carbonato.
2
19
PARTE II
II.1. MARCO TEÓRICO
A. Descripción botánica de la papaya
Cuadro 5: Descripción botánica de la papaya.
Carica papaya L
Nombre científico
Clasificación botánica
Plantae
Reino
Angiospermae
Clase
Dycotiledonae
Subclase
Parietales
Orden
Caricaceae
Familia
Carica
Género
Carica papaya
Especie
Fuente: Montenegro, 1999.
1. Planta. Planta arborescente perenne de 2 a 8 m (hasta 10 m, según la edad) de altura con un
diámetro de 6 a 15 cm (hasta 30 cm). Copa abierta y redondeada. Hojas grandes de 70 a 100 cm,
ligeramente gruesas. El tronco es erguido, cilíndrico, hueco excepto en los nudos, más grueso en su
base; sin ramas y con las características cicatrices que dejan las hojas al caer. Corteza lisa, verde
grisácea, con manchas pardas, obscuras, o bien raramente pardo pálidas, de forma irregular,
cicatrices semicirculares a todo lo largo del tronco (Montenegro, 1999).
2. Flor(es). Flores pistiladas, estaminadas y bisexuales, con el cáliz tubular de 8 a 10 mm de
largo, verdoso; corola tubular de 10 a 20 mm de largo, blancuzca o amarilla pálida. Flores
femeninas solitarias o 5 ó 6 juntas en la base de una hoja; masculinas en panículas5 delgadas con 15
a 20 flores o llegando a tener hasta 100 florecillas por inflorescencia. Las flores femeninas son
mucho más grandes que las masculinas (Montenegro, 1999).
3. Tipos de flores de la papaya:
a. Tipo I: Flor femenina que da frutos redondos, ovoides u oblongos (Castro et al., 2000).
5
Flores en ramillete o en espiga (Diccionario Pequeño Larousse Ilustrado. 1985).
20
Figura 1: Flor femenina de Carica papaya.
Fuente: Le Bellec, 2004.
b. Tipo II: Hermafrodita pentandria, con cinco estambres y un ovario. Esta flor origina
frutos globosos, ovoides y con la sección transversal lobulada (Castro et al., 2000).
c. Tipo III: Hermafrodita intermedia, con seis a nueve estambres y un ovario. En las flores
normales los frutos son grandes y de buen aspecto, pero tanto esta flor como la anterior presentan
muchas anormalidades que le impiden desarrollar frutos y por lo tanto las plantas que las poseen
dan bajos rendimientos (Castro et al., 2000).
d. Tipo IV: Hermafrodita elongada. Es la hermafrodita perfecta y tiene diez estambres y
un ovario. Asegura la mayor producción de frutos, estos son de forma cilíndrica, alargados y de
muy buena calidad (Castro et al., 2000).
f.
Tipo V: Masculina. Posee diez estambres y un pistilo rudimentario que no es capaz de
dar fruto (Castro et al., 2000).
Figura 2: Flor masculina de Carica papaya.
Fuente: Manhart, 2006.
21
g. Tipo VI: Falsa hermafrodita. Esta flor exteriormente parece hermafrodita pues tiene
engrosados todos sus órganos, pero al igual que la anterior, el pistilo no es funcional (Castro et al.,
2000).
3. Fruto(s). Frutos apiñados alrededor del tronco. Bayas elipsoides a esféricas, tornándose de
verdes a anaranjadas en la madurez, pulpa blanda, jugo lechoso. Pueden aparecer solitarios o en
racimos y la fructificación guarda relación con el grosor del tallo. Las semillas están en la cavidad
existente en el centro del fruto y son de color negruzco, aspecto rugoso y cubierto por una sustancia
mucilaginosa. El fruto silvestre mide de 4 a 6 cm de largo y de 3 a 4.5 cm de ancho. Cada fruto
conteniendo de 200 a 400 semillas. Fruto cultivado de 10 a 50 cm de largo, con pesos que según el
cultivar pueden oscilar entre 200 g y 8 kg (Montenegro, 1999).
4. Variedades de Papaya. Se puede indicar que en Guatemala no se cultivan variedades
propiamente dichas debido a la complejidad de sexos, múltiples combinaciones florales y facilidad
de cruzamientos. La producción del país se basa en un tipo “criollo” seleccionado que no es
uniforme en cuanto a la producción de frutos y consumido a nivel de mercado local.
a. Criolla. Plantas vigorosas de 6-8 m de altura con un periodo aprovechable de dos años.
La floración es temprana e inicia entre los 3-4 meses del transplante a diferentes alturas del tallo,
estimándose como promedio 1 m, la cosecha se inicia entre 8-10 meses. Los frutos pueden ser de
diferentes largos y anchos, su peso varía entre los 3-5 kg con pulpa anaranjada y sabor dulce
(Montenegro, 1999).
b. “Solo” o Hawaiano. Cultivo reciente en Guatemala y se caracteriza por ser una planta de
porte alto, que produce abundante fruto de forma esférica, los cuales son relativamente pequeños de
0.2-0.8 kg de peso, la pulpa puede ser de color anaranjado pálido a rojizo según el cultivar. Son
frutos de cavidad interna pequeña y muchas semillas. Dentro de este tipo se describen los siguientes
cultivares (Montenegro, 1999):
c. Sunrise. Crece vigorosamente y tiene una altura de producción baja, produce las primeras
flores aproximadamente cuatro meses después de plantar las semillas. Su fruto en caso pertenezca a
una planta hermafrodita es ovoide, uniforme en tamaño y forma con un peso promedio de 563 g y
una longitud de 14.96 cm y un diámetro de 7.25 cm (Montenegro, 1999).
d. Sunset. Crece vigorosamente y tiene una altura de producción baja, produce las primeras
flores aproximadamente cuatro meses después de plantar las semillas. La fruta procedente de flores
22
hermafroditas es periforme pero ligeramente redonda. El tamaño varía ampliamente con un peso de
548 g. El color de la pulpa es anaranjado-amarillo (Montenegro, 1999).
e. Waimanalo. Crece vigorosamente y tiene una altura de producción baja, produce las
primeras flores aproximadamente cuatro meses después de plantar las semillas. La fruta es redonda
con cuello corto, el tamaño varía ampliamente con un promedio de peso de 609 g. El mayor tamaño
de esta la hace menos deseable para la exportación. El color de la pulpa es anaranjado-amarillo vivo
(Montenegro, 1999).
f. Kapoho. Crece vigorosamente y tiene una altura de producción baja, produce las primeras
flores aproximadamente cinco meses después de plantar las semillas. El tamaño de la fruta varía
ampliamente con un peso promedio de 480 g el largo promedio es de 12.92 cm y el diámetro es de
6.98 cm (Montenegro, 1999).
g. Maradol. Se caracteriza por presentar una descendencia compuesta por plantas
hermafroditas para frutos alargados y plantas femeninas para frutos redondos en porcentajes de 80 y
20 respectivamente. Los frutos de una misma planta se consideran homogéneos en forma y tamaño
y se consideran peso de fruto que varían de 1.5-2.5 kg. Por su consistencia se le estima una larga
vida de anaquel siendo además muy resistente al transporte (Montenegro, 1999).
B. Virus de la mancha anular del papayo (Papaya Ringspot Virus, PRSV)
El virus de la mancha anular del papayo es una enfermedad destructiva caracterizada por un
amarillamiento y un arresto en el crecimiento en la corona de los árboles de papaya, un moteado en
el follaje, figura 3, acolochamiento de las hojas jóvenes, pecíolos húmedos y anillos pequeños
oscuros en la superficie de los frutos (Heu, 2002).
23
Figura 3: Hoja de papaya con amarillamiento y moteado en el follaje, signo característico de PRSV.
Fuente: Heu, 2002.
Otros organismos, tales como varias especies de hongos e insectos, pueden causar síntomas
similares a los de PRSV. Los herbicidas agregados a plantas de papaya en desarrollo también
pueden causar síntomas tales como el acolochamiento de las hojas. En casos severos, los frutos
pueden deformarse (Heu, 2002).
1. Daño. Dado que la corona de hojas de una planta infectada declina a medida que la
enfermedad progresa, la producción de frutos, tamaño y calidad son reducidos.
2. Transmisión. El virus de la mancha anular del papayo es transmitido de plantas de papaya
infectadas a plantas sanas por acción de varias especies de áfidos. El virus es transmitido de manera
no persistente, esto significa que el virus no se multiplica dentro dentro del áfido sino que es
transportado en sus partes bucales y es transmitido de planta a planta mientras se alimenta. Este
virus no se transmite por medios mecánicos tales como utilizar las mismas herramientas del jardín
en tanto plantas infectadas como no infectadas. La principal forma de transmisión es a través de la
alimentación de los áfidos. La enfermedad también puede transmitirse al plantar plantas infectadas
con PRSV en áreas no infectadas (Heu, 2002).
a) Áfidos. Son insectos diminutos de aproximadamente 1/8 pulg de largo. Tienen el
cuerpo blando y su parte posterior es redondeada en forma de pera. Se caracterizan porque en la
parte posterior poseen dos estructuras tubulares de color oscuro. A estas estructuras se les llama
cornículos. El color de las diferentes especies de áfidos varía desde tonos amarillosos hasta colores
oscuros. Normalmente, los áfidos no tienen alas, pero las pueden desarrollar para migrar a nuevas
áreas a causa del hacinamiento o la escasez de alimento. Estos insectos se reproducen en grandes
números en un tiempo relativamente corto. Pueden completar su ciclo de vida en aproximadamente
24
10 a 14 días. Su ciclo de vida consta de tres etapas: huevo, ninfa y adulto. Los áfidos pertenecen al
grupo de los homópteros al igual que las queresas y las chinches harinosas.
Figura 4: Áfidos, comúnmente llamados pulgones, fotografiados a través de un estereoscopio.
Fuente: O’Farrill-Nieves, 2005.
C. Distribución geográfica del cultivo de papaya en Guatemala.
En la figura 5 y en el cuadro 6 se presentan el área potencial de cultivo y las zonas de producción de
papaya:
Cuadro 6: Zonas de producción de papaya en Guatemala y su potencial..
Departamento
Número de
Producción
Cantidad
Renta
Productores
por Área
Esperada
Esperada
Involucrados
(Ha)
(Ton)
(Q)
San Marcos
240
60
1,500
6,600.00
Quetzaltenango
240
60
1,500
6,600.00
Suchitepequez
600
150
3,750
16,500.00
Retalhuleu
600
150
3,750
16,500.00
Escuintla
800
200
5,000
22,000.00
Santa Rosa
400
100
2,500
11,000.00
Jutiapa
600
150
3,750
16,500.00
Zacapa
320
320
80
8,800.00
Chiquimula
200
200
50
5,500.00
El Progreso
320
320
80
8,800.00
Izabal
400
400
100
11,000.00
El Petén
400
400
100
11,000.00
5, 120
1, 280
32, 000
140, 800.00
Total
Fuente: Bonzi, 2000 y Comité de papaya de AGEXPRONT, 2004
25
Figura 5: Área potencial del cultivo de papaya.
Fuente: Montenegro, 1999.
D. Importancia económica del cultivo de papaya para Guatemala.
La papaya es una de las cuatro frutas tropicales más importantes a nivel mundial (junto con
el mango, la piña y el aguacate). Entre 1992 y 2002 América Latina produjo 2, 284,222 toneladas de
papaya lo cual representa el 47% de la producción mundial durante ese tiempo. Durante ese mismo
período el crecimiento promedio de la producción de papaya a nivel mundial fue de 4.76% y 7.28%
en América Latina, siendo así la fruta tropical que mayor crecimiento tuvo durante ese período
(Piñero 2004). Guatemala posee 314,743 hectáreas aptas para la producción de papaya, de las cuales
menos de un tercio se utilizan para cultivar dicha fruta. A pesar de eso, el guatemalteco promedio
consume entre 1 y 1.5 Lb de papaya anualmente (Organización de Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación, 2005).
En Guatemala, la producción de frutas como medio de subsistencia del sector campesino
contribuye en forma importante a la seguridad alimentaria y la mejora de la situación nutricional de
la población de las zonas rurales. Además, el desarrollo de la horticultura de exportación se ha
basado en la pequeña agricultura, con promedios de 0,6 hectáreas sembradas por agricultor en 1979
que han pasado a un promedio de 5 hectáreas en 1993 y siguen en aumento (Piñero, 2004).
26
Los fenómenos ocurridos durante los noventas han provocado la segmentación del mercado.
Como resultado, el forzoso desarrollo de nuevos productos, la variabilidad de la oferta abriendo así
una ventana a los productos con alto valor agregado, entre éstos las frutas frescas. Adicionalmente,
el mercado de la papaya no es un mercado saturado (los mayores productores son Brasil y Hawai)
(Piñero, 2004). Por lo tanto, conseguir un nicho de mercado para éste producto no es algo tan
complicado. Asimismo, la papaya producida en Petén no se debe de someter al proceso
hidrotérmico que tiene que pasar la papaya cultivada en la costa sur. La razón es que Petén está libre
de la mosca del mediterráneo, reduciendo de esa forma los costos del cultivo de dicha fruta,
haciéndola así aún más atractiva para los posibles exportadores de dicha fruta (Martínez, 1995 y
Cigarroa, 2005).
Para países en desarrollo como Guatemala, la exportación de frutas se ha convertido en una
actividad muy importante en cuanto a la generación de divisas se refiere. Entre 1992 y 2002
Guatemala aumentó en un 10% el valor de las exportaciones. En el 2004 la producción de papaya
alcanzaba 3,000 toneladas métricas. A pesar de que la mayor parte de la producción se consume
localmente, existe un porcentaje cada vez mayor que se somete a estrictos controles y normas de
calidad para garantizar su inocuidad y así poder exportarlo a países desarrollados como Estados
Unidos (Piñero, 2004).
Ahora bien, en cuanto a exportaciones, en el período de 2004 a 2006 Guatemala exportó
11,545.000 kg hacia Estados Unidos y 11, 393, 462.561 kg hacia Centroamérica, ver cuadros 7, 8 y
9, de los cuales 8,934,032.15 kg fueron hacia El Salvador, 1,481,643.80, cuadro 3, hacia Honduras,
cuadro 4 y el resto a Nicaragua, cuadro 5. Tal y como se puede observar la tendencia se mantuvo
aunque disminuyó ligeramente excepto en Nicaragua, cuadro 5, donde si se observa un aumento
significativo en las exportaciones hacia ese país (Asociación de exportadores, 2007).
27
Cantidad de producto
(Kg)
Cuadro 7: Exportaciones hacia El Salvador.
4,000,000
3,500,000
3,000,000
2,500,000
2,000,000
1,500,000
1,000,000
500,000
0
2004
2005
2006
Año
Fuente: AGEXPRONT, 2007.
Cantidad de producto
(Kg)
Cuadro 8: Exportaciones hacia Honduras.
520,000
510,000
500,000
490,000
480,000
470,000
460,000
450,000
440,000
2004
2005
2006
Año
Fuente: AGEXPRONT, 2007.
Cantidad de producto
(Kg)
Cuadro 9: Exportaciones hacia Nicaragua.
500,000
400,000
300,000
200,000
100,000
0
2004
2005
2006
Año
Fuente: AGEXPRONT, 2007.
E. Genética de poblaciones
Al estudio de las variaciones en una población natural y de los factores que influyen sobre
estas variaciones, se le conoce como genética de poblaciones. Las técnicas utilizadas para la
identificación de variaciones genéticas en poblaciones naturales han ido evolucionando, y gracias a
esto actualmente los estudios ya no son teóricos. Las primeras técnicas utilizadas fueron las de la
28
identificación de mutantes morfológicos, por medio de los cuales se hacían evidentes las
características heredadas en forma recesiva; el estudio de las variaciones cromosómicas
estructurales, conocida como inversión cromosomal; y la del uso de isozimas. Esta última técnica ha
generado un extenso repertorio de información acerca de la genética de poblaciones (Tabachnick,
1995).
1. Poblaciones naturales. La palabra población, utilizada en el sentido de genética de
poblaciones, se refiere a un grupo de individuos de la misma especie que viven dentro de un área
geográfica suficientemente restringida como para que cualquier miembro dentro de ella puede
aparearse al azar con otro miembro (Tabachnick, 1995).
Llegar a un definición precisa se dificulta, pues existe una diferencia entre especies dada
por alguna forma de estructura geográfica, i.e., algún patrón especifico no al azar que distribuye a
los organismos espacialmente. Rara vez se encuentra que los miembros de una especie estén
distribuidos de forma uniforme u homogénea en el espacio; esta subdivisión poblacional
generalmente es provocada por ambientes disparejos, como por ejemplo áreas secas o empantanadas
dentro de un llano, regiones de poca y de mucha profundidad dentro de un lago, etc (Tabachnick,
1995).
Las unidades fundamentales de estudio en la genética de poblaciones son las poblaciones
locales, i.e., unidades dentro de una población en las cuales ocurre cruzamiento entre parientes; ya
que es dentro de estas unidades o poblaciones donde ocurren los cambios en las frecuencias de
alelos que son tan importantes para la evolución adaptativa de una característica. Existen factores
que afectan la frecuencia genotípica dentro de una población (Tabachnick, 1995).
En general el modelo mas utilizado para determinar la estabilidad de un genotipo es el de
Hardy-Weinberg, el cual asume que el organismo que se está estudiando es diploide y se reproduce
sexualmente, que no existe un traslape entre generaciones, y el apareamiento es al azar dentro de
una población muy grande, que la migración es imprescindible y la mutación puede ignorarse, y que
la selección natural no afecta los alelos que se están considerando (Tabachnick, 1995).
29
2. Variación Genética
a. Equilibrio de Hardy-Weinberg y los factores que afectan la variación. El equilibrio de
Hardy-Weinberg indica que en una población grande, con apareamiento al azar en ausencia de
selección, migración y mutación, las frecuencias genotípicas y fenotípicas permanecen constantes
de generación en generación. Es decir, que los factores que provocan cambios en las frecuencias
genotípicas son principalmente cinco:
1) Apareamiento al azar: En el apareamiento al azar irrestricto, todos los individuos de
la población tienen la misma posibilidad de aparearse con un individuo del sexo opuesto. En el
cuadro 2, los individuos representados por los genotipos AA, Aa y aa deben aparearse entre sí al
azar y no deben seleccionar sus parejas con base al genotipo (Solomon, 2001)
2) Ausencia de Mutaciones netas: no debe haber mutaciones que conviertan A en a o
viceversa. Esto es, las frecuencias de A y a en la población no deben cambiar debido a mutaciones
(Solomon 2001).
a) Tamaño Poblacional Grande: Las frecuencias alélicas tiene mayor probabilidad
de ser afectadas por fluctuaciones fortuitas (deriva genética) en una población pequeña que en una
grande (Solomon 2001).
b) Ausencia de Migración: No puede haber intercambio de genes con otras
poblaciones que podrían tener diferentes frecuencias alélicas; esto es, no hay emigración o
inmigración de individuos (Solomon, 2001). La tasa de mutación afecta la frecuencia de genes. Una
mutación es fuente de material genético completamente nuevo. La tasa de mutación está estimada
en el orden de 10-6 por locus por generación, aunque para regiones no codificadas esta tasa es mayor
(Tabachnick, 1995).
c) Ausencia de Selección Natural: la selección es un factor determinante, ya que
en distintos individuos varía la aptitud de los genes, y por lo tanto la aptitud que le confieren al
individuo que los porta (Tabachnick, 1995).
Una población se encuentra en el equilibrio de Hardy-Weinberg cuando ninguno de los cinco
factores mencionados anteriormente afecte significativamente la frecuencia genotípica. Suponiendo
30
que en una población hay dos alelos (A1 y A2) para un locus en específico, y sus frecuencias son p
y q, respectivamente. Cuando las frecuencias de cada alelo son equivalentes en ambos sexos, al
haber apareamiento al azar entre organismos, el resultado será una unión al azar de los gametos.
Tenemos que las frecuencias genotípicas en la siguiente generación serán (Solomon, 2001), cuadro
10:
Cuadro 10: Principio de Hardi-Weinberg, cuando se unen al azar óvulos y espermatozoides que
contienen alelos A o a, la frecuencia de aparición de cada uno de los posibles genotipos (AA, Aa y
aa) en la descendencia se calcula multiplicando las frecuencias de los alelos A y a en óvulos y
espermatozoides.
Frecuencias alélicas en los
gametos masculinos
A
p = 0.7
a
q = 0.3
Frecuencias alélicas en los gametos femeninos
A
a
p = 0.7
q = 0.3
Aa
AA
pq = 0.7×0.3 = 0.21
p2 = 0.7×0.7= 0.49
Aa
aa
pq = 0.7×0.3 = 0.21
q2 = 0.3×0.3 = 0.09
Fuente: Solomon, 2001.
Note que p + q =1, y que la frecuencia genotípica esperada para cualquier generación se
pude obtener por medio de una expansión binomial de las frecuencias alélicas (p + q)2. Lo mismo
ocurre para una población en la que se tienen más de dos alelos para un locus: (p + q + r...)2
(Tabachnick, 1995)
F. Ensayo inmunosorbente enzima-ligado (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
Para detectar un antígeno A, un anticuerpo purificado específico para el antígeno A es unido
químicamente a una enzima, figura 4. Las muestras que son examinadas son cubiertas en la
superficie de los pozos de plástico al cual se unen no específicamente, los sitios pegajosos
residuales en el plástico son bloqueados al agregar proteínas irrelevantes (no mostrado). Los
anticuerpos marcados son luego agregados a los pozos bajo condiciones donde la unión no
específica es prevenida, para que solo la unión al antígeno A cause que el anticuerpo marcado sea
retenido en la superficie. El anticuerpo marcado no unido es removido de todos los pozos al lavar, y
el anticuerpo unido es detectado por una reacción coloreada enzimo-dependiente. Este ensayo
permite que arreglos de pozos conocidos como placas de microtitulación son leídas en un
espectrofotómetro de fibra óptica multicanal, haciendo de esta manera más rápido el ensayo
(Janeway et al. 2001), figura 6.
31
Figura 6: Principio del ensayo inmunosorbente enzima-ligado (enzyme-linked immunosorbent
assay, ELISA).
Fuente: Janeway et al. 2001.
G. Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction, PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida también como PCR, permite replicar en
pocas horas miles de veces el ADN que se encuentra en pequeñas cantidades. Entonces,
reduciéndola a sus términos más básicos, PCR envuelve principalmente, la combinación de una
muestra de ADN con cebadores oligonucleótidos, trifosfatos desoxinucleótidos y la polimerasa
termoestable de ADN Taq en un buffer adecuado, luego repetitivamente calentando y enfriando la
mezcla por varias horas hasta que la cantidad deseada de amplificación se alcanza (Erlich 1989).
El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas
llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y
cuarenta veces, ver figura 7. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de
las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el
segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas
cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se
32
trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera
tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Para que se pueda
producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o
cebadores, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del
ADN molde (Satz 1993), figura 7.
Figura 7: Representación del principio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). A) Paso
1: la solución es calentada a 95°C para desnaturalizar ("despegar") las dos cadenas del ADN blanco;
B) Paso 2: la solución es enfriada ~55°C para permitir a los primers que se apareen (unan) con los
extremos de las hebras de ADN; C) Paso 3: la solución es recalentada ~75°C para permitir que la
Taq Polimerasa sintetice la hebra complementaria de cada hebra.
Fuente: Satz 1993.
En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los cebadores, en el espacio
comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN
molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) agregados a la mezcla
33
de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual
"trabaja" la enzima ADN polimerasa (72ºC es la ideal). Al cabo del primer ciclo de tres reacciones
(desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de
su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El
resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica
del segmento de ADN delimitado por los cebadores (Satz 1993).
El buffer como medio en cual se lleva a cabo la reacción de la amplificación de la porción
de ADN que nos interesa multiplicar, determina en todos los casos, ya sea por cantidad o
composición el éxito o el fracaso de la PCR o bien también el rendimiento del mismo como
resultado final de la reacción de la cadena de polimerasa. En particular la concentración de MgCl2,
que puede tener un efecto profundo en la especificidad y en el rendimiento de la amplificación
(Erlich 1989).
Al considerar la cantidad de Mg+2 para agregar a la reacción, es importante tener presente
que se debe alcanzar un balance entre la concentración total de Mg+2 y la concentración dNTP. Para
optimizar la concentración del buffer de PCR multiplex se deben llevan a cabo una serie de
titulaciones de diferentes concentraciones de enzima y de cebadores, y luego se titulan los niveles
de dNTP y Mg+2. Resultados óptimos fueron obtenidos con 6.7 mM de Mg+2, y este nivel es
utilizado para determinar la concentración óptima de dNTP (Innis et al.1990). Generalmente, el
exceso de Mg+2 resultará en la acumulación de productos de amplificación no específicos e
insuficiente Mg+2 reducirá el rendimiento. Recientemente, se ha demostrado que la reducción o
eliminación de KCl y gelatina pueden ser beneficiosas. Algunos protocolos incluyen 10% de dimetil
sulfóxido (DMSO) que reduce visiblemente la estructura secundaria del ADN del blanco; aunque
también se ha demostrado que la DMSO puede inhibir débilmente a la Taq polimerasa y disminuir
el rendimiento total del producto de amplificación (Erlich 1989).
Los desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) utilizados por la ADN polimerasa, para extender
los cebadores, éstas deben encontrarse en las cantidades adecuadas dentro del buffer de PCR. Están
usualmente presentes cada uno entre 50 a 200 µM. Mayores concentraciones pueden tender a
promover incorporaciones incorrectas por la polimerasa (i.e., “infidelidad termodinámica”) y deben
evitarse. Con 50 a 200 µM, hay suficiente precursor para sintetizar aproximadamente 6.5 y 25 µg de
ADN, respectivamente (Erlich 1989 & Innis et al.1990). Los dNTP parecen enlazarse
cuantitativamente al Mg+2, la cantidad de dNTP presente en la reacción determinarán la cantidad de
34
magnesio libre disponible. En la reacción estándar, los cuatro trifosfatos son agregados a una
concentración final de 0.8 mM; esto deja 0.7 mM de los originales 1.5 mM MgCl2 que no están
acomplejados con los dNTP (Erlich 1989).
H. Polimorfismo de Longitud de Fragmento Amplificado (Amplified fragment length
polymorphism, AFLP)
El análisis por AFLP pertenece a la categoría de restricción selectiva de técnicas de
amplificación de fragmentos, que están basadas en la ligación de adaptadores (i.e, ligadores y
marcadores) a fragmentos de restricción genómicos seguido de una amplificación basada en PCR
con cebadores adaptador-específicos. Para el análisis por AFLP solo una pequeña cantidad de ADN
genómico purificado es necesitado; este es digerido con dos enzimas de restricción, una con una
frecuencia promedio de corte y una segunda con una frecuencia de corte mayor. Los
oligonucleótidos adaptadores de doble hebra son designados de tal forma en que el sitio de
restricción inicial no sea restablecido luego de la ligación, lo que permite una restricción y ligación
simultánea, mientras que los fragmentos religados son cortados nuevamente, figura 8 (Savelkoul et
al.1999).
35
Figura 8: Representación del principio de análisis de AFLP. 1) mutaciones puntuales incorporadas
en el adaptador de secuencias para prevenir la digestión luego de la ligación, la cual esta sombreada;
2) uno de los cebadores o cebadores esta marcado. En esta representación ambos cebadores
contienen un nucleótido selectivo (sombreado) en el fragmento desconocido.
Fuente: Salvelkoul et al. 1999.
Una alícuota es sujeta a dos amplificaciones por PCR bajo condiciones altamente
estringentes con cebadores adaptador-específicos que tienen en sus extremos 3’ una extensión de
uno a tres nucleótidos corriendo en el fragmento de restricción cromosomal desconocido. Una
extensión de un nucleótido selectivo amplifica de 1 a 4 de los fragmentos ligados, mientras que tres
nucleótidos selectivos en ambos cebadores amplifica de 1 a 4,096 de los fragmentos. El primer de
PCR que expande los sitios promedio de restricción es marcado. Luego de la electroforesis con gel
de poliacrilamida se obtiene un patrón informativo de 40 a 200 bandas (Savelkoul et al.1999).
Los diferentes patrones obtenidos son debidos a: i) mutaciones en los sitios de restricción,
ii) mutaciones en las secuencias adyacentes a los sitios de restricción y complementarios a las
extensiones de los cebadores y iii) inserciones o deleciones dentro de los fragmentos amplificados
(Savelkoul et al.1999).
1. Aplicaciones de AFLP. Los marcadores de AFLP han encontrado las más amplias
aplicaciones en el análisis de la variación genética abajo del nivel de especie particularmente en la
investigación de estructura y diferenciación de poblaciones, particularmente en la variación genética
36
de poblaciones. Tales análisis son cruciales para la conservación de la genética. La rapidez con la
cual los marcadores de AFLP pueden ser generados pueden aportar información crucial para la
toma de decisiones relacionadas con la conservación natural (Ulrich 1999).
Aparte de los problemas de la estructura y variación poblacional, los marcadores de AFLP
han sido aplicados para evaluar el flujo genético y la dispersión, las cruzas, introgresión y los casos
de hibrización. La alta resolución de los marcadores de AFLP permite realizar pruebas de identidad
clonal entre individuos (i.e., ausencia de recombinación), y así permite realizar inferencias acerca de
los modos de reproducción sexual y asexual. Debido a que los métodos de AFLP pueden generar
marcadores polimorficos en todo el genoma sin conocimiento previo de la secuencia, los
marcadores de AFLP han sido utilizados para generar mapas de unión. Éstos han sido utilizados
para el análisis de rasgos cuantitativos de loci (“quantitative trait loci”, QTL) para la determinación
de los rasgos de las plantas de importancia agronómica, tales como resistencia a enfermedades,
tolerancia a la sal, etc (Ulrich 1999).
2. Características de la técnica de AFLP
a. Reproducibilidad y robustez.
Dado que pequeñas cantidades de ADN son
digeridas y la detección de fragmentos de AFLP no depende de la hibridización, digestión parcial y
patrones borrosos, los cuales son fuente de irreproducibilidad en el genotipado con la tecnica de
restricción de longitud de fragmento polimórfico (restriction fragment length polymorphism, RFLP)
pueden ser fácilmente evitados. La posibilidad de utilizar además temperaturas de anelación
astrigente en el PCR, lo cual hace del AFLP una técnica más robusta que la amplificación al azar de
ADN polimórfico (random amplified polymorphic DNA, RAPD) (Ulrich 1999).
b. Eficiencia y Tiempo. Los marcadores de AFLP pueden ser generados a una gran
velocidad (Ulrich 1999).
c. Resolución. Dado el número ilimitado de marcadores que pueden ser generados
con esta técnica, usando una serie de combinaciones que la posibilidad de que un marcador de
AFLP se encuentre en regiones variables aumenta, revelando entonces diferencias genéticas
menores con el grupo de comparación (Ulrich 1999).
37
I. Electroforesis
1. Generalidades. Es un método de separación que se basa en la diferente velocidad de
migración de las especies cargadas, en el seno de una disolución amortiguadora a través de la cual
se aplica un campo eléctrico constante. Se ha aplicado a un conjunto de problemas de separaciones
analíticas dificultosas: aniones y cationes inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas (aminas activas,
hormonas proteicas), fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
nucleótidos, polinucleótidos y otras especies (Skoog et al., 2001).
2. Fundamento. El campo eléctrico actúa solamente sobre los iones. Si dos especies difieren,
bien en la carga o en las fuerzas de rozamiento, se moverán a través del tampón y se separan. Las
especies neutras no se separan. La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un analito
cargado, a partir del tamaño y de la forma del ión y de la viscosidad del medio en el cual migra.
Para iones del mismo tamaño la fuerza impulsora será mayor, en el de mayor carga, y tendrá una
velocidad de migración más rápida. Para los iones que presenta la misma carga la fuerza de retardo
por rozamiento será más pequeña, en el ion más pequeño, y tendrá una velocidad de migración más
rápida. La relación carga-tamaño de los iones combina estos dos efectos (Skoog et al., 2001).
3. Mecanismos de separación.
a) Geles de poliacrilamida. Se utiliza para la separación de moléculas de ADN que difieren
en longitud por solo un nucleótido. La electroforesis en gel de poliacrilamida es usada para
examinar las familias de moléculas cadena-terminadas de ADN resultando en un experimento de
secuenciación. La electroforesis en gel de agarosa no puede ser utilizada para este propósito debido
a que no tiene el poder de resolución necesario para separar moléculas de hebra única de ADN que
difieren en longitud por sólo un nucleótido. Los geles de poliacrilamida tienen un tamaño menor de
poros que los geles de agarosa y permiten separaciones precisas de moléculas de 10-1500 pb. Así
como secuenciación de ADN, los geles de poliacrilamida son también usados para otras
aplicaciones donde se requieren separaciones finas de ADN, por ejemplo en el análisis de loci
microsatélites (Brown, 2006).
Un gel de poliacrilamida consiste de cadenas de monómeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) entrelazadas con unidades de N,-N’-metilenbisacrilamida (CH2=CH-CO-NH-CH2-NHCOCH-CH2), la última es comúnmente llamada “bis”. El tamaño del poro está determinado por la
38
concentración total de ambos monómeros (acrilamida + bis) y la razón de acrilamida a bis. Una
concentración de gel al 8% se utiliza para leer una secuencia cercana a la de un primer (una
resolución de moléculas de 50-400 nucleótidos de longitud) o disminuirla al 4% para leer una
secuencia más distante (500-1500 nucleótidos del primer). La polimerización de la solución de
acrilamida: bis es iniciada por el persulfato de amonio (APS) y catalizada por N,N, N’,N’tetrametiletilendiamina (TEMED) (Brown, 2006).
Los geles de poliacrilamida son preparados entre dos placas de vidrio separadas por
espaciadores. Este arreglo sirve para dos propósitos. Primero, permite que se haga un gel muy
delgado (< 1 mm), que facilita la lectura de la secuencia al aumentar la nitidez de las bandas y
segundo, asegura que la polimerización, la cual es inhibida por el oxígeno, ocurra uniformemente a
través del gel (Brown, 2006).
39
PARTE III
III.1. RESULTADOS
A. Lugares de colecta
Papayas criollas. Se identificaron tres lugares de muestreo, descritos a continuación. El
muestreo se llevo a cabo durante el mes de julio, 2008, en el municipio de Nueva Concepción,
Escuintla, anexo figuras 9-11. Se visitaron fincas de papaya criolla, específicamente en las
plantaciones de Las Trochas (N 14°03’27.7”, O 91°19’47.4”), El paraíso (N 14°09’26.3”, O
91°17’22.7”) y en un vivero ubicado también en Nueva Concepción llamado Las Pozas (N
14°09’48.7”, O 91°16’26.0”).
Papayas silvestres. El departamento de Ciencias Agroforestales de la Universidad del Valle,
proporcionó a este proyecto cuatro muestras de papaya silvestre, anexo figura 12, Carica mexicana,
procedentes del departamento de El Petén, específicamente de la localidad de El Caoba
(N18°84’74.5”, E16°22’02.93”) y El Pesquero (La Libertad, sin coordenadas disponibles), las
cuales fueron colectadas durante el mes de agosto, 2008.
B. Muestreo
1. Plantas. El muestreo utilizado fue el modelo de tipo zigzag.
2. Hojas. Las hojas de papaya criolla fueron tomadas de la siguiente forma: Se cortó el peciolo
de la hoja, la cual fue seguidamente retirada y almacenada en bolsas de polietileno con cremallera
plástica. Se debe hacer notar que la tijera de jardinero con la cual se cortaban las hojas de papaya se
limpió con etanol al 80%.
3. Plántulas. Las 26 plántulas de aproximadamente 4 semanas de vida y de 15 cm de altura
fueron adquiridas en el vivero, escogidas al azar por el propietario del mismo.
A todas las muestras de papaya, tanto criolla como silvestre, se les realizó la prueba de ensayo
enzimático ELISA (Enzyme-linked Inmunosorbent Assay), para determinar si las muestras estaban
infectadas con el virus papaya ringspot virus, PRSV, ver figura 13. Si la muestra resultaba infectada
40
ésta era inmediatamente descartada de su participación en el estudio. Los resultados y el protocolo
se adjuntan a continuación:
Figura 13: Fruto de papaya con anillos oscuros en su superficie, signo característico de infección
con PRSV, Nueva Concepción, Escuintla.
Fuente: FODECYT 024-2007.
C. Prueba de ELISA directo
Se realizó la prueba de ELISA a un total de 51 muestras de papaya criolla: 26 muestras de hojas de
plántulas de papaya criolla adquiridas en el vivero, 10 muestras de hojas de papaya criolla de la
plantación El Paraíso y a 15 muestras de hoja de papaya de la plantación de Trochas. Todas estas
procedentes de Nueva Concepción, Escuintla, cuadro 11.
41
Cuadro 11: Muestras de papaya criolla analizadas por medio de la técnica de ELISA para la
detección de PRSV.
Muestra
Papaya Criolla
Vivero
El paraíso
Trochas
Total
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
51
ELISA
PRSV (-)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
26
ELISA
PRSV (+)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
25
Fuente: FODECYT 024-2007.
Se realizó la prueba de ELISA a las 4 muestras de papaya silvestre donadas al estudio por el Ing.
Castañeda, cuadro 12.
42
Cuadro 12: Muestras de papaya silvestre analizadas por medio de la técnica de ELISA para la
detección de PRSV.
Muestra
Papaya Silvestre
El Caoba
El Pesquero
Total
ELISA
ELISA
No.
PRSV (-) PRSV (+)
1
0
1PsC
1aPsP
1
0
2bPsP
1
0
1
0
3cPsP
4
4
0
Fuente: FODECYT 024-2007.
D. Selección de cebadores
Debido a que la técnica de AFLP era un procedimiento de laboratorio ya optimizado, se
decidió utilizar inicialmente los cebadores recomendados por Illescas, 2006, cuadro 13.
Cuadro 13: Cebadores probados por Illescas, 2006.
E-ACT / M-CAG
E-AGC / M-CAT
E-AGG / M-CTT
E-AGG / M-CAT
Fuente: FODECYT 024-2007.
E-AGG / M-CAT, es el par de cebadores con el que Illescas, obtuvo una mayor cantidad de
bandas para los tres tipos de papaya que probó para su trabajo de tesis, incluyendo papaya criolla, lo
que le permitió una mejor identificación de polimorfismos. Sin embargo, debido a que no se tenía
información previa acerca de los posibles pares de cebadores con los cuales se pudieran obtener una
mayor cantidad de bandas para papayas silvestres se decidió utilizar las siguientes 12
combinaciones de cebadores, escogidas totalmente al azar, además de incluir nuevamente a los 4
pares de cebadores ya probados por Illescas, 2006, cuadro 14.
Cuadro 14: Combinaciones de cebadores probadas para el estudio, incluyendo a los ya probados por
Illescas, 2006.
E-AAC / M-CAA
E-ACT / M-CAG
E-AGG / M-CAT
E-AGC / M-CTG
E-AAG / M-CAC
E-ACC / M-CAT
E-ACG / M-CTA
E-AGC / M-CTT
E-ACA / M-CAG
E-AGC / M-CAT
E-ACT / M-CTC
E-AGG / M-CTT
Fuente: FODECYT 024-2007.
Con estos cebadores se pretendía abarcar y utilizar todas las posibles combinaciones de cebadores
para comprobar si se obtenían buenos resultados luego de su utilización en papaya silvestre. Luego
de las pruebas correspondientes se encontró que al igual que en las papayas criollas, el par de
cebadores E-AGG / M-CAT, fue el par con el que se obtuvo la mayor cantidad de bandas en
papaya silvestre, ver por ejemplo la figura 14. Por esta razón, se decidió utilizar este par para
43
realizar la prueba de AFLP en las muestras de papaya obtenidas en este estudio. Se encontró que la
mayoría de los pares de cebadores no amplificaron o solamente presentaron de 1-15 bandas, por lo
que no clasificaban para entrar en el criterio de selección aplicado previamente por Illescas, 2006 y
Ávalos 2004 para escoger los pares de cebadores a utilizar en sus respectivos estudios. Con este
criterio (20-32 bandas) se pretendía poder escoger la combinación de iniciadores que presentara una
mayor cantidad de bandas posibles para lograr una mejor caracterización.
Figura 14: Gel A, utilizando los cebadores E-AGG / M-CAT y Gel B, utilizando los cebadores EAAC / M-CAA. Puede observarse una mayor cantidad de bandas en el Gel A que en el Gel B.
A
B
Fuente: FODECYT 024-2007.
44
E. Resultados obtenidos a partir de la prueba de ELISA para la detección del virus PRSV, en
muestras de papaya criolla y silvestre colectada.
La condición inicial de las muestras de papaya criolla y silvestre para poder ser analizadas
por AFLP era que presentaran una prueba de ELISA negativa para el virus PRSV. De las 90
muestras recolectadas se analizaron 55 muestras, 51 de papaya criolla y 4 de papaya silvestre, libres
del virus PRSV. Las muestras analizadas de papaya criolla fueron elegidas al azar a partir de las
muestras de hojas colectadas anteriormente durante la primera gira del proyecto y que no
presentaran sintomatología del virus luego de su análisis por ELISA. Se encontraron 26 muestras
negativas para el virus de 51 muestras de papaya criolla y de las 4 muestras de papaya silvestre que
fue donada al proyecto, ninguna presentó infección.
Aplicando la proporción binomial y su intervalo de confianza al 95% respectivo, se
encontró que más de la mitad de la totalidad de las muestras, 51% (IC95% 38-64%), de papaya
criolla recolectadas no estaban infectadas con el virus PRSV, ver cuadro 15. La totalidad de las
muestras de papaya silvestre, (IC95% 51-100%), no estaban infectadas con PRSV, cuadro 15.
Muestra
papaya criolla
papaya silvestre
r
n
p
A
B
26
51
0.5098
55.8416 14.5122
4
4
1.0000
11.8416 3.8416
Sn
55
Cuadro 15: Proporción binomial de muestras de papaya criolla y silvestre
C
109.6832
15.6832
IC (sup)95%
0.6414
1.0000
IC (inf)95%
0.3768
0.5101
Dentro de los tres lugares de muestreo de papaya criolla se encontró que de 51 muestras
elegidas al azar, 26 del vivero en Las Pozas, 15 de la plantación de Trochas No. 5 y 10 de la
plantación Paraíso, solo las plantas del vivero estaban sanas. Por esta razón se decidió utilizar éstas
muestras para el análisis por medio de AFLP. Se esperaba encontrar un mayor número de muestras
de papaya silvestre durante las giras, pero desafortunadamente ese no fue el caso. Por otro lado,
ninguna de estas muestras estaba infectada con virus PRSV, por lo que pudo ser analizada por
medio de AFLP.
45
F. Resultados obtenidos a partir del análisis por medio de AFLP de las muestras de papaya criolla y
silvestre colectada.
1. Dendrograma. Luego del análisis por medio de la técnica de ELISA y que ésta diera un
resultado negativo se procedió a analizar por medio de AFLP las muestras de papaya criolla y
silvestre seleccionadas. Para el análisis por medio de AFLP no se utilizaron plantas infectadas con
virus PRSV, debido a que no se sabía de qué manera iba afectar la infección a la visualización de
las bandas en el gel. La infección podría afectar ya fuera agregando bandas que pertenecieran al
genoma del virus o bien alterando por medio de mutaciones el genoma de las muestras de papaya.
Debido a estas razones, sólo se analizaron muestras libres de infección.
Se analizaron las 26 muestras de papaya criolla colectadas en el vivero de Pozas, Nueva
Concepción, Escuintla. Se encontró que todas las muestras presentaban el mismo perfil genético,
por lo que se concluyó que las mismas provenían de las mismas plantas generadoras. A partir de
esto, solo se corrió una de las muestras de papaya criolla escogida al azar junto con las otras cuatro
muestras de papaya silvestre para obtener un dendrograma con el fin de encontrar relaciones
filogenéticas entre los especimenes analizados. El dendrograma se obtuvo utilizando el programa
TotalLab, Nonlinear Dynamics TL120 DM (version 2006f, United Kingdom), ver figura 15.a. y .b..
En este dendrograma, figura 15.a. y .b., se puede observar que se encuentran agrupados en
un mismo grupo de genes6 todos las muestras de papaya silvestre a excepción de la muestra de
papaya silvestre de El Caoba, Peten (1PsC).
6
Grupo de genes o gene cluster: es un grupo de genes adyacentes que son idénticos o están relacionados.
46
Figura 15.a.: Dendrograma UPGMA7 que muestra los polimorfismos y la similitud genética entre
las muestras de papaya criolla obtenidas del vivero de Pozas, Nueva Concepción, Escuintla y cuatro
muestras de papaya silvestre obtenidas de El Petén. Muestra 1) papaya criolla del vivero de Pozas,
Nueva Concepción Escuintla; Muestra 2) papaya silvestre 1aPsP, proveniente de El Pequero, El
Petén; Muestra 3) papaya silvestre 2bPsP, proveniente de El Pesquero, El Petén; Muestra 4) papaya
silvestre 3cPsP, proveniente de El Pesquero, El Petén y Muestra 5) papaya silvestre muestra 1PsC,
proveniente de El Caoba, El Petén. (TotalLab, Nonlinear Dynamics TL120 DM (version 2006f,
United Kingdom)).
Muestra 5
A
Muestra 4
D
Muestra 3
B
Muestra 2
C
Muestra 1
Fuente: FODECYT 024-2007.
7
Método de Grupos Pareados no Pesados con Media Aritmética (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean, UPGMA) es un método directo para la construcción de dendrogramas. Su propósito
original era construir fenogramas taxonómicos, los cuales son dendrogramas que reflejan las similitudes
fenotípicas entre las unidades taxonómicas operacionales (Operational Taxonomic Units, OTUs). El método
utiliza un algoritmo secuencial de grupos de genes, en el cual la homología local entre OTUs está identificada
en orden de similitud y el dendrograma es construído de esa manera. Los dos OTUs que son más parecidos
entre sí son los primeros en determinarse y luego estos son tratados como un nuevo OTU compuesto.
Subsecuentemente, dentro del nuevo grupo de OTUs (compuesto y simple), el par con la similitud más alta es
identificado y agrupado. Esto continúa hasta que solo quedan dos OTUs (Ulrich, 1999).
47
Figura 15.b.: Bandas utilizadas para la elaboración del dendrograma UPGMA.
No.
Banda 1
Banda 2
Banda 3
Banda 4
Banda 5
Banda 6
Banda 7
Banda 8
Banda 9
Banda 10
Banda 11
Banda 12
Banda 13
Banda 14
Banda 15
Banda 16
Banda 17
Banda 18
Banda 19
Banda 20
Banda 21
Banda 22
Banda 23
Banda 24
Banda 25
Banda 26
Banda 27
Banda 28
Banda 29
Banda 30
Banda 31
Banda 32
Banda 33
Banda 34
Banda 35
Banda 36
Banda 37
Banda 38
Banda 39
Banda 40
Banda 41
Banda 42
Banda 43
Banda 44
Banda 45
Banda 46
Banda 47
Banda 48
Banda 49
Banda 50
Banda 51
Banda 52
papaya
criolla (Las
pozas)
1
1
1
1
1
1
1
1aPsP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3cPsP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1PsC
1
1
1
1
1
2bPsP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
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1
1
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1
1
1
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1
1
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1
1
1
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fuente: FODECYT 024-2007.
La primera división marcada con A, muestra una homología de un 69% entre la muestra de
papaya silvestre, PsC con el resto de muestras tanto silvestres como de criolla. La división marcada
con B muestra un 73% de homología entre ambos grupos. En este segundo grupo marcado con B,
congrega a los otros individuos, muestras 1-4, se subdivide en dos grupos más, marcados con C y
D. En la subdivisión marcada con C se encuentran agrupados los individuos pertenecientes a estas
dos variedades, criolla y silvestre, muestra 1 y 2, en un mismo subgrupo, con una homología entre
sus individuos del 85%. El otro subgrupo marcado con D, agrupa a dos variedades de papaya
48
silvestre, muestra 3 y 4, la homología entre ambos individuos es de un 85.5%, ver además cuadro
16.
La construcción de este dendrograma con el par de cebadores seleccionado, presenta gran cercanía
entre los individuos de ambas variedades. Con este cuadro se corroboran los datos obtenidos a partir
del dendrograma, presentando en este caso la homología al comparar cada una de las muestras entre
sí y las demás.
Cuadro 16: Homología presentada entre las muestras. Las muestras con una mayor homología
fueron la muestra 1 y 2 con un 85% al igual que la 3 y 4 con un 85%. Las muestras que presentaron
una menor homología fueron la 3 y la 5 con un 62%. (TotalLab, Nonlinear Dynamics TL120 DM
(version 2006f, United Kingdom)).
Muestra
1
2
3
4
5
1
1
0.85 0.69 0.71 0.74
2
0.85
1
0.75 0.76 0.68
3
0.69 0.75
1
0.85 0.62
4
0.71 0.76 0.85
1
0.72
5
0.74 0.68 0.62 0.72
1
Fuente: FODECYT 024-2007.
49
III.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A diferencia de Illescas, 2006 todas las muestras de éste estudio fueron previamente
analizadas por medio de la técnica de ELISA para descartar a todas las muestras infectadas con
virus PRSV. Debido a que no provenían de semillas certificadas y el primer criterio de selección era
que no estuvieran infectadas por este virus. Esto se hizo, debido a que como se dijo anteriormente,
no se sabía de qué manera iba afectar la infección a la visualización de las bandas en el gel. La
infección podría afectar ya fuera agregando bandas que pertenecieran al genoma del virus o bien
alterando por medio de mutaciones el genoma de las muestras de papaya.
Debido a estas razones, sólo se analizaron muestras libres de infección. Se esperaba
encontrar que al menos un 50% de las muestras pertenecientes a las plantaciones y el 100% de las
plantas del vivero estuvieran sanas. Con ello proporcionar al estudio una mayor variabilidad, para el
análisis por medio de AFLP. En cuanto a las muestras de papaya silvestre, se contó para el estudio
con 4 muestras. Proporcionadas por la dirección del Departamento de Ciencias Agroforestales de la
Universidad del Valle.
Los datos obtenidos a partir de la prueba de ELISA fueron analizados utilizando
proporciones binomiales y su intervalo de confianza al 95%. Con esta prueba se encontró que
ninguna de las 25 muestras de papaya criolla escogidas al azar de las plantaciones podía ser
utilizada para su posterior análisis por medio de AFLP debido a que estaban infectadas con PRSV,
cuadro 11. Esto podría deberse al descuido en el que ambas plantaciones estaban favoreciendo a la
multiplicación de áfidos transmisores del virus PRSV. Las muestras del vivero resultaron todas
negativas para la infección con PRSV, por lo que fueron analizadas por medio de AFLP ya que se
encontraban dentro del criterio de selección. Las condiciones existentes en el vivero según una
inspección visual efectuada durante la visita denotaron un mayor cuidado del cultivo sin presencia
aparente de signos de enfermedad viral. Los resultados obtenidos se tradujeron en un 51% (IC95%
38-64%) de muestras sanas del total de muestras de papaya criolla. Esta misma prueba fue aplicada
a papayas silvestres, las cuales todas salieron negativas para la infección, por lo cual todas fueron
analizadas para AFLP.
Una vez comprobado que las 30 muestras tanto de papaya criolla como de silvestre, no
estuvieran infectadas se procedió al análisis por medio de AFLP. El criterio de selección de
50
cebadores fue el mismo que el utilizado por Illescas, 2006 y Ávalos, 2004. A diferencia de la
papaya criolla, la papaya silvestre no fue analizada por Illescas, 2006, por lo que se decidió utilizar
los cebadores mencionados en este mismo estudio además una prueba con 8 pares de cebadores
más, ver cuadros 13 y 14. El par: E-AGG / M-CAT, que Illescas (2006) encontró, producían un
mayor número de polimorfismos tanto para papaya criolla como para silvestre, por lo que se
procedió a realizar el análisis de AFLP de las muestras con este par de cebadores. Illescas obtuvo
con esta combinación una cantidad promedio de 23 polimorfismos para papaya criolla, mientras que
con este estudio se encontró una cantidad promedio de 22. En la papaya silvestre se observaron 21
bandas promedio en las 4 muestras procesadas. Por lo tanto los resultados obtenidos en cuanto al
par de cebadores que se utilizaron en este estudio se asemejan a los obtenidos en papaya criolla por
Illescas (2006). Dada esta compatibilidad de resultados, previamente discutidos a los obtenidos por
Illescas se puede validar la reproducibilidad de las condiciones utilizadas para el análisis de AFLP
en muestras de papaya criolla. Sirviendo esto como referencia para futuras aplicaciones en estudios
de papaya silvestre.
Debido a lo anteriormente dicho, se utilizó solamente una muestra de papaya criolla la cual
fue comparada con las cuatro muestras de papaya silvestre que se obtuvieron. En cuanto al
protocolo utilizado para la generación de los perfiles genéticos, se utilizó el recomendado por el
fabricante con algunas modificaciones tomadas a partir del trabajo de Illescas, 2006 (protocolo
optimizado para el trabajo dentro del laboratorio de protección vegetal). Con este par de cebadores
se encontró al igual que encontró Illescas (2006), que en la región de 500 a 800 pb era en donde se
encontraba la mayoría de las bandas, mientras que mostró una menor amplificación en regiones de
mediano y bajo peso molecular. Se puede decir entonces que la combinación E-AGG / M-CAT fue
útil en la identificación de individuos. Con esto se concuerda con los hallazgos encontrados por
Illescas (2006) ya que la especie Carica papaya L. presenta un bajo nivel de polimorfismos, esto
podría relacionarse con el tamaño relativamente pequeño de su genoma (372Mbp) (Ma et al., 2004).
Sin embargo es posible que algunas de las bandas pudieran haber sido omitidas debido a que si el
proceso de revelado no se detiene cuando es preciso, el fondo se tiñe de un tono que va de gris claro
a negro, que se confunde con las bandas.
La construcción de este dendrograma con el par de cebadores seleccionado, presenta gran
cercanía entre los individuos de ambas variedades, figuras 15.a. y .b. y cuadro 16. Cabe resaltar una
homología del 85% presentada entre la muestra de papaya criolla y la muestra 1aPsP de papaya
silvestre. Podría decirse que esta variedad de criolla podría ser una variación de esta papaya
51
silvestre, pudiéndose haber dado esto debido a procesos de cruces para mejora de cultivos de
manera empírica. Esto también podría sugerir que existió o existe un flujo genético entre ambas
poblaciones. Aunque la distancia geográfica que las separa es mucho mayor también podría deberse
a migraciones de habitantes o bien de fauna de ambas regiones. También puede notarse una
homología de 69% entre la muestra 1PsC y el resto de muestras. Esto denota, a pesar de que todas
las muestras de papaya silvestre sean de la misma región existe diferencia entre éstas. Podría decirse
que ésta muestra de papaya se habría conservado mejor, sin ninguna influencia de otras variedades
que el resto de muestras. Esto puede observarse en el perfil genético que presentó la misma,
evidenciándose con una menor cantidad de bandas que el resto de muestras. Aunque este estudio no
se enfoca en estos aspectos, ya que no se estudió el ambiente o genes específicos, esto podría ser
una posible explicación para el dendrograma. Este estudio, es más bien exploratorio para la
estandarización de la técnica de AFLP para papayas silvestres y reproduce resultados de estudios
previos para las papayas criollas. Mencionando la optimización de cebadores, la cantidad de
polimorfismos encontrados y los protocolos utilizados.
La importancia y la novedad de este estudio radica en que es un estudio que utilizó materiales
silvestres del país y que de éstos no se tenían noticias de estudios previos en Guatemala. Con este
estudio se estandariza la técnica de AFLP para este tipo de material. Limitaciones tales como
presupuesto y falta de muestras, ya fuera por limitación en número, lluvias e inicio en la siembra de
caña de azúcar lo cual limita la localización de papaya silvestre en el sur del país, o bien por
infección deben tomarse en cuenta para la realización de estudios posteriores a este, para que los
resultados sean estadísticamente significativos. Tomando en cuenta la información que este estudio
provee para la estandarización de la técnica de AFLP ésta puede aprovecharse para realizar estudios
posteriores de ecología, genotipificación, estudios de resistencia a virus, determinación de sexo en
papayas y caracterización de materiales silvestres, etc. Este es un estudio que abre las puertas a
estudios posteriores ya sea utilizando ésta técnica para un estudio más a fondo de éste tipo de
materiales. Pudiéndose obtener los primeros datos de perfiles genéticos de papayas silvestres de
Guatemala, con el par de cebadores seleccionados. Aunque no se pueden obtener conclusiones
claras o estadísticamente significativas debido a que el número tan reducido de muestras no permite
hacer este tipo de generalizaciones; se cumple con los objetivos de conocer la diversidad genética
de la papaya criolla y silvestre, de esta muestras de papayas, guatemaltecas por medio del
dendrograma obtenido del estudio, la estandarización la técnica de AFLP, con su respectivo
dendrograma y el aporte de plántulas de papaya para el inicio de un germoplasma con las mismas en
los viveros de la universidad.
52
PARTE IV
IV.1. CONCLUSIONES
1. Se estandarizó la técnica de AFLP para determinar la diversidad genética de las
muestras de papaya criolla y silvestre colectada.
2. A partir de la estandarización de la técnica, AFLP, se obtuvo como resultado un
dendrograma que permite conocer las relaciones filogenéticas entre ambos tipos de muestras, ver
figura 15.a. Partiendo de este dendrograma se puede conocer la diversidad genética de la papaya
criolla y silvestre, de esta muestras de papayas, de Guatemala.
3. Se elaboró un dendrograma que muestra las relaciones filogenéticas entre las
muestras recolectadas.
4. El dendrograma producido presenta las relaciones entre las muestras, de éste se deduce que
las muestras relacionadas entre sí forman subgrupos tales como el subgrupo formado por las
muestras 4 y 3, y 2 y 1. La muestra que menos se relaciona con las demás es la muestra 5.
5. Con este estudio, se donaron 26 plántulas de papaya criolla para dar inicio a la colección de
germoplasma del laboratorio de protección vegetal de la Universidad del Valle de Guatemala.
6. La técnica de genotipado molecular AFLP utilizada en este estudio fue estandarizada tanto
para papaya silvestre como criolla de acuerdo a los objetivos del estudio. El par de cebadores que
obtuvieron la mayor cantidad de bandas, ver figura 15.b., fue: E-AGG / M-CAT.
IV.2. RECOMENDACIONES
1. Realizar otros estudios cuyo interés principal, sea: el estudio y caracterización tanto
morfológica como genética de la papaya silvestre de Guatemala, y su localización exacta en el país.
2. Utilizar otras técnicas moleculares para el estudio de las papayas silvestres de Guatemala,
tales como SSCP para la comparación de polimorfismos en el ADN, etc.
3. Identificar y utilizar otros genes blanco para su caracterización y comparación con las
variedades hibridas existentes.
4. Promover en los agricultores la conservación de las plantas de papaya silvestre y no
destruirlas, ya que los sitios en donde se encuentran no soy muy accesibles, son escasos y muy
difíciles de encontrar. Esta planta representa un banco genético importante que debe explorarse para
una posible mejora de las otras variedades comerciales existentes. Creando programas de
conservación en las localidades mencionadas en este estudio y también en conjunto con otras
organizaciones como PROFRUTA localizar otras más.
5. Mantener en condiciones óptimas la colección de germoplasma contenida en los
laboratorios de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de Guatemala, especialmente a la
colección generada a partir de este estudio.
IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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58
IV.4. ANEXOS
ANEXO 1
A. Lugares de colecta
1. Papayas criollas.
a. Las Trochas. Ubicado en: N 14°03’27.7”, WO 91°19’47.4”
Figura 9: Frutos de papaya, planta de papaya y plantación muestreada en las Trochas No.5, Nueva
Concepción Escuintla.
Fuente: FODECYT 024-2007.
b. El Paraíso. Ubicado en: N 14°09’26.3”, WO 91°17’22.7”
Figura 10: Frutos de papaya, planta de papaya y plantación muestreada en las El Paraíso, Nueva
Concepción Escuintla.
Fuente: FODECYT 024-2007.
60
c. Vivero ubicado en Pozas. Ubicado en: N 14°09’48.7”, WO 91°16’26.0”
Figura 11: Vivero de papaya criolla ubicado en Pozas, Nueva Concepción, junto con su propietario,
Don Víctor Ilopapa.
Fuente: FODECYT 024-2007.
2. Papayas silvestres.
Figura 12: Hoja con inflorescencia de papaya silvestre de El Caoba (El Petén), hoja y fruto de
papaya silvestre de El Pesquero (El Petén).
Fuente: FODECYT 024-2007.
61
PARTE V
V.1. INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
QUINCEAVA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
Nombre del Proyecto:
Caracterización de papaya criolla y papaya silvestre (Carica Papaya L.) guatemaltecas mediante la
técnica de poliforsimo de longitud de gramento amplificado.
PRÓRROGA AL 31/03/2009
024-2007
1a.
PRÓRROGA AL 31/05/2009
Licda. Dinora Roche Recinos
2a.
Q75,000.00
Numero del Proyecto:
Investigador Principal:
Monto Autorizado:
01/12/2007 AL 30/11/2008
12 MESES
TRANSFERENCIA
Asignacion
Menos (-)
Mas (+)
Presupuestaria
Fecha de Inicio y Finalización:
Grupo
Renglon
Nombre del Gasto
181
122
133
Servicios no personales
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad
Q
Impresión, encuadernación y reproducción
Q
Viáticos en el interior
Q
163
Mantenimiento y reparación de equipo médicosanitario y de laboratorio
Q
1
2
241
243
261
262
269
291
323
MATERIALES Y SUMINISTROS
Papel de escritorio
Productos de papel o cartón
Elementos y compuestos químicos
Combustibles y lubricantes
Otros productos químicos y conexos
Útiles de oficina
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO
INTANGIBLES
Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio
GASTOS DE ADMÓN. (10%)
MONTO AUTORIZADO
(-) EJECUTADO
SUBTOTAL
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR
Q
En Ejecuciòn
Pendiente de
Ejecutar
Ejecutado
27,200.00
Q 19,200.00 Q
3,000.00 Q 400.00
Q
399.00 Q
960.00 Q 2,118.18 Q 3,000.00 Q
960.00 Q
3,800.00 Q 3,800.00
Q
Q
500.00 Q
174.50 Q
Q
500.00 Q
188.90 Q
Q 26,740.00 Q 26,738.22 Q
Q
900.00
Q
Q
25,721.82 Q 27,640.00 Q 3,918.18
Q
400.00 Q
119.00 Q
8,000.00
2,201.00
881.82
325.50
311.10
1.78
900.00
2,000.00
281.00
E
Q
Q
7,500.00 Q
6,818.18
2,000.00
Q
Q
4,852.59 Q
6,818.18
Q
75,000.00 Q 35,958.18 Q 35,958.18 Q 59,450.39
Q
Q
Q
75,000.00
59,450.39
15,549.61
Q
15,549.61
62
Disponibilidad
647.41
Q15,549.61
Q
15,949.61