procedimiento para la desintegracion de acidos nucleicos y

k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k kInt. Cl. : A61K 39/12 11 Número de publicación: 7 51 ESPAÑA k 2 185 003 A61L 2/00 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 12 kNúmero de solicitud europea: 97915196.6 kFecha de presentación: 08.04.1997 kNúmero de publicación de la solicitud: 0 900 087 kFecha de publicación de la solicitud: 10.03.1999 T3 86 86 87 87 k 54 Tı́tulo: Procedimiento para la desintegración de ácidos nucleicos en materiales biológicamente activos. k 73 Titular/es: Baxter Aktiengesellschaft k 72 Inventor/es: Dorner, Friedrich; k 74 Agente: Gil Vega, Vı́ctor 30 Prioridad: 09.04.1996 AT 629/96 Industriestrasse 67 1221 Wien, AT 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 16.04.2003 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: ES 2 185 003 T3 16.04.2003 Aviso: k k Barrett, Noel y Eibl, Johann k En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid ES 2 185 003 T3 DESCRIPCION Procedimiento para la desintegración de ácidos nucleicos en materiales biológicamente activos. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 La presente invención se refiere a la desintegración de ácidos nucleicos biológicamente activos en un material biológicamente activo mediante la acción de un rayo láser sobre un material biológico -en caso dado tratado con una sustancia fotodinámica-, que conduce a un producto biológico no infeccioso, en el que en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo está desintegrado, conservándose al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del material biológico, como la antigenicidad, la inmunogenicidad, el carácter protector o caracterı́sticas enzimáticas. La invención se refiere también a la elaboración de medios biológicos, como vacunas, productos proteı́nicos generados mediante técnicas de ingenierı́a genética, anticuerpos monoclonales o factores sanguı́neos, en los que en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo está desintegrado. Ya se conocen la utilización de lı́neas celulares continuas (continuous cell lines, CCL) para la elaboración de productos biológicos terapéuticos y los problemas de los ácidos nucleicos contaminantes en productos biológicos, ası́ como la inactivación de ADN residual contaminante en estos productos biológicos. Mientras que determinados productos, como proteı́nas recombinantes, vacunas o anticuerpos monoclonales, se producen de forma eficaz utilizando células de vertebrados, otros productos proteı́nicos determinados de células utilizadas habitualmente no son fácilmente obtenibles debido al bajo ı́ndice de producción de la proteı́na en dichas células. Las autoridades competentes prohı́ben el uso de células de mamı́feros, que son fácilmente cultivables, para la elaboración de proteı́nas generadas mediante técnicas de ingenierı́a genética y su utilización para fines terapéuticos y profilácticos en humanos o animales. Se propuso utilizar lı́neas celulares de mamı́feros para la elaboración mediante técnicas de ingenierı́a genética de muchos productos con contenido de proteı́nas, ası́ como para la elaboración de vacunas de virus. Sin embargo, la utilización de estas lı́neas celulares puede implicar determinados problemas. Muchos productos no son liberados o segregados directamente en el medio de cultivo por las células de mamı́feros. Por consiguiente, para obtener esos productos frecuentemente es necesario romper las membranas celulares para liberar estos productos al medio, de donde se pueden aislar o purificar posteriormente. Sin embargo, dicha rotura también libera al medio ácido nucleico de las células. Especialmente debido a que muchas lı́neas celulares fácilmente cultivables son lı́neas celulares de mamı́feros tumorogénicas transformadas con potencial oncogénico, como células MDCK o células SK-Hep, es necesario asegurar que no haya ningún ácido nucleico activo como contaminación en el producto final con contenido de proteı́nas o en el preparado de vacuna. Por ello se llevaron a cabo intentos de inactivar los ácidos nucleicos celulares que pudieran estar asociados con un riesgo de oncogenicidad. La vacunación contra enfermedades vı́ricas fue uno de los objetivos principales de la medicina a lo largo del siglo pasado. Si bien se desarrollaron vacunas eficaces contra una gran cantidad de enfermedades, el desarrollo de vacunas más seguras y eficaces para una serie de otras enfermedades, como por ejemplo infecciones por el HIV, sigue siendo problemático. La utilización de agentes vı́ricos inactivados o destruidos como vacuna, aunque en general es segura, no siempre es eficaz si las caracterı́sticas inmunogénicas del agente han variado. Sin embargo, si se utiliza un virus virulento altamente infeccioso para generar la vacuna, ha de asegurarse que el procedimiento de inactivación conduce a la pérdida total de la infecciosidad. La utilización de agentes vı́ricos vivos atenuados como vacuna conduce con frecuencia a una reactividad inmunológica mejorada, pero aumenta el riesgo asociado con las vacunas de que la propia vacuna sea infecciosa. Por ejemplo, el virus puede retornar a una forma virulenta activa y se puede multiplicar y propagar en el organismo, lo que conduce a una enfermedad. Por consiguiente, cuando se hace una elección entre preparados de vacuna vivos, atenuados e inactivados, en general se ha de escoger entre una mejor eficacia y una mayor seguridad. La elección es especialmente difı́cil cuando el virus es resistente a los procesos de inactivación y requiere condiciones de inactivación muy rigurosas, con lo que aumentan las posibilidades de que las caracterı́sticas antigénicas resulten afectadas. Se conocen diferentes técnicas para destruir o inactivar virus con el fin de utilizarlos como vacuna. Entre estas técnicas se cuentan los tratamientos quı́micos o fı́sicos, por ejemplo inactivación con formaldehı́do, hidroxil-amina, β-propio-lactona, radiación UV o colorantes fotodinámicos, por ejemplo azul de metileno y luz visible. A pesar de estas revelaciones generales, es necesario mejorar la selectividad de estos procedimientos de inactivación de tal modo que las envolturas proteicas vı́ricas conserven mejor su integridad y que al mismo tiempo se aumenten los ı́ndices de inactivación/destrucción. 2 ES 2 185 003 T3 5 10 15 20 25 Uno de los principales problemas de las vacunas de virus inactivados consiste en que, si el proceso de inactivación del ácido nucleico vı́rico no es completo, existe el riesgo de que el ácido nucleico vı́rico sea administrado a un huésped correspondiente a la vacuna de virus y con ello, en determinadas circunstancias, sea por sı́ mismo infeccioso. Por ejemplo, el ARN de HIV puede experimentar una transcripción inversa por enzima vı́rica o celular e integrarse en el genoma del huésped, lo que conduce a una replicación del HIV. Se han hecho muchos esfuerzos por inactivar virus en una muestra, como vacunas o plasma, o ácidos nucleicos, y conservar al mismo tiempo las propiedades antigénicas e inmunogénicas de las proteı́nas en dicha muestra. El documento US 5,106,619 describe una vacuna de virus con caracterı́sticas antigénicas e inmunogénicas conservadas, generada mediante inactivación de virus con envoltura y sin ella con luz UV en presencia de fourocumarina en una atmósfera no oxidante. El documento US 4,880,512 describe un procedimiento para el tratamiento de medios biológicos, como fracciones sanguı́neas, productos proteı́nicos generados mediante técnicas de ingenierı́a genética y preparados de vacuna, y la fotolisis de ácidos nucleicos en presencia de proteı́nas conservando las propiedades antigénicas e inmunogénicas de las proteı́nas. Unos medios biológicos, que presentaban proteı́nas con contenido de triptófano, se irradiaron con luz pulsada de diferente longitud de onda y flujo. Matthews et al. (1992, Blood Cells 18:75-89) informó sobre la inactivación de virus en células infectadas por virus en medios de cultivo o en sangre total mediante irradiación con una fuente luminosa de xenón filtrada y/o un láser de color en presencia de un colorante fotodinámico. Prodouz et al. (1987, Blood 70:589-592) describieron un procedimiento para la inactivación de virus en muestras mediante irradiación UV, utilizando una radiación de 308 nm de un láser Xe-X1-Eximer. En el documento WO 96/00091, para la inactivación de virus se irradian muestras con una radiación electromagnética generada por un aparato láser pulsado con una longitud de onda entre 300 y 370 nm. 30 35 Perrin et al. (1995, Biologicals 23: 207-211) utilizaron β-propio-lactona para la inactivación de ADN celular residual contaminante en medios biológicos. Si bien es sabido que este agente inactiva virus, su utilización es difı́cilmente controlable debido a su labilidad y reactividad. Se hidroliza con rapidez en soluciones acuosas, y también puede modificar el producto, por ejemplo mediante una reducción de la función Fc en inmuno-globulinas. También se ha propuesto la utilización de nucleasas para la inactivación de ADN o ARN, pero es sabido que éste no es un método muy eficaz, dado que un alto porcentaje del ácido nucleico está unido con proteı́na y por lo tanto no es accesible para las nucleasas. 40 Se sabe que algunos colorantes fotosensibles, y en particular colorantes de fenotiazina, como azul de metileno, rosa bengala, rojo neutro o azul de toluidina, pueden inactivar virus en presencia de luz o luz UV. Esto se debe a la afinidad preferente de los colorantes fotosensibles por los ácidos nucleicos. 45 50 55 La reactividad de los colorantes de fenotiazina con virus se lleva investigando desde el año 1930. Perdrau et al. (1933, Proc. Roy. Soc. 122:288-298) informaron de que se puede inactivar un amplio espectro de virus mediante la acción de azul de metileno en presencia de luz. Se demostró que mediante azul de metileno e irradiación con luz se inactivaban virus de la rabia, virus de la gripe, virus de Junin, HIV y virus del herpes simplex (Swartz et al., 1979, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 161:204-209; Schnipper et al., 1980, J. Clin. Invest., 65:432-438; Cobo et al., 1986, Med. Microbiol. Immunol., 175:67-69, Bachmann et al., 1995, J. Med. Virol., 47:172-178). Los virus con envoltura poseen en general una determinada fotosensibilidad inherente, mientras que los virus sin envoltura son fotorresistentes (Wallis et al., 1964, Virology 23:520-527). El documento EP 0 196 515 describe un procedimiento para la inactivación de virus en un compuesto proteı́nico terapéutico mediante la acción de luz en presencia de un fotosensibilizador sobre dicho compuesto. Los fotosensibilizadores preferentemente utilizados fueron la protoporfirina y la cloro-promazina. Se comprobó que este método permitı́a inactivar virus, pero que bajo las condiciones de ensayo también se produce una inactivación de factor VIII. 60 El documento US 4,181,128 describe un sistema para la inactivación de microorganismos, como virus, bacterias, toxinas y células tumorales, mediante tratamiento con azul de metileno, luz, electricidad y una 3 ES 2 185 003 T3 atmósfera de oxı́geno. 5 10 15 El documento US 4,950,665 describe un procedimiento en el que se utiliza azul de metileno para la derivación selectiva de guanosina y la inactivación de células vı́ricas y cancerosas in vivo. El tratamiento de plasma con azul de metileno y luz conduce a la inactivación de virus con envoltura, incluyendo HIV, HSV, VSV, y algunos virus sin envoltura, como SV40 (Mohr et al., 1992, Ann. Hematol. 65:224-228). Si bien se supone que los ácidos nucleicos son los objetivos preferentes del tratamiento con azul de metileno/luz (Tuite et al., 1993, Photochem. Photobiol. B: Biol. 21:103-124), también se observaron algunos cambios en proteı́nas de cápside de virus inactivados con azul de metileno/luz, ası́ como una pérdida de la actividad de proteı́nas plasmáticas (Specht et al., 1994, Photochem. Photobiol. 59:506-514; Bachmann et al., 1995, J. Med. Virol. 47:172-178; Mohr et al., 1995, Immunol. Invest. 24:73-85). Por consiguiente, es evidente que se ha de desarrollar un procedimiento mejorado para la inactivación de ácidos nucleicos en medios biológicos, que reduzca el riesgo de una contaminación residual de ácidos nucleicos activos en un medio biológico, conservándose al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica de productos con contenido de proteı́nas en esa muestra. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un procedimiento mejorado para la desintegración de ácidos nucleicos en un material biológico. 20 Otro objetivo de la presente invención consiste en la creación de un procedimiento para la producción de un material biológico seguro en el que en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo esté desintegrado, conservándose al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del material con contenido de proteı́nas. 25 Otro objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición medios biológicos seguros, como proteı́nas recombinantes, anticuerpos monoclonales, vacunas o derivados sanguı́neos. 30 35 40 De acuerdo con un aspecto de la presente invención, para lograr estos objetivos está previsto un procedimiento para la desintegración de todos los ácidos nucleicos biológicamente activos en un material con contenido de proteı́nas biológicamente activo, procedimiento en el que a un material biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, la mezcla se somete a una irradiación con luz láser con una intensidad ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo con el fin de reducir la actividad de molde de ácido nucleico en el material biológico como mı́nimo en un factor de 7 etapas log o reducir el contenido de ácido nucleico a < 100 pg/ml, preferentemente < 10 pg/ml, de forma especialmente preferente < 1 pg/ml, para desintegrar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo en el material biológico conservando al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del material biológico. Preferentemente, en el procedimiento según la invención, la inactivación o desintegración de los ácidos nucleicos se controla mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos y se obtiene un material biológico cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico. La sustancia fotodinámica es preferentemente azul de metileno, azul de toluidina o azur. 45 De acuerdo con un procedimiento de la invención, el material biológicamente activo presenta una sustancia biológicamente activa de alto peso molecular, que no es ningún ácido nucleico biológicamente activo. 50 Preferentemente, la sustancia fotodinámica absorbe luz en la gama de longitudes de ondas del rayo láser o por encima de éstas, siendo la longitud de onda del rayo láser utilizado la longitud de onda del ı́ndice de activación máximo de la sustancia fotodinámica. La longitud de onda del rayo láser utilizado se encuentra preferentemente entre 600 y 680 nm, principalmente entre 630 y 660 nm. 55 Para llevar a cabo el procedimiento se pueden utilizar todos los aparatos de láser conocidos, como un láser de xenón, un láser He-Ne o un láser YAG, si bien es preferente un láser He-Ne. Para ello se emplea un sistema en el que el material biológico se conduce a través de un pequeño tubo o una cubeta con una ventanilla de cristal, y la ventanilla de cristal se irradia con un rayo láser. La densidad de energı́a que actúa sobre el material biológico se determina mediante la intensidad de irradiación del láser utilizada en función del tiempo de permanencia del lı́quido en el área de irradiación con láser (mWs/mm2 o mJ/mm2 ). La intensidad de irradiación del láser es la potencia del láser por superficie de irradiación con láser (mW/mm2). El tiempo de permanencia en el rayo depende de la geometrı́a de la ventanilla de 60 4 ES 2 185 003 T3 cristal (diámetro x longitud) y el caudal (ml/min). 5 10 15 20 25 30 35 La potencia de láser utilizada se encuentra preferentemente entre 1 mW y 20 mW. En la realización del procedimiento, dependiendo de la intensidad de irradiación del láser y del tiempo de permanencia del material biológico bajo la influencia de la irradiación del láser, la intensidad de láser máxima por ciclo deberı́a ser < 0,1 J/cm2 , en particular ≤ 0,08 J/cm2 . De acuerdo con el procedimiento según la invención, la irradiación con láser se lleva a cabo preferentemente con una densidad de energı́a entre 0,001 J/cm2 y como máximo 0,1 J/cm2 , de forma especialmente preferente entre 0,006 J/cm2 y 0,06 J/cm2 . Si sólo se añade al material una única sustancia fotodinámica, el material se irradia preferentemente con un rayo láser con una longitud de onda determinada. Si se añade más de una sustancia fotodinámica al material biológico, el material se irradia con diferentes longitudes de onda del rayo láser, seleccionándose las longitudes de ondas a partir del ı́ndice de activación máxima de las sustancias fotodinámicas utilizadas. La sustancia fotodinámica añadida está presente preferentemente en una concentración entre 0,01 µM y 50 µM, preferiblemente entre 1 y 4 µm, especialmente entre 10 µM y 35 µM. La sustancia fotodinámica se selecciona entre el grupo de las fenotiazinas, como azul de metileno, rojo neutro, azul de toluidina, azur, rojo bengala. Habitualmente, la sustancia fotodinámica está disuelta en una solución que posibilita la disolución completa de la sustancia al combinarla con el material biológico. La sustancia fotodinámica se puede añadir al material biológico a oscuras y la mezcla se bombea después a través de un sistema con una ventanilla para que el rayo láser actúe durante un tiempo suficiente para desintegrar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo en dicho material biológico. Para conservar la actividad biológica y la integridad del medio biológico, la irradiación con rayo láser se realiza durante un tiempo que es suficiente para desintegrar todo el ácido nucleico biológicamente activo sin afectar a la integridad y la actividad biológica de un material con contenido de proteı́nas. Los parámetros para la desintegración son el diámetro del rayo láser, el diámetro de la ventanilla a través de la cual se irradia el medio biológico, la velocidad de flujo con la que la sustancia es bombeada a través de la ventanilla, el tiempo de acción, la longitud de onda del rayo láser, dado el caso la concentración de la sustancia fotodinámica y la concentración del ácido nucleico en el material. De acuerdo con un aspecto de la invención, el procedimiento se puede llevar a cabo en un sistema tamponado con un pH entre 5 y 10 y a una temperatura entre 4◦ C y 35◦C, dependiendo de la sustancia fotodinámica añadida, pero bajo las condiciones óptimas para la desintegración del ácido nucleico conservando al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del material biológicamente activo. Preferentemente, las condiciones de temperatura, valor pH y fuerza iónica elegidas para la desintegración del ácido nucleico se mantienen estables a lo largo de todo el procedimiento. Los parámetros relevantes para la inactivación se optimizan para cada material biológico. 55 Cuando la acción del rayo láser o el tratamiento con sustancia fotodinámica/rayo láser se utiliza para la desintegración de ácido nucleico biológicamente activo de patógenos microbiológicos o moleculares en sangre, plasma, suero, una suspensión celular, una capa celular, un residuo celular o un preparado celular abierto, que procede de una célula infectada, transfectada o transformada, se puede añadir un estabilizador, como azúcar, polialcoholes, aminoácidos, péptidos o ácidos carboxı́licos, un agente de extinción y/o de depuración, como manita, glicerina, glutatión reducido o superóxido-dismutasa, o una combinación de éstos, al material biológico antes de la acción del rayo láser o de la adición de una sustancia fotodinámica. De acuerdo con el procedimiento también se pueden añadir al material biológico uno o más agentes de extinción y/o depuración y/o estabilizadores diferentes antes de la acción del rayo láser. La adición de agentes de extinción de reacciones fotodinámicas de tipo I (radicales libres), como manita, glicerina, glutatión reducido (GSH) o superóxido-dismutasa (SOD), permite la utilización de mayores intensidades de luz o intensidad de energı́a (> 0,1 J/cm2 ) y concentraciones de sustancias por ejemplo fotodinámicas, sin grandes pérdidas de actividad, integridad, antigenicidad, inmunogenicidad o actividad enzimática de un medio biológico. Esto se debe a que una reacción de tipo II (singlete-oxı́geno) es el mediador principal de la inactivación del ácido nucleico, contribuyendo tanto la reacción de tipo I como la reacción de tipo II a la inactivación de proteı́nas. Esto es especialmente importante cuando este procedimiento se utiliza para la inactivación de virus en sangre total, plasma o productos plasmáticos y/o la desintegración de ácido nucleico vı́rico y genómico en material biológico sin provocar pérdidas de actividad e integridad de proteı́nas especı́ficas de importancia terapéutica. 60 Se ha comprobado que, bajo las condiciones empleadas para la desintegración de ácidos nucleicos activos, basta con utilizar intensidades reducidas de luz o energı́a para inactivar incluso los virus más resistentes, sin destruir la actividad biológica ni la integridad de los factores de la sangre o las proteı́nas plasmáticas. 40 45 50 La desintegración de ácidos nucleicos, especialmente de virus sin envoltura, y con ello su activación, 5 ES 2 185 003 T3 5 resultó sorprendente en particular considerando el estado conocido de la técnica, dado que los virus sin envoltura, como poliovirus, HAV o parvovirus, eran considerados como fotorresistentes (Wallis et al., 1964, Virology 23:520-527; Mohr et al., 1995, Immunol. Invest. 24:73-85). Mediante la utilización de una combinación de sustancia fotoactiva y tratamiento con rayo láser con baja densidad de energı́a, el procedimiento según la invención permite sorprendentemente inactivar también virus sin envoltura en un material biológico, como por ejemplo plasma, o en la producción de una vacuna que contenga por ejemplo poliovirus, HAV o parvovirus inactivados, estando asegurado en el caso del material biológico que mediante el procedimiento de activación se conserva la integridad y la actividad biológica de las proteı́nas. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 En otra forma de realización preferente del procedimiento, antes de la acción del rayo láser se añaden una o más sustancias fotodinámicas, como mı́nimo un agente de extinción y/o de depuración y/o estabilizador, y la mezcla se irradia con una o más longitudes de onda de rayo láser diferentes, siendo la longitud de onda del rayo láser la longitud de onda del ı́ndice de activación máxima de la sustancia o las sustancias fotodinámicas añadidas. La sustancia fotodinámica y el agente de extinción y/o de depuración y/o estabilizador se pueden introducir en un recipiente que contiene el material biológicamente activo, y la mezcla de la sustancia o las sustancias fotodinámicas y el material biológicamente activo se bombea a través de un sistema para someterla a la acción del rayo láser. En una forma de realización preferente del procedimiento, la mezcla expuesta al rayo láser se bombea directamente a un segundo recipiente. La mezcla sometida al rayo láser se puede bombear de vuelta en sentido contrario a través del sistema para como mı́nimo una segunda irradiación con láser. En otra forma de realización preferente del procedimiento, a la mezcla que se encuentra en el segundo recipiente se le puede añadir como mı́nimo una segunda porción de una o más sustancias fotodinámicas y un agente de extinción y/o de depuración y/o estabilizador, y la mezcla se bombea de vuelta en sentido contrario a través del sistema para como mı́nimo una segunda irradiación con láser. Los aditivos para la mezcla se pueden añadir en una única adición o en varias adiciones, en cuyo caso la mezcla se expone al rayo láser entre las adiciones, o se pueden añadir de forma continua a lo largo de todo el tratamiento. Habitualmente se utiliza una adición. De acuerdo con la presente invención, esto puede tener lugar reciclando en un proceso continuo la mezcla de material biológico y aditivos tratada con rayo láser. El procedimiento se puede repetir durante varios ciclos de tratamiento con rayo láser, preferentemente de 5 a 50 ciclos, especialmente de 10 a 30 ciclos. De acuerdo con el procedimiento de la invención, el ácido nucleico biológicamente activo desintegrado mediante el procedimiento de la invención es un ADN o ARN. La presente invención prevé un nuevo procedimiento para la desintegración de ácidos nucleicos biológicamente activos en un material biológicamente activo. “Material biológicamente activo” significa un material con productos biológicamente activos que contienen proteı́nas, que están contaminados por ácido nucleico no deseado procedente de una célula, una lı́nea de cultivo celular, un virus, un vector de ácido nucleico, un patógeno procariótico o eucariótico o un oncogén. “Desintegración” de un ácido nucleico significa la destrucción de las unidades de ácido nucleico y de la actividad en presencia de proteı́nas, para provocar la pérdida de la viabilidad e infecciosidad del ácido nucleico, conservándose al mismo tiempo en lo esencial la funcionalidad y la integridad y la actividad biológica de la proteı́na presente en el material biológico. Un objetivo de la presente invención consiste en la desintegración en lo esencial de todos los ácidos nucleicos biológicamente activos, como ADN o ARN, incluyendo moléculas de ácido nucleico infecciosas que son capaces de transformación y cuya presencia se supone en el material biológico, mientras que la integridad y la actividad de las proteı́nas del material biológico permanecen intactas. En el material obtenido después del proceso de desintegración, que contiene una proteı́na biológicamente activa, están desintegrados en lo esencial todos los ácidos nucleicos biológicamente activos. “En lo esencial” significa que el ácido nucleico activo restante en el material biológico se encuentra por debajo del lı́mite de detección de un método de amplificación de ácido nucleico de alta sensibilidad. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, la cantidad de ADN genómico contaminante restante y/o ácido nucleico con actividad vı́rica, ARN o ADN, se determina después del proceso de desintegración o inactivación. Esta determinación es especialmente importante cuando se comprueba el ácido nucleico activo contaminante en productos sanguı́neos, vacunas, o en el control de calidad de productos recombinantes procedentes de cultivos celulares. La eficacia de la desintegración se puede medir determinando el ácido nucleico restante mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, como la reacción en cadena de ligasa (ligase chain reaction, LCR), la amplificación a base de la secuencia de ácido nucleico (nucleic acid sequence based amplification, NASBA), la replicación de secuencia autónoma (self-sustained sequence replication, 3SR), el sistema de amplificación a base de transcripción (trans6 ES 2 185 003 T3 criptional based amplification system, TAS) o la reacción en cadena de polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). En una forma de realización preferente del procedimiento de la invención, el método de amplificación es la PCR. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Para determinar cuantitativamente el ácido nucleico en una muestra, preferentemente se utiliza LIFPCR (fluorescencia inducida por láser-PCR). Mediante la utilización de cebadores marcados no radiactivos (preferentemente se utilizan cebadores marcados con un colorante fluorescente), los productos de PCR se pueden detectar mediante LIF-PCR. En el caso de la LIF-PCR, el ácido nucleico se amplifica en presencia de cebadores marcados con fluorescencia, y los productos de amplificación se separan después mediante PAGE. La amplificación tiene lugar con cebadores especı́ficos para el ácido nucleico correspondiente del patógeno microbiológico o molecular o el ADN genómico contaminante. Para cuantificar la eficacia del procedimiento de inactivación y desintegración antes de la amplificación, se añade a la muestra una cantidad determinada de un ácido nucleico conocido como estándar. El ácido nucleico estándar se diferencia del ácido nucleico genómico o vı́rico a determinar como mı́nimo en una caracterı́stica detectable, pero deberı́a ser amplificable con ayuda del mismo cebador. Hasta la presente invención no era posible desintegrar por completo los ácidos nucleicos biológicamente activos en una muestra biológica sin afectar de forma esencial a la actividad biológica y/o la integridad de las proteı́nas presentes en la muestra. Tampoco era posible determinar y cuantificar la eficacia del procedimiento de desintegración de ácido nucleico mediante métodos de amplificación por PCR con el fin de disponer de un sistema reproducible para la producción de medios biológicos seguros y de calidad controlada. Preferentemente el material biológicamente activo incluye una sustancia biológicamente activa de alto peso molecular, que no es ningún ácido nucleico biológicamente activo. Preferentemente, el material biológicamente activo es una solución que presenta un factor sanguı́neo, una proteı́na plasmática procedente del fraccionamiento de sangre o plasma sanguı́neo, un factor plasmático, una inmunoglobulina, un producto con contenido de proteı́nas generado mediante técnicas de ingenierı́a genética, como una proteı́na recombinante o un anticuerpo monoclonal, o un patógeno microbiológico y/o molecular, como un virus o una bacteria, o una parte de éstos. En una forma de realización preferente del procedimiento, el material biológico incluye un producto con contenido de proteı́nas. Preferentemente, el material se selecciona a partir de una solución que incluye un factor sanguı́neo, como factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XIII, proteı́na C, proteı́na S, factor von Willebrand, o una proteı́na plasmática, como plasminógeno, activador-inhibidor de plasminógeno, antitrombina III, inhibidor de C1-esterasa, albúmina, fibrinógeno, γ-globulina, inmunoglobulina, un producto proteı́nico generado mediante técnicas de ingenierı́a genética, como una proteı́na recombinante o un anticuerpo monoclonal o una parte de éstos, o un patógeno, como un virus o una bacteria. El material biológicamente activo puede ser sangre total, un componente sanguı́neo o un derivado de éste, como una fracción de plasma, una proteı́na plasmática con un ácido nucleico en forma de un patógeno microbiológico o molecular potencial, una suspensión celular, una capa celular, un residuo de cultivo celular o un preparado celular abierto procedente de células infectadas, transfectadas o transformadas o de un cultivo celular que presenta un ácido nucleico biológicamente activo contaminante. El procedimiento de la presente invención es adecuado para desintegrar ácido nucleico biológicamente activo y para inactivar patógenos vı́ricos, como HIV-1, HIV-2, HAV, HCV, HBV, parvovirus, CMV, HHV-6, HTLV-1, HTLV-2, EBV. HDV, ecovirus y virus Coxsackie en plasma o una fracción plasmática. Las células de este cultivo celular, suspensión celular, capa celular, residuo de cultivo celular o del preparado celular abierto pueden proceder de células de vertebrados, como células VERO, células de CHO, células BHK, células embrionarias de pollo, células MDCK, células CV-1, células LLC-MK2, células MDBK, células WI-38, células MRC-5, células SK-Hep u otra lı́nea celular continua, como una lı́nea celular tumoral o una lı́nea celular de hibridoma. El ácido nucleico biológicamente activo que se desintegra mediante el procedimiento de la invención es ADN o ARN. El ácido nucleico puede ser un ADN genómico de un genoma o una parte del mismo, por ejemplo un gen. El ácido nucleico intacto tiene una actividad de molde de ácido nucleico e incluye una secuencia para cebador y unión de polimerasa. También se puede amplificar mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico. El ácido nucleico puede proceder de un material de partida eucariótico, como una célula de vertebrado, una lı́nea celular tumoral o una lı́nea celular de hibridoma; de un microorganismo, como un protozoo, una bacteria, un virus, un patógeno microbiológico o molecular o una parte del mismo; o de un oncogén o un protooncogén. 7 ES 2 185 003 T3 En otra forma de realización preferente del procedimiento, el material biológico con contenido de virus procede de un cultivo de células infectadas por virus, un residuo de cultivo de células infectadas por virus, un componente celular de células infectadas por virus o una solución que presenta un virus purificado. 5 De acuerdo con otro aspecto de la invención, el procedimiento se utiliza para generar un virus inactivado. Preferentemente el virus es un virus lipı́dico (con envoltura) o no lipı́dico (sin envoltura), un virus de ADN o un virus de ARN, o un virus atenuado. 10 Con el procedimiento según la invención se puede obtener por ejemplo un virus inactivado que presenta un ácido nucleico biológicamente activo desintegrado, mientras que conserva su integridad y actividad biológica, como las propiedades antigénicas, inmunogénicas y protectoras. El virus inactivado con las propiedades arriba descritas puede ser cualquier tipo de virus, como un virus lipı́dico (con envoltura) o no lipı́dico (sin envoltura), un virus de ADN o un virus de ARN, o un virus atenuado. 15 En caso dado, el virus inactivado según la invención se puede formular con un vehı́culo fisiológicamente aceptable para producir un preparado de vacuna. 20 El virus a inactivar según la invención es preferentemente un virus lipı́dico (con envoltura), un virus no lipı́dico (sin envoltura), un virus de ADN o un virus de ARN, o un virus atenuado. 25 Preferentemente, con el procedimiento según la invención se inactivan virus seleccionados entre el grupo de adenovirus, herpesvirus, papovavirus, poxvirus, parvovirus, reovirus, retrovirus, mixovirus, paramixovirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, ortomixovirus o rabdovirus, siendo preferentemente un virus de la gripe, HIV, HCV, HAV, HBV, TBEV o CMV, y en caso dado estando el virus atenuado. 30 35 La invención se refiere en particular también a un procedimiento para la inactivación de virus sin envoltura en un material biológico con contenido de proteı́nas, caracterizado porque a un material biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, en una concentración de como mı́nimo 20 µM, y la mezcla se expone a un rayo láser en la gama de longitudes de onda del ı́ndice de activación máximo de la sustancia fotodinámica con una intensidad de la luz láser ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo, preferentemente ≤ 0,06 J/cm2 por ciclo, durante como mı́nimo 20 ciclos. Los virus preferentes a inactivar son virus del grupo de los picornaviridae y parvoviridae. La inactivación o desintegración del ácido nucleico se controla preferentemente mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos, obteniéndose un material biológico cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico. 40 Según otro aspecto de la invención, el procedimiento según la invención está previsto para la producción de una vacuna de virus inactivado. 45 50 55 El procedimiento según la invención es adecuado para producir vacunas contra múltiples virus, incluyendo virus humanos virus y animales. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a la utilización del procedimiento según la invención para la producción de una vacuna de virus inactivado, caracterizado porque a un material que contiene virus biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, la mezcla se somete a una irradiación con luz láser con una intensidad ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo para desintegrar o inactivar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo del material biológico conservando al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del virus, como antigenicidad e inmunogenicidad, la desintegración del ácido nucleico se controla mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos, y se obtiene un material que contiene virus cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico, los virus inactivados se someten en caso dado a otra purificación, y los virus inactivados se formulan con un vehı́culo fisiológicamente aceptable para producir una vacuna de virus. 60 El procedimiento es adecuado para la inactivación de virus de ADN de cadena doble, virus de ADN de cadena simple, virus de ARN de cadena doble y virus de ARN de cadena simple, incluyendo virus 8 ES 2 185 003 T3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tanto con envoltura como sin ella, como por ejemplo los virus seleccionados entre el grupo de adenovirus, herpesvirus, papovavirus, poxvirus, parvovirus, reovirus, retrovirus, mixovirus, paramixovirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, ortomixovirus o rabdovirus. En particular, el virus es un virus de la gripe, un virus del herpes simplex, HIV, HBV, HAV, HCV, HSV, TBEV o CMV, en caso dado estando el virus atenuado. La presente invención también es adecuada para la producción de vacunas de virus en las que el virus a inactivar es un virus atenuado. Esto es especialmente ventajoso cuando el virus originalmente activo es altamente virulento, por ejemplo HIV o HCV, de modo que el proceso de producción en sı́ podrı́a ocasionar problemas de seguridad para el personal del laboratorio, dado que éste trabaja con preparados vı́ricos en altas concentraciones. La utilización de una cepa vı́rica atenuada implica un riesgo menor que el empleo de una cepa virulenta. Además, la utilización de un virus atenuado para la producción de la vacuna en lugar de la forma virulenta aumentarı́a al máximo la seguridad de dicha vacuna, si bien mediante el presente procedimiento se obtiene un virus no infeccioso completamente inactivado, en el que todos los ácidos nucleicos biológicamente activos están desintegrados. En la producción de la vacuna según la invención, para obtener cantidades suficientes de virus a inactivar por ejemplo se puede concentrar virus de plasma muy contaminado. El plasma muy contaminado se puede fraccionar de forma convencional, utilizando precipitación en etanol/PEG, adsorción en Sephadex y otros pasos de purificación habituales, para producir preparados altamente concentrados de estos virus que después se pueden inactivar mediante tratamiento con una sustancia fotodinámica y/o con rayo láser. Los virus también se pueden concentrar utilizando técnicas de nanofiltración, pudiendo formarse en caso dado complejos de virus pequeños, como parvovirus, con anticuerpos especı́ficos, para obtener un complejo inmunológico que se puede retener mediante nanofiltración. Esta técnica se utiliza preferentemente para virus que no se pueden cultivar en cultivos celulares, como HCV, HBV o parvovirus. Estas vacunas también se pueden obtener mediante cultivo de virus de vacunación en un cultivo de células de vertebrados adecuado. El virus de vacunación se puede obtener mediante aislamiento directo a partir de un huésped infectado, o de otra fuente, como una colección de microorganismos. Entre los cultivos celulares adecuados se cuentan cultivos primarios o secundarios procedentes de tejidos o lı́neas celulares establecidas, como CEC, células vero, células renales de mono, células BHK, células CV-1, células LLCMK-2, células MDCK, células MDBK, células LTMK, células WI-38, células MRC-5 u otras células que sean permisivas para el virus deseado y que puedan ser cultivadas como capas individuales o como cultivo en suspensión. El cultivo celular se obtiene mediante procedimientos habituales, como el cultivo de células en un medio que contiene suero, o especialmente las células se cultivan en grandes proporciones en condiciones de ausencia de suero o de proteı́nas a partir de la ampolla original para obtener una biomasa celular. Por ello, la infección vı́rica se lleva a cabo preferentemente en condiciones de ausencia de suero o de proteı́nas. Esto puede tener lugar mediante el desarrollo del cultivo celular en un medio libre de suero o de proteı́nas durante varias generaciones antes de la infección, o mediante la sustitución del medio de crecimiento con contenido de suero por un medio libre de suero o de proteı́nas antes de la infección. Las células se infectan con el virus bajo condiciones estándar con múltiples infecciones (multiplicity of infetion, m.o.i.), preferentemente entre 0,001 y 0,1 TCID50. Periódicamente se controla el crecimiento celular, la infección y la generación de virus. Este control puede tener lugar de forma automática o con otros medios y los resultados del mismo se pueden utilizar para dirigir el proceso de producción. Mediante la infección e incubación de la biomasa celular con el virus se obtiene un cultivo celular que presenta un residuo que contiene virus y/o una biomasa que presenta virus y antı́geno viral. Dependiendo del tipo de virus utilizado, las partı́culas vı́ricas generadas se encuentran en el residuo del cultivo celular y/o unidas con la biomasa celular. 50 55 60 Los ejemplos de virus lı́ticos incluyen el virus de la gripe y el virus de la vaccinia. Después de generar el virus, éste se añade al medio de cultivo celular para obtener un medio con contenido de virus. El medio con contenido de virus se puede separar del cultivo celular y bien se puede someter directamente al rayo láser o bien, en caso dado, antes de la acción del rayo láser, se puede tratar con una concentración determinada de una sustancia fotodinámica. El material biológico con contenido de virus se puede separar del medio de cultivo celular por porciones o en conjunto en un procedimiento continuo o por lotes y transferir a un segundo recipiente, en el que se añade la sustancia fotoactiva. La sustancia fotodinámica se puede añadir a la suspensión de virus en una única adición o en varias adiciones, en cuyo caso el virus se expone a un rayo láser entre las adiciones, o se puede añadir de forma continua a lo largo de todo el tratamiento o de una parte del mismo. Habitualmente se utiliza una adición. De acuerdo con la presente invención, esto puede tener lugar reciclando en un proceso continuo la sustancia fotodinámica y el medio tratado con rayo láser. El medio con contenido de virus se transfiere del recipiente de cultivo a otro recipiente en 9 ES 2 185 003 T3 el que se añade la sustancia fotodinámica en una concentración determinada, y esta mezcla se bombea a través de un sistema con una ventanilla para que el rayo láser actúe durante un tiempo suficiente para descomponer en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo. 5 10 15 20 25 30 35 De acuerdo con el procedimiento de la invención, durante todas las etapas del procedimiento de inactivación de virus se pueden añadir uno o más agentes de extinción y/o de depuración y/o estabilizadores individualmente o en cualquier combinación adecuada. A continuación, el virus inactivado se somete a una purificación, o el material con contenido de virus se bombea de vuelta directamente al segundo recipiente o se bombea en sentido contrario a través de la ventana para un segundo ciclo de acción del rayo láser, pudiendo añadirse o no una segunda porción de sustancia fotodinámica y/o agente de extinción y/o de depuración y/o estabilizador, y se somete a un segundo ciclo de rayo láser. Este procedimiento se puede repetir durante varios ciclos, preferentemente de 5 a 50 ciclos, especialmente de 10 a 30 ciclos. Durante la irradiación con rayo láser, el medio se puede mantener en reposo, bajo agitación o en circulación, y se puede someter a una acción continua o a perı́odos alternos de acción y no acción. La circulación puede tener lugar en un sistema con un ámbito de acción cerrado o en un sistema simple, debiendo estar asegurado que todas las muestras hayan sido sometidas a la luz. Durante la infección y la multiplicación no siempre de liberan en el residuo todas las partı́culas vı́ricas producidas por la célula. Estas partı́culas vı́ricas pueden permanecer en las células de la biomasa celular. Por ello, el cultivo celular contiene partı́culas vı́ricas en el residuo ası́ como partı́culas vı́ricas completas y proteı́nas vı́ricas unidas a la biomasa celular. Para obtener un mayor rendimiento de virus, las partı́culas vı́ricas del residuo se recogen y el virus y/o antı́geno viral que está unido a la biomasa celular se aı́sla. El virus hallado en las células de la biomasa celular se separa de las células mediante lisis. La lisis de las células se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales, como tratamiento de las células con un detergente, tratamiento térmico, tratamiento con ultrasonido, prensa francesa u otros métodos de lisis celular. Los virus separados de las células se recogen por ejemplo mediante centrifugación y se resuspenden en un tampón. Los antı́genos virales que todavı́a están unidos a la biomasa celular o a fragmentos celulares se pueden extraer de las células o los fragmentos celulares mediante métodos quı́micos o mecánicos pertenecientes al estado actual de la técnica. Entre estos métodos se cuentan el tratamiento con ultrasonido o el tratamiento con un detergente adecuado para separar el antı́geno viral de la célula o el fragmento celular, en particular de la membrana. Los ácidos nucleicos de esta suspensión, que proceden de las células o del virus, se desintegran mediante la acción del rayo láser o mediante tratamiento de la solución con una concentración predeterminada de una sustancia fotodinámica y posterior acción del rayo láser. Los antı́genos virales, incluyendo los virus aislados a partir de la biomasa celular, se pueden someter después a un paso de purificación, incluyendo separación en un gradiente de sacarosa, adsorción en una columna de cromatografı́a, lavado y elución del virus o antı́geno viral purificado. La columna de cromatografı́a utilizada se selecciona entre cromatografı́a por intercambio de iones, cromatografı́a de afinidad o cromatografı́a de filtración por tamaños. 40 El medio con contenido de virus también puede se puede sustituir por un tampón inorgánico mediante centrifugación y suspensión en un medio tamponado acuoso. El tampón inorgánico es preferentemente un tampón de fosfato o Tris/HCl. La cantidad de virus en la suspensión es en general de aproximadamente 106 a 109 pfu/ml, de forma preferente aproximadamente entre 107 y 5 x 108 pfu/ml. 45 La invención también incluye el paso de producción de una vacuna con el virus/antı́geno viral inactivado. 50 55 Aunque la desintegración de ácido nucleico en un material biológico que contiene microorganismos de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo normalmente en una solución de inactivación o desintegración, en algunos casos puede ser deseable incorporar la sustancia fotodinámica directamente en el medio de cultivo celular en el que se desarrolla el virus. Bajo estas condiciones, el cultivo celular se puede desarrollar a lo largo de varias generaciones en un medio libre de suero o de proteı́nas en presencia de una sustancia fotodinámica, preferentemente antes de la infección, a oscuras y bajo las condiciones de crecimiento óptimas. Después de la infección por virus y la multiplicación del virus tiene lugar la desintegración de ácido nucleico retirando el medio que contiene el medio vivo, que puede haber sido tratado o no con sustancia fotodinámica del cultivo celular, y dejando actuar un rayo láser de una longitud de onda determinada sobre las partı́culas vı́ricas en el medio de inactivación, que puede contener o no una sustancia fotodinámica adicional y/o un agente de extinción y/o de depuración y/o un estabilizador. 60 Con el procedimiento de la presente invención, la posibilidad de utilizar condiciones de inactivación menos rigurosas resulta muy ventajosa para la conservación de la antigenicidad, la inmunogenicidad y el 10 ES 2 185 003 T3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 carácter protector del virus durante la desintegración del ácido nucleico vı́rico. Sorprendentemente se ha comprobado que, bajo las presentes condiciones, cuando un virus se trata con una sustancia fotodinámica y se irradia con un rayo láser, se pueden inactivar determinados virus, en particular virus no lipı́dicos con cápsides rı́gidas, con lo que pierden por completo su infecciosidad. En algunos casos puede ser deseable añadir un disolvente orgánico para aumentar la permeabilidad de la envoltura exterior o membrana del virus. Este aumento de la permeabilidad facilita la penetración de la sustancia fotodinámica y mejora la desintegración del ácido nucleico vı́rico en el núcleo interior del virus. La sustancia fotodinámica y el disolvente orgánico también se pueden añadir al medio de cultivo celular en el que se desarrolla el virus. Puede ser deseable retirar de la mezcla la sustancia fotodinámica utilizada y/o sus productos de fotodescomposición. Esto puede tener lugar una vez finalizada la irradiación con rayo láser mediante uno o más procedimientos estándar de laboratorio, como diálisis a través de una membrana de la magnitud correspondiente o mediante un sistema de fibras huecas. Alternativamente se podrı́an utilizar métodos cromatográficos por afinidad o por filtración en gel para uno o más materiales de bajo peso molecular a separar. De acuerdo con la invención se pueden inactivar por completo virus que eran resistentes a una inactivación y desintegración del ácido nucleico o que sólo podı́an inactivarse de forma ineficaz, sin pérdida de la actividad biológica deseada. Otros virus que ya habı́an sido inactivados con éxito anteriormente se pueden inactivar ahora bajo condiciones en las que conservan mejor sus caracterı́sticas antigénicas, con lo que se convierten en sustancias inmunogénicas más eficaces para su utilización en vacunas. El virus inactivado se puede formular de múltiples maneras para utilizarlo como vacuna. La concentración del virus es en general de 106 a 109 pfu/ml con una dosificación total de como mı́nimo 105 pfu/ml, habitualmente como mı́nimo 106 pfu/ml, preferentemente como mı́nimo 107 pfu/ml. Se pueden producir vacunas adecuadas mediante la combinación de los virus inactivados con un vehı́culo fisiológicamente aceptable, tı́picamente un adyuvante, en una cantidad adecuada para provocar una reacción inmunológica, por ejemplo la producción de anticuerpos neutralizadores de suero, después de la vacunación subsiguiente del huésped. La vacuna puede estar presente en un medio inerte fisiológicamente aceptable, como agua ionizada, solución de sal común tamponada con fosfato, o solución de sal común, o se puede administrar en combinación con un adyuvante inmunológico fisiológicamente aceptable, incluyendo, pero no de forma exclusiva, aceite mineral, adyuvante de Freund, aceites vegetales, sales minerales e inmunopotenciadores. La vacuna se puede administrar por vı́a subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, oral o nasal. Habitualmente, la dosificación especı́fica en el lugar especı́fico es de aproximadamente 0,1 a 1,0 ml, siendo la dosificación total entre 1,0 ml y 10 ml. La cantidad de inyecciones y su separación en el tiempo puede variar entre amplios márgenes, pero habitualmente son eficaces de 1 a 3 inyecciones a intervalos de 1, 4 y 24 semanas. La vacuna producida según la invención se puede utilizar para el tratamiento de una infección vı́rica y/o para la profilaxis de una infección vı́rica mediante la administración de una vacuna producida tal como se describe más arriba a un animal o una persona. La disminución o la pérdida de la infecciosidad y la inactivación completa de virus se determina de modo convencional mediante paso ciego de muestras, utilizándose un ensayo biológico, como un ensayo enzimático (por ejemplo reducción en transcriptasa inversa) o la determinación del tı́tulo vı́rico, CPE, TCID50, pfu/ml o en un modelo animal. Hanson et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28: 2030-2034) han descrito un método más sensible. En efecto, se ha comprobado que con este procedimiento de medición de la inactivación de virus tı́picamente no se puede diferenciar entre una situación en la que la inactivación del virus es completa y una situación en la que la inactivación no es completa y el ácido nucleico vı́rico biológicamente activo restante todavı́a podrı́a ser infeccioso in vivo. Para la producción de una vacuna de virus inactivado por ejemplo del HIV serı́a muy deseable poder asegurar que la infecciosidad ha desaparecido y que todo el ácido nucleico activo del virus ha sido desintegrado por completo. Esto requiere la utilización de un procedimiento de inactivación mejorado y la cuantificación del ácido nucleico biológicamente activo restante con un procedimiento de alta sensibilidad, exacto y reproducible. 55 60 Bachmann et al. (1995, J. Med. Virol. 47:172-178) describieron la utilización del ensayo de inhibición por PCR para determinar la cantidad del ARN vı́rico después de la inactivación con azul de metileno y luz. Después de 25 ciclos de amplificación no pudieron detectar ningún ácido nucleico vı́rico. Por el contrario, cuando el ARN se amplificó durante 30 ciclos se encontraron productos de amplificación especı́ficos. Por ello, el ensayo de cuantificación de ácido nucleico no posibilitaba la determinación exacta del procedimiento de inactivación y tampoco demostraba que la inactivación del ácido nucleico mediante ese procedimiento fuera completa. Por consiguiente, se requiere un procedimiento global y cuantitativo 11 ES 2 185 003 T3 para determinar la eficacia de inactivación. 5 10 15 20 25 30 35 40 La presente invención incluye la medición de la inhibición de la sı́ntesis enzimática de ácido nucleico dependiente de molde después de la acción de un rayo láser en un material biológicamente activo, dado el caso después de añadir una sustancia fotoactiva que se une al ácido nucleico, y después de la acción del rayo láser, para desintegrar el ácido nucleico activo. Por consiguiente, si el ácido nucleico se desintegra mediante el procedimiento de la presente invención, los ensayos de amplificación del ácido nucleico no conducirı́an a ningún producto de amplificación. Los reactivos para la amplificación por ejemplo de ácido nucleico vı́rico tı́picamente son especı́ficos para el virus y/o el ácido nucleico celular del cultivo celular que se utiliza para la multiplicación del virus o para crear un producto generado mediante técnicas de ingenierı́a genética. La eficacia del proceso de desintegración se puede determinar en la medida en que no es posible detectar productos amplificados de la reacción en cadena de polimerasa. La eficacia del procedimiento de PCR se puede controlar utilizando como mı́nimo dos estándares internos distintos que se diferencian de la secuencia a amplificar como mı́nimo en un marcador. La desintegración de ácido nucleico vı́rico biológicamente activo en la mezcla de desintegración se determina mediante los pasos consistentes en prever un material biológico con contenido de virus previamente tratado para la desintegración del ácido nucleico biológicamente activo, tratar una muestra de la mezcla de tal modo que el ácido nucleico vı́rico se separe de las partı́culas vı́ricas, preparar una suspensión para que el ácido nucleico del virus sea amplificable, añadir a la mezcla un grupo de cebadores y como mı́nimo un estándar interno que se diferencia del ácido nucleico a amplificar como mı́nimo en un marcador, y llevar a cabo una reacción de amplificación que es suficiente para generar productos de amplificación. El ácido nucleico que se ha de determinar y amplificar con ácido nucleico desintegrado en una suspensión de virus procedente de un sistema de cultivo celular es el ácido nucleico procedente del virus y el ácido nucleico procedente del cultivo celular. La presente invención prevé un procedimiento para la producción de una vacuna segura, inactivada y no infecciosa, con la que se eliminen los riesgos de transmisión de ácido nucleico biológicamente activo al huésped vacunado. La presente invención también prevé un procedimiento para producir un material biológico seguro y no infeccioso. De acuerdo con la presente invención, el contenido de ácido nucleico activo en un material biológico se determina y, después del paso de desintegración, se cuantifica mediante un método de amplificación de ácido nucleico, preferentemente PCR. El parámetro de la capacidad de desintegración es la pérdida completa de la detección de ácido nucleico activo, determinada mediante PCR. Mediante este procedimiento se puede controlar la desintegración del ácido nucleico. Preferentemente, la ejecución del procedimiento tiene lugar de tal modo que, después del tratamiento con agente fotoactivo y luz láser, el contenido de ácido nucleico a detectar sea inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presente menos de 500 copias/ml, preferentemente menos de 300 copias/ml, o como máximo de 1 a 500 copias/ml. El contenido de ácido nucleico es preferentemente inferior al lı́mite de detección de un procedimiento de cuantificación de ácido nucleico muy sensible de acuerdo con el estado actual de la técnica. 45 Si después de la desintegración se sigue midiendo una actividad de molde de ácido nucleico mediante PCR, el procedimiento de desintegración se adapta a las condiciones que permitan la reducción completa de la actividad de molde de ácido nucleico. 50 55 60 Si el presente procedimiento de desintegración de ácido nucleico biológicamente activo se utiliza para inactivar por ejemplo patógenos empleados para producir vacunas o para obtener material biológico no infeccioso, es esencial que la desintegración del ácido nucleico biológicamente activo sea completa. Por consiguiente, el procedimiento se utiliza como prueba de control de calidad para verificar el tratamiento adecuado de un material biológico con rayo láser o sustancia fotodinámica/rayo láser. Si el procedimiento se utiliza para producir una vacuna, la inmunogenicidad después de desintegración por rayo láser o por sustancia fotodinámica/rayo láser se evalúa habitualmente mediante investigaciones de inmunización y protección en animales de laboratorio, como ratones o conejos, determinación del tı́tulo de anticuerpos que se unen y ensayo de neutralización. Para asegurar que el procedimiento de inactivación no ha modificado la integridad y actividad del medio biológico, como por ejemplo sus propiedades antigénicas e inmunogénicas, también se emplea un procedimiento sensible para determinar 12 ES 2 185 003 T3 la antigenicidad. La conservación de la integridad y la actividad biológica, como la antigenicidad y la inmunogenicidad, de productos biológicos tratados de acuerdo con el procedimiento de la invención se analiza mediante trazado de mapas de epitopos y ensayo de eficiencia o mediante un ensayo de actividad. 5 La invención se describe más detalladamente a base de los siguientes ejemplos y la figura del dibujo, no estando limitada por los mismos. La Figura 1 muestra: Un sistema para la activación por rayo láser de una sustancia fotodinámica que ha sido añadida a un material biológico. 10 Una sustancia fotodinámica se introduce en un recipiente (A) que contiene el material biológico. Éste se bombea a un segundo recipiente (C) a través de un sistema con una ventanilla (B) para someterlo a la acción de un rayo láser. El material biológico se puede bombear de vuelta en sentido contrario o recircular para someter la muestra a varios ciclos de tratamiento con rayo láser. 15 Ejemplos Ejemplo 1 20 Inactivación de HIV-1, TBEV, virus de la gripe, HSV-1 y poliovirus mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser (en opinión del solicitante, actualmente el mejor modo de realización de la invención) 25 30 35 40 La Figura 1 muestra una descripción esquemática de este procedimiento. Se utiliza un sistema en el que el material biológico se conduce a través de un pequeño tubo o una cubeta con una ventanilla de cristal, y la ventanilla de cristal se irradia con un rayo láser. La densidad de energı́a que actúa sobre el material biológico se determina mediante la intensidad de irradiación del láser utilizada por el tiempo de permanencia del lı́quido en el área de irradiación con láser. La intensidad de irradiación del láser es la potencia del láser por superficie de irradiación con láser. El tiempo de permanencia en el rayo depende de la geometrı́a de la ventanilla de cristal y el caudal. En un matraz se introducen 100 ml de solución madre de virus, que se mantiene a 4◦ C bajo agitación. Una solución madre de azul de metileno con una concentración de 10 mM se añade a una concentración final de 2 µM. Después de agitar el material a fondo, éste se bombea a través de un pequeño tubo de acero inoxidable con una ventanilla de cristal, a través de la cual es irradiado con un rayo de un láser He-Ne con una longitud de onda de 663 nm y una intensidad de trabajo de 10 mW. En caso de un diámetro cuadrado de la ventanilla de cristal de 2 x 2 mm y un caudal de 4 ml/min resulta una velocidad de flujo a través del área de irradiación, y con ello un tiempo de permanencia de 0,06 sec/mm. Partiendo de una potencia del láser de 10 mW, la intensidad del láser por ciclo es de 0,6 mWs/mm2 o 0,06 J/cm2 . El material se recirculó durante 0 a 10 ciclos de irradiación y se tomaron muestras después de la cantidad de ciclos para la titulación de virus, tal como se describe más arriba. Unos controles con azul de metileno se sometieron a 30 ciclos bajo condiciones idénticas, pero sin irradiación. Los tı́tulos vı́ricos se determinaron antes y después del tratamiento con azul de metileno/láser y están resumidos en la Tabla 1. 45 50 55 60 13 ES 2 185 003 T3 TABLA 1 Inactivación de HIV-1, TBEV, virus de la gripe, HSV-1 y poliovirus mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 5 10 15 20 25 30 35 Ejemplo 2 40 45 Inactivación de poliovirus mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser con una mayor concentración de azul de metileno Una solución madre de azul de metileno se añadió a 100 ml de una solución madre de poliovirus a concentraciones finales de 1, 3, 10 ó 30 µM. Cada muestra se irradió a lo largo de 30 ciclos con 0,06 J/cm2 en cada caso, tal como se describe en el Ejemplo 1. El tı́tulo vı́rico se determinó después de la irradiación en cada una de las concentraciones de azul de metileno. Se demostró que el poliovirus sin envoltura se inactiva con más de 8 etapas log. 50 55 60 14 ES 2 185 003 T3 TABLA 2 Inactivación de poliovirus mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 5 10 15 20 Ejemplo 3 25 30 Comparación de la antigenicidad de preparados de vacuna inactivados con azul de metileno / rayo láser y con formalina Unos preparados de virus totales purificados mediante gradiente de sacarosa de HIV-1, gripe A/FPV/Rostock/34, un virus TBE y un preparado de subunidad de glicoproteı́na vı́rica purificado de células vero infectadas por el HSV-1 se sometieron a 30 ciclos de un tratamiento con azul de metileno (2 µM)/rayo láser (10 mW). Otros preparados idénticos se inactivaron mediante tratamiento con formalina (concentración final 0,05 %, 30 h a 37◦ C). Después de realizar un análisis de seguridad, tal como se describe en el Ejemplo 1, para asegurar que no hubiera ningún virus infeccioso, se determinó la antigenicidad de todos los preparados. 35 40 La antigenicidad de los preparados de HIV-1 se determinó utilizando el análisis Antigen-CaptureELISA comercial. Los preparados inactivados con azul de metileno / rayo láser se diluyeron dos veces en serie, antes de introducir 100 µl de cada dilución en una cavidad previamente revestida y purificada con IgG anti-HIV-1. Después se lavaron las placas a fondo y se añadieron 100 µl de anticuerpo anti-HIV-1 humano, que estaba unido de forma covalente con peroxidasa, y se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. A continuación se añadieron 200 µl de substrato activado (O-fenilén-diamina) y se incubaron hasta que la reacción se interrumpió mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 8 M y la extinción se comprobó a 490 nm. El tı́tulo antigénico se determinó como el valor recı́proco de la dilución más alta que produjo una reacción positiva. 45 50 La antigenicidad TBEV también se determinó mediante Antigen-Capture-ELISA utilizando una IgG anti-TBEV de cobaya como anticuerpo de captura. Los preparados inactivados se diluyeron dos veces en serie y se añadieron 100 µl de cada dilución y se incubaron durante 90 minutos a 37◦C. Después del lavado se añadieron 100 µl de suero anti-TBEV de conejo y, tras 60 minutos de incubación, se añadieron 100 µl de IgG anti-conejo unida a peroxidasa. Después se añadieron 200 µl de substrato activado (clorohidrato de O-fenilén-diamina) y la mezcla se incubó a oscuras hasta que la reacción se interrumpió mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 8 M y la extinción se comprobó a 490 nm. Adicionalmente, en el ELISA se utilizó como estándar un preparado de antı́geno TBEV de alta pureza, lo que posibilitó el cálculo directo de la cantidad del antı́geno TBEV reactivo. 55 60 También se midió la reactividad de antı́geno HSV, para lo que se empleó un set ELISA comercial modificado. Las muestras de antı́geno se diluyeron dos veces en serie y 100 µl de cada dilución se dispusieron en placas previamente revestidas con IgG anti-HSV-1 de conejo purificada. Después de la incubación y el lavado se añadió un anticuerpo anti-HSV-1 conjugado con peroxidasa. Éste se incubó a37◦C durante 1 h y, después del lavado, se añadieron 100 µl de substrato activado (clorohidrato de O-fenilén-diamina) y se incubaron durante 10 minutos a oscuras. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 5 M y la extinción se comprobó a 490 nm. La antigenicidad 15 ES 2 185 003 T3 5 se determinó empleando un estándar de antı́geno HSV-1 de alta pureza, cuya reactividad se determinó mediante el sistema ELISA. La antigenicidad de la gripe se midió mediante el ensayo de hemaglutinación, es decir, aglutinación de virus con eritrocitos. Esto se llevó a cabo de acuerdo con la descripción de Hirst “The Agglutination of Red Cells by Allantoic Fluid of Chicken Embryos Infected with Influenza Virus”, Science 94: 22-23 (1941). Los resultados están resumidos en la Tabla 3. TABLA 3 10 Comparación de la antigenicidad de vacunas inactivadas con azul de metileno / rayo láser y con formalina 15 20 25 Ejemplo 4 30 35 40 45 50 Inmunización de ratones con HIV-1 inactivado con formalina e inactivado con azul de metileno / rayo láser Un preparado de HIV-1 purificado mediante gradiente de sacarosa con un tı́tulo de aproximadamente 107 TCID50 /ml se inactivó con una concentración final de formalina del 0,05 % durante 30 horas a 37◦C. Después de este tratamiento, la formalina se separó por diálisis. El mismo preparado de HIV-1 se sometió a 10, 20 y 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser, tal como se describe más arriba, después de añadir azul de metileno para obtener una concentración final de 2 µM. A continuación, el azul de metileno se separó pasando la mezcla a través de una columna G-25 Sephadex. Se determinó y ajustó el contenido de proteı́nas de todos los preparados. Algunos grupos de diez ratones se inmunizaron con 10 µg de cada preparado, con Al(OH)3 como adyuvante, y los ratones recibieron cuatro semanas después una administración de refuerzo con la misma dosis de antı́geno. Dos semanas después de la segunda inmunización, los ratones fueron sacrificados para preparar suero y, tras reunir los sueros de los animales de cada grupo individual, se determinaron los tı́tulos de anticuerpo especı́fico de HIV-1 utilizando el set ELISA de virus total comercial. En pocas palabras: los sueros se diluyeron dos veces en serie y 100 µl de cada dilución se dispusieron sobre las placas previamente revestidas y se incubaron durante 1 hora a 37◦C. Después de un lavado a fondo, en cada cavidad se dispusieron 100 µl de IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa y se incubaron durante 1 hora a 37◦C. Después del lavado, en cada cavidad se añadieron 200 µl de substrato activado (clorohidrato de O-fenilén-diamina) y se incubaron durante 10 minutos a oscuras. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 5 M y la extinción se comprobó a 490 nm. El tı́tulo antigénico se determinó como el valor recı́proco de la dilución más alta que produjo una reacción positiva. Los resultados están resumidos en la Tabla 4. 55 60 16 ES 2 185 003 T3 TABLA 4 Comparación de la inmunogenicidad de HIV-1 inactivado con rayo láser/azul de metileno y con formalina 5 10 15 20 Ejemplo 5 25 30 35 40 45 50 Comparación de la desintegración de ácido nucleico de HIV-1 mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser y con formalina Un preparado de virus HIV-1 se inactivó mediante 30 horas de tratamiento con formalina en una concentración final de un 0,05 % a 37◦ C, o mediante tratamiento con rayo láser, tal como se describe en el Ejemplo 4, durante 10, 20 ó 30 ciclos, después de añadir azul de metileno para obtener una concentración de 2 µM. El tı́tulo vı́rico se calculó utilizando un método TCID50 estándar (Reed et al., 1938, Amer. J. Hyg. 27:493-497). La cantidad de copias de ARN se determinó mediante el siguiente procedimiento: 500 µl del preparado de virus inactivado se centrifugaron durante 20 minutos a 70.000 r.p.m. en R de una ultracentrifugadora. La pella se recogió en 1 ml de solución de guanidina-isocianato (RNAzol Biotec) y se añadieron 5 µl de 1 mg/ml ARN-t de levadura y una cantidad determinada, por ejemplo 20 µl, de ARN estándar. Después se añadió una cantidad predeterminada, por ejemplo 400 y 1200 copias, del estándar de ARN negativo y positivo y se agitaron en el vórtice. La solución se calentó durante 10 minutos a 70◦ C, después se añadió 1/10 volumen de cloroformo y se incubó durante 10 minutos sobre hielo. Después se centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora de mesa y el residuo se transfirió a recipientes nuevos. Luego se añadieron 500 µl de isopropanol y se ajustó durante 15 minutos a -80◦C. A continuación se centrifugó durante 10 minutos, se lavó dos veces con etanol al 70 % y la pella se recogió en 50 µl de agua. Para la RT-PCR se utilizaron 5 µl. Los plásmidos estándar utilizados pgag-15 y pgag+12 procedı́an del plásmido pgagl, que consiste en el plásmido pBS/SK conocido (de Stratagene) y una inserción en el sitio de clonación múltiple de este plásmido, inserción que contiene los pares de bases 1417 a 2008 del HIV-1 de Ratner et al. (1985, Nature 313: 277-284). El pgag-15 presentaba una deleción de los pares de bases 1593 a 1607, el pgag+12 presentaba una inserción de 12 pares de bases en el sitio 1593. En esta cuantificación se utilizaron cebadores que se unen a las secuencias de ADNc del HIV-1 y generan un producto de 115 pares de bases (peso) mediante RT-PCR de ARN de tipo salvaje, a saber: SK38: SK39: ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC HIV-1 HIV-1 1551-1578 1665-1638 y 55 60 (numeración según Ratner et al.). Por consiguiente, la longitud de los productos de RT-PCR del ADN estándar y el ADN de tipo salvaje era de 127 (pgag+12) y 100 (pgag-15). Los cebadores se produjeron aplicando la quı́mica de la fosfoamidita en un sintetizador de ADN (Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer). La estructura de RT-PCR contenı́a de forma conocida una parte alı́cuota del ácido nucleico extraı́do, tampón de RT de Perkin-Elmer, MgCl2, dNTPs, el cebador de RT y rT.th.Polymerase (Perkin Elmer, 2,5 17 ES 2 185 003 T3 5 unid./µl) y agua. La RT-PCR se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del tampón y la enzima o de acuerdo con las disposiciones de trabajo generales (Mullis et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 335-350) en un dispositivo de PCR (GeneAmp PCR System 9600 de Perkin-Elmer). Para determinar y cuantificar los productos de PCR se tomaron entre 0,5 y 1,0 µl de la solución de PCR y se analizaron en un Genescanner 373A-Instrument de Applied Biosystems de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de copias de ARN de los preparados de virus HIV se determinaron antes y después del tratamiento con azul de metileno / rayo láser. Los resultados están resumidos en la Tabla 5. 10 15 TABLA 5 Comparación de la desintegración de ácido nucleico de HIV-1 mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser y con formalina a través de la determinación del tı́tulo vı́rico y la cantidad de copias de ARN 20 25 30 35 40 Ejemplo 6 Desintegración de ADN de HSV y ADN de CEC mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 45 50 55 Se produjo una vacuna de subunidad de glicoproteı́na de HSV-1 a partir de células embrionarias de pollo infectadas con HSV-1 mediante extracción con detergente, purificación con gradiente de sacarosa y posterior cromatografı́a con lentil-lectina. Este preparado se sometió después a una inactivación con formalina (30 horas, concentración final de formalina 0,05 % a 37◦ C) o a un tratamiento de 30 ciclos con azul de metileno / rayo láser con una concentración final de azul de metileno de 2 µM. Antes y después de los dos tratamientos se determinó el ADN de las células embrionarias de pollo y el ADE e HSV-1 en la muestra tratada con azul de metileno / rayo láser y con formalina. Para la cuantificación de ADN de HSV se utilizaron cebadores que se unen en al genoma del HSV y generan un producto de 114 pares de bases mediante PCR de ADN de tipo salvaje, a saber: gDR1/B: gDR2/B: 60 AAC TAC CCC GAT CAT CAG y AGG CCC ACT TAG ACG ACA. El plásmido estándar pHerp-9 procedı́a del plásmido pHerp, que consiste en el plásmido pCRII conocido (de In Vitrogen) y una inserción de los pares de bases 128364 a 138784 del genoma del HSV (McGeoch D. J. et al., EMBL GenBank ID HE1CG1). El pHerp-9 presentaba una deleción de 9 pares de 18 ES 2 185 003 T3 bases. Los plásmidos pHerp y pHerp-9 se purificaron, la concentración se determinó mediante medición espectroscópica a 260 nm y se llevó a cabo una linealización con una enzima de restricción y una dilución en un tampón TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8). 5 Este preparado de ADN sirve como estándar para la PCR. las longitudes de los productos PCR estándar y de tipo salvaje eran de 105 pares de bases (pHerp-9) y 114 pares de bases (pHerp). El ADN cromosómico de pollo se cuantificó utilizando el par de cebadores CR1: CR1A: 10 15 20 ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC AGGGCCACATCCAGCCTGG. y Estos cebadores son especı́ficos de secuencias repetitivas procedentes de aves, por cuanto que se unen de forma especı́fica dentro de las secuencias conservadas y amplifican un fragmento de ADN con una longitud de 846 pares de bases. Los plásmidos estándar pCR+11 y pCR1-8 se obtuvieron mediante inserción de oligo-nucleóticos sintéticos, que contenı́an la secuencia procedente de CR1 de la posición 260 a la 345 (según Stumph et al., 1981, Nucl. Acid. Res. 9: 5383-5397), entre los sitios NcoI y SacI del vector p-Bluscript. En el pCR+11, la secuencia de CR1 contiene una inserción de 11 nucleótidos, y en el plásmido estándar pCR1-8 una deleción de 8 nucleótidos en la posición 302 (según Stumph et al.). Por ello, los productos de PCR procedentes de estos plásmidos estándar tienen una longitud de 95 pares de bases y 76 pares de bases, respectivamente. Los resultados de la cuantificación de ADN de HSV y ADN de CEC están resumidos en la Tabla 6. TABLA 6 25 Cuantificación de ácido nucleico de HSV-1 y CEC antes y después de la desintegración mediante tratamiento con azul de metileno/láser o inactivación con formalina de una vacuna de subunidad de HSV 30 35 40 45 Ejemplo 7 Comparación de la desintegración de ADN de células vero mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser y con formalina 50 55 60 Una vacuna candidata de HIV-1-gp160 se limpió de células vero recombinantes infectadas con vaccinia. Esto tuvo lugar mediante extracción con desoxicolato, seguida de cromatografı́a con lentil-lectina y cromatografı́a de inmunoafinidad, de acuerdo con Barret et al. (AIDS Res. Human Retrov. 5 (1989) 159-171). Este preparado se sometió después a una inactivación con formalina (30 horas, concentración final de formalina 0,05 %, 37◦C) o a 30 ciclos de un tratamiento con azul de metileno / rayo láser con una concentración final de azul de metileno de 2 µM, tal como se describe en el Ejemplo 1. El contenido de ADN de células vero del material de partida y después de la inactivación mediante tratamiento con formalina y con azul de metileno / rayo láser se determinó utilizando los cebadores: Alu A2/2: GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT Alu B: GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG, 19 y ES 2 185 003 T3 que se unen en una zona altamente conservada en las, ası́ llamadas, secuencias “Alu repeat” y amplifican un fragmento de 146 pares de bases (Jelinek et al., Ann. Rec. Biochem. 51 (1982) 813-844). 5 El plásmido estándar pAlu20 procedı́a del plásmido pAlu-wt, que consiste en el plásmido pCRII conocido (de In Vitrogen) y una inserción en el sitio de clonación múltiple del plásmido pCRII, inserción que contiene los pares de bases 148 a 294 de la secuencia especı́fica Alu-repeat de Batzer et al. (1990, Nucl. Acid. Res. 18:6793-6798). 10 El pAlu20 presentaba una deleción de los pares de bases 178 a 197. Por consiguiente, los productos de PCR de pAlu20 estándar y ADN de tipo salvaje tienen una longitud de 126 pares de bases y 146 pares de bases, respectivamente. Los resultados de la cuantificación de ADN antes y después de la desintegración están resumidos en la Tabla 7. 15 TABLA 7 Desintegración de ADN de células vero mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser en una vacuna GP160 de HIV-1 recombinante 20 25 30 Ejemplo 8 35 Efecto del tratamiento con azul de metileno / rayo láser sobre un cultivo celular recombinante procedente de FVIII 40 45 50 Un cultivo de células de CHO recombinantes, que se transfectaron con un ADNc codificador de actividad de FVIII, se mezcló con un retrovirus de ratón ecotropo, cepa MuLV, y se añadió azul de metileno hasta obtener una concentración final de 2 µM. Éste se sometió después a 10, 20 y 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser, tal como se describe en el Ejemplo 1. El tı́tulo vı́rico y la actividad de FVIII se determinaron antes de la adición del azul de metileno y después de 10, 20 y 30 ciclos de tratamiento con rayo láser. El tı́tulo vı́rico se determinó utilizando el ensayo XC-Plaque, de acuerdo con la descripción de Hartley et al. (1975, Virology 65, 128-134), y la actividad de FVIII se determinó mediante el proceR -Reagens-Set. dimiento cromógeno, tal como se describe en las instrucciones del Immunochrom Los resultados resumidos en la Tabla 8 muestran que, después de 10 ciclos de irradiación con rayo láser en presencia de azul de metileno 2 µM, el virus está inactivado de forma eficiente. bajo estas condiciones, la actividad de FVIII permanece esencialmente inalterada. 55 60 20 ES 2 185 003 T3 TABLA 8 Inactivación de MuLV mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser en un preparado de rFVIII y determinación de la actividad de rFVIII 5 10 15 20 25 Ejemplo 9 Efecto del tratamiento con azul de metileno / rayo láser en un vWF recombinante procedente de un cultivo celular 30 Un residuo de un cultivo celular de CHO (chinese hamster ovary -ovario de hámster chino), que expresa vWF recombinante, se sometió a un tratamiento con azul de metileno / rayo láser, tal como se describe en el Ejemplo 8 para el rFVIII. Antes de la adición del azul de metileno y después de 10, 20 y 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser/azul de metileno se tomaron muestras para determinar la actividad de RistoCo:F y el antı́geno vWF. Los resultados están resumidos en la Tabla 9. 35 TABLA 9 Actividad de RistoCo:F de rvWF después de tratamiento con azul de metileno / rayo láser 40 45 50 55 Ejemplo 10 Desintegración de oncogenes mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 60 Se indujo una activación de oncogenes, que condujo a un linfoma de timo en ratones C57 B1/6J, mediante inyección intraperitoneal del carcinógeno quı́mico N-nitroso-metil-urea (30 mg por kg, una vez por semana, 5 semanas sucesivas). A partir de los tumores tı́micos se produjo mediante técnicas estándar 21 ES 2 185 003 T3 ADN de alto peso molecular que contenı́a el oncogén inducido. El ADN se preparó con una concentración de 100 µg/ml con 2 µmol/ml de azul de metileno y se inactivó mediante la acción de 30 ciclos de rayo láser a 632 nm con una intensidad de 10 mW. También se trataron de modo idéntico preparados de control sin azul de metileno. 5 10 La tumorogenicidad de los dos preparados se analizó mediante ensayos de transfección-transformación en células NIH/3T3. Estas células se desintegraron con azul de metileno / rayo láser y se transfectaron con ADN de control utilizando el método de precipitación de CaPO4 . El ADN precipitado se mezcló con medio de cultivo de tejidos y se dispuso en placas de Petri de plástico que contenı́an células NIH/3T3 (25 µg de ADN a 5 x 105 células). Después del subcultivo y de 20 dı́as de incubación se observaron numerosos focos grandes consistentes en células transformadas morfológicamente y se contaron en cada preparado de ADN en un total de diez placas. 15 TABLA 10 Determinación de la oncogenicidad de ADN antes y después de tratamiento con láser y tratamiento con azul de metileno/láser 20 25 30 35 Ejemplo 11 40 Desintegración de oncogenes mediante tratamiento con rayo láser Se preparó ADN de alto peso molecular, que contenı́a oncogenes inducidos, tal como se describe en el Ejemplo 10, y se desintegró con 30 ciclos de acción del rayo láser a 320 nm con una intensidad de 10 mW. La tumorogenicidad del preparado se analizó tal como se describe en el Ejemplo 11. 45 50 55 60 22 ES 2 185 003 T3 TABLA 11 Determinación de la oncogenicidad de ADN antes y después de tratamiento con láser a 320 nm 5 10 15 20 Ejemplo 12 25 30 35 40 45 Inactivación de retrovirus de ratón en un residuo de hibridoma con contenido de anticuerpos monoclonales A un retrovirus de ratón ecotropo, cepa MuLV SN-E81, se le añadió un residuo de hibridoma que contenı́a un anticuerpo monoclonal dirigido contra el gp160 de HIV-1. Después se añadió al residuo azul de metileno hasta una concentración final de 2 µM y la mezcla se sometió a 10, 20 y 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser, tal como se describe más arriba. Antes de la adición del azul de metileno y después de 10, 20 y 30 ciclos de tratamiento con rayo láser se determinaron el tı́tulo vı́rico y el tı́tulo de anticuerpos. El tı́tulo vı́rico se determinó utilizando el ensayo de formación de focos XC, de acuerdo con la descripción de Hartley et al. (1975, Virology 65, 128-134). El tı́tulo de anticuerpos se determinó mediante técnicas ELISA estándar utilizando placas revestidas con gp160 recombinante. En pocas palabras: las placas de microtitulación se revistieron con 0,5 µg de gp160 de HIV-1 recombinante purificado, para lo que se utilizaron 100 µl por cavidad. Los sueros se diluyeron dos veces en serie y 100 µl de cada dilución se dispusieron sobre las placas previamente revestidas y se incubaron durante 1 hora a 37◦ C. Después de un lavado a fondo, en cada cavidad se dispusieron 100 µl de IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa y se incubaron durante 1 hora a 37◦ C. Después del lavado, en cada cavidad se añadieron 200 µl de substrato activado (clorohidrato de O-fenilén-diamina) y se incubaron durante 10 minutos a oscuras. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 5 M y la extinción se comprobó a 490 nm. El tı́tulo antigénico se determinó como el valor recı́proco de la dilución más alta que produjo una reacción positiva. Los resultados se resumen en la Tabla 12. TABLA 12 Tı́tulo de MuLV y tı́tulo de anticuerpos después del tratamiento con azul de metileno/láser 50 55 60 23 ES 2 185 003 T3 Ejemplo 13 Eficacia de TBEV inactivado con formalina y con azul de metileno / rayo láser en un modelo de provocación en ratón 5 10 15 20 El virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (Tick-Borne Encephalitis-Virus, TBEV), cultivado en células embrionarias de pollo, se inactivó mediante tratamiento con formalina (0,05 % formalina, 37◦C, durante 30 horas) o mediante tratamiento con azul de metileno (30 ciclos de irradiación con láser con una concentración de azul de metileno de 2 µM). Los dos preparados se purificaron adicionalmente mediante gradiente de sacarosa seguido de diálisis. Las muestras se diluyeron para obtener concentraciones iguales de proteı́nas. La inmunogenicidad de los preparados se determinó mediante PD50 , seguido de adición de alumbre como adyuvante. Algunos grupos de veinte ratones se inmunizaron por vı́a subcutánea con diluciones triples de los preparados de vacuna con adyuvante. Una semana después de la inmunización, los ratones recibieron una administración de refuerzo con la misma dosis de antı́geno. Dos semanas después de la segunda inmunización, los ratones fueron sometidos a una provocación mediante vacunación intraperitoneal con 102 dosis LD50 del virus vivo. Los ratones se observaron después durante un perı́odo de 21 dı́as y se registró la cantidad de ratones supervivientes después de dicho perı́odo. La dosis protectora para el 50 % de los ratones (PD50 ) se calculó de acuerdo con el procedimiento de Kärber, 1931, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480-483, y se muestra en la Tabla 13. TABLA 13 25 Medición de la eficacia de vacunas de TBEV inactivado con azul de metileno / rayo láser y con formalina 30 35 40 Ejemplo 14 Comparación de la reactividad del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas inactivado con formalina e inactivado con azul de metileno / rayo láser en caso de una serie de anticuerpos monoclonales especı́ficos 45 50 55 60 El virus de la TBE se cultivó en células embrionarias de pollo primarias y se purificó con dos ciclos de centrifugación de gradiente de densidad de sacarosa. Después se hizo una pella mediante ultracentrifugación, se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 7,2 y se llevó a cabo una inactivación con formalina (concentración final de formalina 0,05 %, 30 horas a 37◦C) o una inactivación con azul de metileno / rayo láser (concentración final de azul de metileno 2 µM, diez ciclos). A continuación, los dos preparados se sometieron a una cromatografı́a en Sephadex 6-25 y, después de la elución, se ajustaron para obtener concentraciones iguales de proteı́nas. Las reactividades de los dos preparados con ocho anticuerpos monoclonales diferentes, dirigidos contra glicoproteı́na de virus de la TBE, se determinaron mediante técnicas ELISA estándar. Las placas de microtitulación se revistieron con el preparado de virus en una concentración de 2 µg/ml en tampón de carbonato, pH 9,6. Después del lavado se añadieron los anticuerpos monoclonales y se dejaron reaccionar durante 1 hora a 37◦ C. A continuación se añadió inmunoglobulina anti-ratón conjugada con peroxidasa y, después de incubarla durante una hora a 37◦C y lavarla, se añadió el substrato y se midió la extinción a 492 nm, tras lo cual se interrumpió la reacción mediante la adición de H2 SO4 2N. Todos los anticuerpos monoclonales mostraban una reactividad mayor en el caso del preparado de virus inactivado con azul de metileno / rayo láser que en el caso de la preparación de vacuna inactivada con formalina. Los resultados están resumidos en la Tabla 14. 24 ES 2 185 003 T3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25 ES 2 185 003 T3 Ejemplo 15 Desintegración de ácido nucleico de un patógeno procariótico mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 5 10 Un cultivo de células B. burgdorferi se desarrolló hasta una cantidad de células de 1 x 107 espiroquetas/ml y se añadió azul de metileno hasta una concentración final de 2 µM. El cultivo se sometió a 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser. Antes y después del tratamiento con azul de metileno / rayo láser se determinó la presencia de ADN de B. burgdorferi mediante amplificación con PCR utilizando los cebadores LD1: LD2: 15 ATG CAC ACT TGG TGT TAA CTA GAC TTA TCA CCG GCA GTC TTA (según Marconi et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:2830-2834). Ejemplo 16 20 25 30 Inactivación de parvovirus en un producto procedente de plasma humano mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser Una solución de FVIII concentrado de alta pureza se mezcló con parvovirus microvirus de ratón (Minute Virus of Mice, MVM) y se añadió azul de metileno hasta una concentración final de 30 µM. Después se sometió a 10, 20 y 30 ciclos de un tratamiento con rayo láser, tal como se describe en el Ejemplo 1. Antes de la adición del azul de metileno y después de 10, 20 y 30 ciclos de tratamiento con rayo láser se determinaron el tı́tulo vı́rico y la actividad de FVIII. El tı́tulo vı́rico se midió mediante determinación TCID50 (Reed et al., 1938, Amer. J. Hyg. 27:493-497) utilizando células A9 (ATCC CRL 6319), y la actividad de FVIII se determinó mediante el procedimiento cromógeno, tal como se describe en las instrucciones del Immunochrom-Reagens-Set. Los resultados resumidos en la Tabla 15 muestran que casi 5 log MVM quedan inactivados después de 30 ciclos de tratamiento de rayo láser/azul de metileno. Bajo estas condiciones se conserva más de un 50 % de la actividad de FVIII. TABLA 15 35 Inactivación de parvovirus MVM en FVIII concentrado mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser 40 45 50 55 Ejemplo 17 60 Desintegración del ácido nucleico de parvovirus B19 mediante tratamiento con azul de metileno/láser y comprobación de la desintegración Un preparado de plasma se comprobó con una solución concentrada de virus de tı́tulo elevado de parvovirus B19 humano. Después se añadió azul de metileno a esta mezcla hasta una concentración final 26 ES 2 185 003 T3 5 10 de 30 µM. Después de mezclar la solución a fondo, el material se bombeó con un caudal de 4 ml/minuto a través de un pequeño tubo de acero inoxidable con una ventanilla de cristal con un diámetro de 2 x 2. La ventanilla de cristal se irradió con un rayo láser de He-Ne con una longitud de onda de 633 nm y una potencia del láser de 10 mM. El material se irradió entre 0 y 50 ciclos y el ADN de parvovirus B19 se determinó cuantitativamente mediante PCR en muestras tomadas después de 0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 y 50 ciclos. Como control se utilizó una mezcla que contenı́a azul de metileno pero que no se irradió con luz láser. Los resultados de la determinación cuantitativa de la cantidad de copias de ADN especı́fico de B19 están resumidos en la Tabla 16. Los resultados muestran que, después de aproximadamente 40 ciclos de tratamiento con azul de metileno/luz láser, el contenido de ADN especı́fico de B19 habı́a disminuido por debajo el lı́mite de detección del sistema de medición. TABLA 16 15 Desintegración de ADN de parvovirus B19 mediante tratamiento con azul de metileno / rayo láser y determinación de la cantidad de copias de ADN antes y después del tratamiento 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27 ES 2 185 003 T3 REIVINDICACIONES 5 10 15 20 1. Procedimiento para la desintegración de ácidos nucleicos en un material con contenido de proteı́nas biológicamente activo, caracterizado porque a un material biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, la mezcla se expone a una irradiación con luz láser con una intensidad ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo, para reducir la actividad de molde de ácido nucleico en el material biológico como mı́nimo en un factor de 7 etapas log, o para reducir el contenido de ácido nucleico a <100 pg/ml, preferentemente <10 pg/ml, de forma especialmente preferente <1 pg/ml, con el fin de desintegrar o inactivar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo de dicho material biológico, conservando al mismo tiempo en lo esencial la integridad y actividad biológica del material biológico. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la inactivación o desintegración del ácido nucleico se controla mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos y se obtiene un material biológico cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la sustancia fotodinámica es azul de metileno, azul de toluidina o azur B. 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sustancia fotodinámica está presente en una concentración entre 0,01 µM y 50 µM, preferentemente entre 1 µM y 40 µM. 25 30 35 40 45 50 55 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la longitud de onda del rayo láser se encuentra en la gama de ondas del ı́ndice de activación máximo de la sustancia fotodinámica, preferentemente entre 600 y 680 nm. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la intensidad de la luz láser es ≤ 0,08 J/cm2 , y de forma especialmente preferente ≤ 0,06 J/cm2 . 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque antes de la irradiación láser se añade un estabilizador, como azúcar, polialcohol, aminoácidos, péptidos o ácidos carboxı́licos, y/o un agente de extinción y/o de depuración, como manita, glicerina, glutatión reducido o superóxidodismutasa. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque antes de la adición de la sustancia fotodinámica se añaden un agente de extinción, un agente de depuración y/o un estabilizador. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el procedimiento para la cuantificación de ácidos nucleicos es preferentemente un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, en el que, antes del paso de amplificación, se añade una cantidad determinada de como mı́nimo una molécula de ácido nucleico conocido como estándar interno, diferenciándose la molécula estándar del ácido nucleico a cuantificar como mı́nimo en una caracterı́stica detectable. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el material biológicamente activo es una solución que presenta un factor sanguı́neo, un producto con contenido de proteı́nas generado mediante técnicas de ingenierı́a genética o un patógeno microbiológico y/o molecular, o una parte de éstos. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el material biológico es un cultivo celular, una suspensión celular, una capa celular, un residuo de cultivo celular o un preparado celular abierto, procedente de células infectadas, transfectadas o transformadas. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el ácido nucleico activo es un ADN o ARN, un genoma o una parte de éste, como por ejemplo un gen. 60 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el ácido nucleico activo presenta una actividad de molde de ácido nucleico e incluye una secuencia para unión de cebador y polimerasa, pudiendo amplificarse el ácido nucleico mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico. 28 ES 2 185 003 T3 14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el ácido nucleico activo procede de una fuente eucariótica, como por ejemplo una célula de vertebrado, una lı́nea celular tumoral, un oncogén o un protooncogén, o una lı́nea celular de hibridoma. 5 15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el ácido nucleico procede de un microorganismo, como por ejemplo un protozoo, una bacteria, un virus, un patógeno microbiológico o molecular, o una parte de éstos. 10 15 16. Procedimiento para la inactivación de virus, caracterizado porque a un material biológico que contiene virus se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, la mezcla se expone a una irradiación con luz láser con una intensidad ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo, para reducir la actividad de molde de ácido nucleico en el material biológico como mı́nimo en un factor de 7 etapas log, o para reducir el contenido de ácido nucleico a <100 pg/ml, preferentemente <10 pg/ml, de forma especialmente preferente <1 pg/ml, con el fin de desintegrar o inactivar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo de dicho material biológico, conservando al mismo tiempo en lo esencial la integridad y actividad biológica del material biológico. 20 17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el virus es un virus lipı́dico (con envoltura), un virus no lipı́dico (sin envoltura), un virus de ADN o un virus de ARN, o un virus atenuado. 25 18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el virus pertenece al grupo de adenovirus, herpesvirus, papovavirus, poxvirus, parvovirus, reovirus, retrovirus, mixovirus, paramixovirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, ortomixovirus o rabdovirus, siendo preferentemente un virus de la gripe, HIV, HCV, HAV, HBV, TBEV o CMV, y en caso dado estando el virus atenuado. 30 35 19. Procedimiento para la inactivación de virus sin envoltura en un material biológico con contenido de proteı́nas, caracterizado porque a un material biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, en una concentración de como mı́nimo 20 µM, y la mezcla se expone a un rayo láser en la gama de ondas del ı́ndice de activación máximo de la sustancia fotodinámica con una intensidad de la luz láser ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo, preferentemente ≤ 0,06 J/cm2 por ciclo, durante como mı́nimo 20 ciclos. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque se inactivan virus sin envoltura, en particular pertenecientes al grupo de los picornaviridae y parvoviridae. 21. Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque se desintegra o inactiva en lo esencial todo el ácido nucleico infeccioso biológicamente activo de dicho material biológico, conservándose al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del material con contenido de proteı́nas. 40 45 22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la inactivación o desintegración se controla mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos y se obtiene un material biológico cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico. 23. Utilización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 22 para producir un material biológico inactivado en cuanto a virus, que en particular no presenta ningún virus infeccioso sin envoltura lipı́dica. 50 24. Utilización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 22 para la producción de una vacuna de virus inactivado. 55 60 25. Procedimiento para la producción de una vacuna de virus inactivado, caracterizado porque a un material que contiene virus biológico se le añade una sustancia fotodinámica seleccionada entre el grupo de las fenotiazinas, la mezcla se somete a una irradiación con luz láser con una intensidad ≤ 0,1 J/cm2 por ciclo para desintegrar o inactivar en lo esencial todo el ácido nucleico biológicamente activo del material biológico conservando al mismo tiempo la integridad y la actividad biológica del virus, como antigenicidad e inmunogenicidad, la desintegración del ácido nucleico se controla mediante un procedimiento para cuantificar ácidos nucleicos, y se obtiene un material que contiene virus cuyo contenido de ácido nucleico es inferior a 100 pg, preferentemente inferior a 10 pg, de forma especialmente preferente inferior a 1 pg por dosis, o que presenta como máximo de 1 a 500 copias/ml y por lo tanto está libre en 29 ES 2 185 003 T3 lo esencial de actividad de molde de ácido nucleico, los virus inactivados se someten en caso dado a otra purificación, y los virus inactivados se formulan con un vehı́culo fisiológicamente aceptable para producir una vacuna de virus. 10 26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el microorganismo es un patógeno vı́rico, como un virus con envoltura lipı́dica o sin ella, un virus que contiene ADN o ARN seleccionado entre el grupo de adenovirus, herpesvirus, papovavirus, poxvirus, parvovirus, reovirus, retrovirus, mixovirus, paramixovirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, ortomixovirus o rabdovirus, siendo preferentemente un virus de la gripe, HIV, HCV, HAV, HBV, TBEV o CMV, y en caso dado estando el virus atenuado. 15 27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque el material que contiene virus procede de un cultivo de células infectadas por virus, un residuo de cultivo de células infectadas por virus, un componente celular de células infectadas por virus o una solución que contiene virus purificados. 5 28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque las células infectadas por virus son células de vertebrados, como células embrionarias de pollo, células VERO, células CV-1, células LLC-MK-2, células MDCK, células MDBK, células WI-38 o células MRC-5. 20 29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque el ácido nucleico inactivado o desintegrado procede de la célula y/o el virus. 25 30 35 40 45 50 55 60 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada reserva. 30 ES 2 185 003 T3 31

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