Resumen: E-043 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006 Respuesta de bacterias lácticas autóctonas de Corrientes a residuos de detergentes y desinfectantes. Gioia, L. Marino - Vasek, Olga M. Laboratorio de Bromatología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE. Av. Libertad 5600 (Campus), 3400 Corrientes. omvasek@exa.unne.edu.ar. T.E.: 03783-457996, int. 110 Antecedentes Las cepas constituyentes de un fermento láctico, deben ser capaces de multiplicarse rápidamente en el sustrato utilizado a nivel industrial durante la producción, a fin de generar suficiente ácido láctico y diversos metabolitos que influyen en la elaboración y maduración de quesos. Esta actividad de los cultivos lácticos puede ser inhibida total o parcialmente, dando lugar a productos lácteos de escasa calidad o provocar fermentaciones fallidas, con la consiguiente pérdida económica. Los factores de mayor importancia involucrados en esta inhibición pueden ser: condiciones de fabricación del producto, composición de la leche y agentes inhibidores presentes en la misma (bacteriófagos, antibióticos, peróxido de hidrógeno, residuos de detergentes y/o desinfectantes por enjuagues inadecuados). Además de los efectos tóxicos que derivan de la presencia de estos compuestos en la leche, éstos pueden dar lugar, al desarrollo de olores y sabores extraños en la misma e interferir en la actividad de los cultivos iniciadores durante los procesos de fermentación, muchas células pueden ser inhibidas a bajas concentraciones y otras ser muy resistentes (Winniczuk, P. P. and M. E. Parish, 1997; Shidgu et al., 2001, Langsruda et al., 2003; Beltrán et al., 2005; Patton et al., 2005; Herrerosa, M. A. et al., 2005). Las Instituciones de investigación láctea proporcionan manuales de limpieza y desinfección, especificando que, con que, cuando lavar o desinfectar y las condiciones de uso (concentración, temperatura, tiempo de contacto) de cada agente particular para cada empresa también particular, pero no las condiciones de enjuague, temperatura del agua, cantidad de agua, tiempo de contacto. Si bien existe importante material bibliográfico directamente relacionado con el tema, la sensibilidad a estos agentes es “cepa-dependiente”. Por estas razones, y en virtud de que no existen datos propios al respecto, surge la inquietud de estudiar la acción de residuos de estos compuestos químicos en cepas salvajes de Corrientes. El objetivo de este trabajo fue evaluar la sensibilidad de las bacterias lácticas constituyentes del fermento “Gaucho” a residuos de detergentes y desinfectantes usados en las producciones artesanales queseras de Corrientes. Materiales y Métodos Microorganismos. Las bacterias lácticas (BAL) utilizadas en este estudio, constituyentes del Fermento “Gaucho”, pertenecen a la Colección biológica de bacterias lácticas autóctonas de Corrientes, FACENA, UNNE: Lactobacillus (Lb.) plantarum 77bVCOR, Lactococcus (Lc.) lactis subsp. lactis 35cVCOR, 138cVCOR, 199cVCOR y 207cVCOR. Reactivación y purificación de las cepas. Los microorganismos conservados originalmente en crioviales a -20ºC en medio LELg (leche, extracto de levadura, lactosa, glicerol) se descongelaron, se transfirieron a caldo MRS (Merck) o medio LAPTg (extracto de levadura, 10g; peptona, 15g; triptona, 10g; glucosa, 10g; twen 80, 1mL; agua destilada, 1000mL) según corresponda para lactobacilos y lactococos respectivamente, y se activaron “overnight” a 30 °C. A fin de obtener clones jóvenes y puros del organismo en estudio, se realizaron tres pasajes sucesivos en los respectivos medios sólidos y líquidos, y la pureza se verificó mediante microscopía directa. Relación entre el tiempo de incubación, el número de microorganismos y su absorción de luz visible. Cada cepa pura y activa, se incubó a 30 ºC durante 4 tiempos diferentes como mínimo. A cada tiempo, se determinaron: a) el número de microorganismos. Inóculos apropiados de las diluciones antes mencionadas, se sembraron por duplicado utilizando el método de inoculación y vertido. Las placas sembradas se incubaron a 30 ºC durante 48 h. b) absorción de luz visible a 560 nm mediante espectrofotometría. Soluciones de los detergentes y/o desinfectantes. Se utilizaron cinco compuestos que generalmente se integran a la formulación de detergentes y/o desinfectantes y un detergente comercial de base lauril eter sulfonato/alquil bencen sulfonato. El tipo de compuesto se seleccionó teniendo en cuenta cuales son los corrientemente adquiribles y utilizables en nuestro medio, y las concentraciones de ensayo de acuerdo con las usadas frecuentemente en industrias lácteas o propuestas por los fabricantes, según el detalle adjunto: soluciones stock de hidróxido de sodio, ácido fosfórico, ácido nítrico, compuestos de amonio cuaternario (QAC: cloruro de benzalconio) y detergente comercial de uso doméstico: 2 % (p/v), valoradas por alcalimetría/acidimetría (excepto el detergente). Concentraciones finales de ensayo: 2.0, 1.5, 1.0 y 0.5 %, respectivamente, solución stock de hipoclorito de sodio: 6 % (v/v), valorada por determinación de cloro activo según el método yodimétrico. Concentraciones finales de ensayo: 6.0, 4.0, 2.0, 1.0 y 0.5 %, respectivamente. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) según el método de microdifusión. Las células se incubaron hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial, se cosecharon por centrifugación (2600 rpm, 15 min), se Resumen: E-043 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006 lavaron tres veces con solución fisiológica (0.9 % NaCl p/v) y se resuspendieron en igual solución al volumen original. Una alícuota (1 mL) de la suspensión celular se sembró por inoculación y vertido usando agar duro (1.5 % agar), por duplicado para cada desinfectante. Sobre el agar duro inoculado sólido, se agregó el medio semisólido (0.6 % agar) que a su vez se dejó solidificar a temperatura ambiente y se realizaron los pocillos con un sacabocados. Una alícuota (15 µl) de cada dilución de cada compuesto químico a ensayar se colocó en un pocillo, y luego de incubar las placas durante 24 h a 30 ºC, se procedió a la lectura de los halos de inhibición y cuantificación mediante vernier. Reproducibilidad. Las experiencias se realizaron por triplicado. Discusión de resultados Considerando que los microorganismos constituyentes del Fermento “Gaucho” pertenecen a distintos Géneros microbianos (Lactococcus, Leuconostoc y Lactobacillus) o diferentes subespecies de una misma especie (Lc. lactis subsp. lactis y Lc. lactis subsp. diacetylactis), se debió tener en cuenta que los mismos poseen velocidades de crecimiento diferentes, y en consecuencia presentarán recuentos diversos a un mismo tiempo de incubación. Con el objetivo de estandarizar el número de células a utilizar en los ensayos en el orden de 108 ufc/mL, se determinó la relación entre la absorbancia a 560 nm y el recuento de microorganismos a distintos (al menos cuatro) tiempos de incubación. La tabla 1 muestra los tiempos de incubación correspondientes a la carga microbiana pretendida, para cada una de las cepas ensayadas. La correspondencia de la carga microbiana generada por cada tiempo de incubación y la absorbancia permitió disponer de una medida necesaria de modo rápido para establecer el recuento total previo a cada ensayo de concentración inhibitoria mínima. Tabla 1. Relación entre absorbancia, número de microorganismos y tiempo de incubación de BAL constituyentes del Fermento “Gaucho”. Los datos corresponden al valor promedio de tres experiencias. Cepas Tiempo incubación (h) Absorbancia 560 nm Lb. plantarum 77bVCOR Lc. lactis subsp. lactis 35cVCOR Lc. lactis subsp. lactis 138cVCOR Lc. lactis subsp. lactis 199cVCOR Lc. lactis subsp. lactis 207cVCOR 16.00 7.00 0.969 1.030 Número de microorganismos (ufc/mL) 9.7 108 1.95 108 7.00 1.105 1.07 108 15.00 1.064 1.06 109 15.00 1.095 9.80 108 Los tiempos de incubación mostrados en la tabla precedente fueron los utilizados para realizar las experiencias de sensibilidad. En las tablas 2-6 se presentan los resultados de los ensayos de concentración inhibitoria mínima para las diferentes cepas ensayadas. Con la observación de los datos obtenidos en forma global, se corrobora el carácter “cepadependiente” de la sensibilidad a los compuestos químicos empleados en la constitución de detergentes/desinfectantes. La cepa de Lb. plantarum mostró una marcada sensibilidad (Tabla 2) a todas las concentraciones de cloruro de benzalconio ensayadas, mediana resistencia a los restantes compuestos químicos y su crecimiento no fue afectado por el detergente comercial. Tabla 2. Sensibilidad de Lb. plantarum 77bVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición. NaOH HNO3 CC HI CC HI (%)a (mm)b (%)a (mm)b 2.0 0.46 2.0 1.90 1.5 0 1.5 0.56 1.0 0 1.0 0 0.5 0 0.5 0 a : Concentración b : Ancho del halo de inhibición H3PO4 CC HI (%)a (mm)b 2.0 1.88 1.5 0.50 1.0 0 0.5 0 - QAC CC (%)a 2.0 1.5 1.0 0.5 - HI (mm)b 12.56 12.25 12.00 11.69 - Detergente CC HI (%)a (mm)b 2.0 0 1.5 0 1.0 0 0.5 0 - NaOCl CC HI (%)a (mm)b 6.0 1.75 4.0 0 2.0 0 1.0 0 0.5 0 Resumen: E-043 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006 Las cepas de Lc. lactis subsp. lactis ensayadas, presentaron dos tipos de respuestas. Dos de ellas (199cVCOR y 207cVCOR) mostraron ser altamente resistentes (Tablas 5 y 6) al hidróxido de sodio y detergente, tolerantes a los ácidos nítrico y fosfórico e hipoclorito de sodio, y altamente sensibles a cloruro de benzalconio, en las condiciones de ensayo. Las dos restantes (35cVCOR y 138cVCOR) presentaron diferencias en la respuesta al hipoclorito de sodio (Tablas 3 y 4) frente al cual mostraron elevada resistencia. Tabla 3. Sensibilidad de Lc. lactis 35cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición. NaOH HNO3 CC HI CC HI (%)a (mm)b (%)a (mm)b 2.0 0 2.0 6.87 1.5 0 1.5 0.76 1.0 0 1.0 0 0.5 0 0.5 0 a : Concentración b : Ancho del halo de inhibición H3PO4 CC HI (%)a (mm)b 2.0 2.13 1.5 1.90 1.0 0.54 0.5 0 - QAC CC (%)a 2.0 1.5 1.0 0.5 - HI (mm)b 5.58 5.13 4.50 4.22 - Detergente CC HI (%)a (mm)b 2.0 0 1.5 0 1.0 0 0.5 0 - NaOCl CC HI (%)a (mm)b 6.0 0 4.0 0 2.0 0 1.0 0 0.5 0 Tabla 4. Sensibilidad de Lc. lactis 138cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición. NaOH HNO3 CC HI CC HI (%)a (mm)b (%)a (mm)b 2.0 0 2.0 1.81 1.5 0 1.5 1.00 1.0 0 1.0 0.54 0.5 0 0.5 0 a : Concentración b : Ancho del halo de inhibición H3PO4 CC HI (%)a (mm)b 2.0 2.24 1.5 1.66 1.0 0.38 0.5 0 - QAC CC (%)a 2.0 1.5 1.0 0.5 - HI (mm)b 5.87 5.52 5.37 3.92 - Detergente CC HI (%)a (mm)b 2.0 0 1.5 0 1.0 0 0.5 0 - NaOCl CC HI (%)a (mm)b 6.0 0 4.0 0 2.0 0 1.0 0 0.5 0 Tabla 5. Sensibilidad de Lc. lactis subsp. lactis 199cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición. NaOH HNO3 CC HI CC HI (%)a (mm)b (%)a (mm)b 2.0 0 2.0 0.62 1.5 0 1.5 0.50 1.0 0 1.0 0 0.5 0 0.5 0 a : Concentración b : Ancho del halo de inhibición H3PO4 CC HI (%)a (mm)b 2.0 1.67 1.5 0.67 1.0 0.60 0.5 0 - QAC CC (%)a 2.0 1.5 1.0 0.5 - HI (mm)b 2.75 2.58 2.00 1.54 - Detergente CC HI (%)a (mm)b 2.0 0 1.5 0 1.0 0 0.5 0 - NaOCl CC HI (%)a (mm)b 6.0 0.33 4.0 0 2.0 0 1.0 0 0.5 0 La elevada sensibilidad de todas las cepas componentes del fermento evaluadas hasta el momento de esta presentación al compuesto de amonio cuaternario ensayado (cloruro de benzalconio), manifiesta que residuos de este compuesto químico afectan marcadamente al crecimiento de las mismas. Sidhu et al. (2001) también detectaron una elevada sensibilidad de bacteria lácticas a los QACs, particularmente en cepas de Lc lactis y Leuconostoc mesenteroides, aisladas a partir de superficies de equipos en plantas procesadoras después de una desinfección con estos compuestos. Informando además, en las bacterias lácticas resistentes, niveles de resistencia superior a la exhibida por algunas bacterias patógenas (Listeria y Staphylococcus aureus) debida a genes de resistencia desconocidos. Esta respuesta permitiría eliminar a los QACs de la lista de compuestos recomendados a los elaboradores queseros de Corrientes, dado que podrían desequilibrar la composición del cultivo iniciador y en consecuencia la actividad metabólica del mismo. Resumen: E-043 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006 Tabla 6. Sensibilidad de Lc. lactis subsp. lactis 207cVCOR a diferentes compuestos químicos. Los resultados se expresan como x ½ longitud transversal (mm) del halo de inhibición. NaOH HNO3 CC HI CC HI (%)a (mm)b (%)a (mm)b 2.0 0 2.0 0.37 1.5 0 1.5 0.25 1.0 0 1.0 0 0.5 0 0.5 0 a : Concentración b : Ancho del halo de inhibición H3PO4 CC HI (%)a (mm)b 2.0 2.68 1.5 1.07 1.0 0 0.5 0 - QAC CC (%)a 2.0 1.5 1.0 0.5 - HI (mm)b 2.72 2.40 2.00 1.75 - Detergente CC HI (%)a (mm)b 2.0 0 1.5 0 1.0 0 0.5 0 - NaOCl CC HI (%)a (mm)b 6.0 0.33 4.0 0 2.0 0 1.0 0 0.5 0 Conclusiones Los resultados obtenidos hasta el momento con las cepas constituyentes del Fermento “Gaucho” ensayadas permiten concluir que: las 5 cepas evaluadas presentan una definida y fuerte sensibilidad al cloruro de benzalconio, el efecto inhibitorio del QAC en la cepa 77bVCOR (Lb plantarum) es superior al ocasionado en las cepas de Lc. lactis subsp. lactis, el detergente comercial de base lauril eter sulfonato/alquil bencen sulfonato no ejerce efectos adversos, el hidróxido de sodio afecta solamente al crecimiento de Lb. plantarum, la tolerancia a los ácidos nítrico y fosfórico, y al hipoclorito de sodio es de grado diverso. 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