KIP0981 hCG+b-IRMAesp V.19-02-2008

2 x 48
8 x 48
Gris
Listo para usar
1 vial
5.5 ml
450KBq
4 viales
5.5 ml
4x450 KBq
Rojo
Listo para usar
6 viales
liofilizados
2 x 6 viales
liofilizados
Amarillo
Agregar 0.5 ml de agua
destilada
3 viales
10 ml
8 viales
10 ml
Amarillo
Listo para usar
1 vial
10 ml
3 viales
10 ml
Marrón
Diluir 70x con agua destilada
(use un mezclador magnético)
2 viales
liofilizados
2 x 2 viales
liofilizados
Plateado
Agregar 0.5 ml de agua
destilada
tubos cubiertos con hCG +
B (anticuerpos
monoclonales)
Lea el protocolo completamente antes de usarlo.
I. USO PROGRAMADO
Ensayo inmunoradiométrico para la medición cuantitativa in Vitro de gonadotropina coriónica humana en suero y
plasma.
II. INFORMACION GENERAL
Calibradores 1-6 suero bovino y
timol (ver valor exacto sobre las
etiquetas de los viales)
A. Nombre del propietario: BioSource Kit hCG +ß IRMA
B. Número del catalogo: KIP0981 : 96 pruebas
KIP0984: 4 x 96 pruebas
C. Manufacturado por: BioSource Europe S.A.
Rue de l'Industrie, 8, B-1400 Nivelles, Bélgica.
III. ANTECEDENTES CLINICOS
A. Actividades Biológicas
La hCG es una glicoproteína sintetizada por el sincitiotrofoblastos de la placenta a lo largo del embarazo.
El peso molecular del hCG es de 37.9 kDa - comprende dos subunidades. El peso molecular de la subunidad alfa
de la hCG es de 14.9 Kda – es químicamente similar a la subunidad alfa de las hormonas FSH, LH y TSH. El peso
molecular de la subunidad beta de hCG es de 23.0 kDa – tiene una estructura similar a la de la subunidad beta
de la LH, diferenciándose únicamente por unos pocos epítopes. La hCG tiene características biológicas similares a
la LH. Durante el embarazo, el hCG estimula el cuerpo luteo restante y el tejido de la placenta para segregar una
variedad de hormonas esteroides. Además de su acción estimulante sobre el tejido luteo y de la placenta, la hCG,
cruza la placenta y es esencial para diferenciar el aparato genital del feto, que ocurre alrededor de la séptima
semana de embarazo.
B. Aplicación Clínica de la hCG+ß – IRMA
— Prueba de diagnostico y monitoreo durante el embarazo
La hCG y sus subunidades α y ß libres aparecen en el suero y la orina de la mujer embarazada cerca de 9 días
después de la ovulación. El nivel de hCG entonces se incrementa rápidamente para alcanzar un pico entre la
octava y la décimo segunda semana.
— Prueba De Marcador Tumoral en Tumores Trofoblasticos
Las molas hidatiformes y los coriocarcinomas pueden segregar grandes cantidades de
subunidades α y ß libres en la circulación de sangre periférica.
hCG nativo y sus dos
10 a 15 % del cáncer de mama, pulmones, y aparato digestivo libera hCG y/o cualquiera de sus dos subunidades α
y ß constitutivas.
IV. PRINCIPIO DEL METODO
BioSource hCG+ß - IRMA es un ensayo inmunoradiodimétrico basado en la separación sobre tubos cubiertos en la
cual varios anticuerpos monoclonales dirigidos contra distintos epítopes de hCG han sido usados.
Anticuerpos monoclonales 1– los anticuerpos de captura son adheridos a la superficie interior mas baja del tubo
plástico. Los calibradores o muestras agregadas a los tubos mostraran en primera medida baja afinidad por
anticuerpos monoclonales 1. Adición de anticuerpos monoclonales 2, el anticuerpo señal marcado con I125,
completa el sistema y disparara la reacción inmunológica. Después del enjuague, la restante radioactividad unida
al tubo refleja la concentración del antigeno.
V. REACTIVOS SUMINISTRADOS
Cantidad 96
pruebas
Cantidad
4x 96
pruebas
Código de
color
Calibrador 0 en
suero bovino y
timol (ver valor
exacto sobre las etiquetas de los
viales)
Solución de
lavado (TRISHCL)
Controles 1 y
2 en suero
humano con timol.
Nota: Use también el contenido del calibrador cero para diluciones de muestras.
1 mIU de la preparación del calibrador es equivalente a 1 mIU de 4th IS 75/589
VI. SUMINISTROS NO PROPORCIONADOS
El siguiente material es requerido pero no suministrado en el kit:
1. Agua destilada
2. Pipetas para entrega de: 50 µl y 500 µl (Se recomienda el uso de pipetas apropiadas con puntas plásticas
desechables)
3. jeringa automática 5 ml (tipo Cornwall) para lavado
4. Sistema de aspiración (opcional)
5. Mezclador Vortex
6. Mezclador magnético
7. Batidor de tubo (400 rpm)
8. Cualquier contador gama con capacidad de medición I125 puede ser usado (rendimiento mínimo 70%).
VII. PREPARACION DEL REACTIVO
— Prueba de marcador tumoral en cáncer no trofoblástico
Reactivos
Anti hCG +B +I
125 (anticuerpos
monoclonales)
en TRIS búfer con albúmina sérica
bovina, azida sódica (< 0.1%) y tinte
rojo inerte
Reconstitución
1. Calibradores 1-6: Reconstituya los calibradores con 0.5 ml de agua destilada.
2. Controles: Reconstituya los controles con 0.5 ml de agua destilada.
3. Solución de Lavado: Prepare un volumen adecuado de solución de enjuague activo adicionando 69
volúmenes de agua destilada a 1 volumen de solución de enjuague (70x). Use un mezclador magnético para
homogenizar. Deseche la solución de enjuague activa no utilizada al final del día.
VIII. ALMACENAMIENTO Y FECHA DE EXPIRACION DE LOS REACTIVOS
- Antes de abrir o reconstituir, todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de vencimiento, indicada
en la etiqueta, si se ha conservado entre 2 y 8°C.
- Después de la reconstitución, los calibradores y controles son estables por 7 días entre 2-8°C.
Para periodos de almacenamiento mas prolongados, se deben hacer alícuotas y guardarlas a -20°C por 3 meses.
Evite los ciclos de refrigeración y congelación subsecuentes.
- La solución de lavado recién preparada debe ser usada el mismo día.
- Después de su primer uso, el rastreador es estable hasta la fecha de vencimiento, si se ha conservado en el vial
original bien cerrado entre 2 y 8°C.
- Las alteraciones en la apariencia física de los reactivos del kit pueden indicar inestabilidad o deterioro.
IX. . RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA
- Las muestras de suero o plasma deben ser conservadas de 2-8°C.
- Si la prueba no es ejecutada dentro de las 24 horas siguientes, se recomienda almacenarla a -20°C.
- Evite los ciclos de congelar y descongelar subsecuente.
- El suero y plasma heparinizado o EDTA provee resultados similares.
y(serum) = 1.03x (HEP. plasma) + 0.07
r = 0.99
n = 30
y(serum) = 1.00x (EDTA plasma) - 0.47
r = 0.99
n = 30
XIII. DESEMPEÑO Y RESTRICCIONES
A. Limite de Detección
Veinte estándares cero fueron ensayados junto con un set de otros calibradores.
La sensibilidad, definida como la concentración aparente dos desviaciones estándar sobre el conteo promedio al
enlace cero, fue 1.6 mU/ml.
X. PROCEDIMIENTO
A. Notas sobre el manejo
No use el kit o los componentes más allá de la fecha de vencimiento.
No mezcle materiales de diferentes lotes de kit.
Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente antes de su uso.
Mezcle completamente todos los reactivos y las muestras mediante suave agitación o en vortex.
Use una punta de pipeta desechable limpia para la adición de cada reactivo diferente y la muestra con el fin de
evitar la contaminación cruzada.
Las pipetas de alta precisión o equipos automatizados para pipetear mejoraran la precisión.
Respete los tiempos de incubación.
Prepare una curva de calibración para cada ensayo, no use la información de ensayos previos.
B. Procedimiento
1. Marque los tubos cubiertos en duplicado para cada calibrador, control, muestra. Para la determinación del nivel
total de actividad, marque 2 tubos plásticos sencillos.
2. Brevemente mezcle en Vortex los calibradores, controles, muestras y dispense 50 µl de cada uno en los
respectivos tubos.
3. Dispense 50 µl de trazador anti-hCG+ß- I125 en todos los tubos incluyendo los tubos no cubiertos para conteo
total.
4. Agite el contenido de los tubos suavemente de forma manual para liberar cualquier burbuja de aire atrapada.
5. Incube por 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de tubos (400 rpm).
Respete cuidadosamente los tiempos de incubación
6. Aspire (o Decante) el contenido de cada tubo (excepto el conteo total). Asegúrese de que la punta plástica del
aspirador alcanza el fondo del tubo cubierto con el fin de remover todo el líquido.
7. Lave los tubos con 2 ml de solución de lavado (excepto el conteo total). No deje formar espuma durante la
adición de la solución de lavado.
8. Aspire (o Decante) el contenido de cada tubo (excepto el conteo total).
9. Lave los tubos con 2 ml de solución de lavado (excepto el conteo total) y aspire (o Decante).
10. Después del último lavado, deje los tubos en posición derecha por dos minutos y aspire las gotas restantes de
líquido.
11. Lea los tubos en un contador gama por 60 segundos.
XI. CALCULO DE RESULTADOS
1. Calcule la media de determinaciones dobles.
2. En papel gráfico semi logarítmico o lineal trace el c.p.m. (ordenada) para cada calibrador contra la
concentración correspondiente de hCG+ ß (abcisa) y dibuje una curva de calibración a través de los puntos,
rechace las desviaciones obvias.
3. Lea la concentración para cada control y muestra mediante la interpolación sobre una curva de calibración.
4. La reducción de la información asistida por computador simplificará estos cálculos. Si un proceso de resultados
automáticos es usado, se recomienda un ajuste a la curva de la función logística de 4 parámetros.
Los tubos cubiertos con anticuerpos monoclonales anti AFP.
Hormonas agregadas
FSH
LH
TSH
AhCG
BhCG
CAL 1
Valores hCG observados
9.8 mIU/ml
11.3 mIU/ml
10.9 mIU/ml
10.3 mIU/ml
11.0 mIU/ml
361.0 mIU/ml
250 mIU/ml
250 mIU/ml
250 ìIU/ml
34000 fmol/ml
1000 fmol/ml
Los siguientes datos son únicamente como ilustración y nunca deberán ser usados en cambio del tiempo real de
una curva de calibración.
hCG+ß IRMA
cpm
(%) B/T
Conteo total
293692
0.0 mUI/ml
5.5 mUI/ml
16.6 mUI/ml
54.0 mUI/ml
153.0 mUI/ml
307.0 mUI/ml
585.0 mUI/ml
194
1127
2496
8095
25435
49646
93037
0.07
0.38
0.85
2.76
8.66
16.90
31.68
CAL 2
Valores hCG observados
284 mIU/ml
292 mIU/ml
262 mIU/ml
290 mIU/ml
252 mIU/ml
699 mIU/ml
Esto demuestra que la hCG+ß-IRMA no tiene reacción cruzada con FSH, LH, TSH, αhCG y presenta un 100 %
reacción cruzada con la cadena libre ß de hCG.
Nota: Usando los siguientes pesos moleculares 37.9 kDa (hCG), 23.0 kDa (ßhCG) y 14.9 kDa (αhCG), los
equivalentes molares son:
- hCG: 1000 fmol = 37.9 ng - 325 mIU 1st IRP 75/537
- ßhCG: 1000 fmol = 23.0 ng
- αhCG: 1000 fmol = 14.9 ng
C. Precision
INTRA ENSAYO
INTER ENSAYO
Suero
N
<X> ± S.D.
% CV
Suero
N
<X> ± S.D.
%
(mIU/ml)
(mIU/ml)
CV
A
B
20
20
67.3± 1.2
245.9 ± 3.0
1.8
1.2
D. Exactitud.
PRUEBA DE RECUPERACIÓN
Muestra
hCG agregada (mUI/ml)
Suero 1
50.0
100.0
200.0
400.0
PRUEBA DE DILUCION
Muestra
Dilución
Suero 1
XII. DATOS TIPICOS
Calibrador
B. Especificidad
Las hormonas con reactividad cruzada fueron agregadas a un suero de valor bajo para hCG+ß y a un calibrador de
valor alto (150 mIU/ml). La aparente respuesta hCG+ß fue medida.
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
Las muestras fueron diluidas con un calibrador cero.
C
D
10
10
35.2± 2.2
149.6 ± 12.6
Recuperado (mUI/ml)
52.1
101.7
209.0
417.1
% Recuperación
104
104
102
104
Concentración
(mUI/ml)
563.6
281.8
140.9
70.5
35.2
17.6
8.8
4.4
Concentración
(mUI/ml)
563.6
260.2
126.4
62.6
34.1
18.1
8.7
4.8
Teórica
6.2
8.4
Medida
E. Tiempo de retraso entre el dispensado del último calibrador y la muestra
Como se mostró anteriormente, los resultados de los ensayos permanecen exactos aun cuando una muestra es
dispensada 30 minutos después de que el calibrador ha sido agregado a los tubos cubiertos
Suero 1(mUI/ml)
Suero 2(mUI/ml)
0´
10´
20´
30
31.2
144.1
31.1
142.4
30.9
140.5
31.4
143.5
F. Efecto de gancho
Un efecto de gancho puede ser observado sobre 150000 mIU/ml. Muestras de mujeres embarazadas pueden
producir tales concentraciones altas. Por lo tanto, se recomienda, en casos donde un resultado cuantitativo exacto
de la concentración hCG debería ser obtenido (e.g. seguimiento de embarazos), para probar 3 diluciones como se
indica a continuación
A: No diluidas
B: dilución 17x (25 µl de A + 400 µl calibrador cero)
C: dilución 289x (25 µl de B + 400 µl calibrador cero)
Los exámenes para embarazos deben ser probados sin diluir.
5. GASPARD V.J., REUTER A.M., DEVILLE J.L., VRINDTSGEVAERT Y., BAGSHAWE K.D., FRANCHIMONT P., (1980) Serum
concentration of human chorionic gonadotropin and its alpha and beta subunit II Trophoblastic tumours. Clin. Endocrinol. (Oxf.),
13:219.
6. PIERCE J.G., PARSONS T.F., (1981) Glycoprotein hormones : structure and function. Annu. Rev. Biochem., 50:465.
7. MANCINI G. et al., (1992) hCG, AFP and V E3 pattern in the 14-20th weeks of Down's syndrome pregnancies. Prenatal Diagnost.,
12(7):619-24.
8. WHITEHEAD N. et al., (1993) Elevated material serum human chorionic gonadotropin increases the chance of adverse
pregnancy outcome. Am. J. Obstet. Gynecol., 169(5):1359-60.
XVIII. RESUMEN DEL PROTOCOLO
Conteo total
ml
XIV. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
- Si el resultado obtenido por el control 1 y/o control 2 no están dentro del rango especificado en la etiqueta del
vial, los resultados no pueden ser usados a menos que una explicación satisfactoria para la discrepancia haya sido
dada.
- Si es posible, cada laboratorio puede elaborar sus propios grupos de muestras de control las cuales deben ser
guardadas congeladas en alícuotas. No congele y descongele más de dos veces.
- los criterios de aceptación para la diferencia entre los resultados por duplicado de las muestras deben depender
de las buenas practicas de laboratorio.
XV. INTERVALOS DE REFERENCIA
Los valores provistos en la parte inferior son suministrados como guía únicamente, cada laboratorio debe
establecer su propio rango normal de valores.
Cut off de Embarazo:
El corte para la determinación del embarazo, definido como la concentración aparente tres desviaciones estándar
sobre la cuenta promedio de 97 muestras de mujeres no embarazadas, fue de 4.6 mIU/ml.
Se recomienda reevaluar las muestras entre el cut -off y 10 mIU/ml.
XVI. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
Seguridad
Para uso solo en diagnóstico in Vitro.
Este kit contiene I125 (vida media: 60 días) emisor de rayos X (28 keV) y de rayos γ (35,5 keV) ionizantes.
Este producto radiactivo solo puede ser manejado y utilizado por personas autorizadas; la compra, almacenaje,
uso y cambio de productos radiactivos están sujetos a la legislación del país del usuario. En ningún caso el
producto deberá ser
Suministrado a humanos y animales.
Todo el manejo de producto radiactivo se hará en un área señalizada, diferente de la de paso regular. Deberá de
utilizarse un libro de registros de productos radiactivos utilizados. El material de laboratorio, vidrio que podría estar
contaminado radiactivamente deberá de descontaminarse para evitar la contaminación con otros isótopos.
Cualquier derramamiento radiactivo deberá ser limpiado de inmediato de acuerdo con los procedimientos de
seguridad. Los desperdicios radiactivos deberán ser almacenados de acuerdo con las regulaciones y normativas
vigentes de la legislación a la cual pertenezca el laboratorio. El ajustarse a las normas básicas de seguridad
radiológica facilita una protección adecuada.
Los componentes de sangre humana utilizados en este kit han sido testados por métodos aprobados por la CEE
y/ó la FDA dando negativo a HBsAg, anti-HCV, anti-HIV-1 y 2. No se conoce ningún método que asegure que los
derivados de la sangre humana no transmitan hepatitis, SIDA ó otras infecciones. Por lo tanto el manejo de los
reactivos y muestras se hará de acuerdo con los procedimientos de seguridad locales.
Todos los productos animales y derivados han sido obtenidos a partir de animales sanos. Componentes bovinos
originales de países donde BSE no ha sido informado. Sin embargo, los componentes conteniendo substancias
animales deberán ser considerados como potencialmente infecciosos.
Evitar cualquier contacto de los reactivos con la piel (azida sódica como conservante). La azida en este kit puede
reaccionar con el plomo y cobre de las cañerías y producir azidas metálicas altamente explosivas. Durante el
proceso de lavado, hacer circular mucha cantidad de agua por el sumidero para evitar el almacenamiento de la
azida.
No fumar, beber, comer ó utilizar cosméticos en el área de trabajo. No pipetear con la boca. Utilizar ropa de
protección y guantes.
XVII. BIBLIOGRAFIA
1. BRAUNSTEIN G.D., RASOR J., ADLER D., DANZER H., WADE H.E., (1976) Serum chorionic gonadotropin levels throughout
normal pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126:678.
2. CHEN F., SETSUKO G., YOSHIHITO F., YUTAKA T., (1987) Radioimmunoassay of the serum free ß-subunit of human chorionic
gonadotropin in trophoblastic disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 64:313.
3. DAWOOD M.Y., SASCENA B.B., LANDESMAN R., (1977) Human chorionic gonadotropin and its subunit in hydatidiform mole and
choriocarcinoma. Obstet. Gynecol., 50:172.
4. HAY D.L., (1982) Chorionic gonadotropin. Clin. Biochem., 3:35.
CALIBRADORES
ml
Calibradores (0-5)
Muestra,
Rastreador
0.05
Incubación
30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 400rpm.
Separación
Solución de lavado
Separación
Solución de lavado
Separación
-
Conteo
Conteo de los tubos por 60 segundos
BioSource Catalogo Nr :
KIP0981 KIP0984
0.05
0.05
MUESTRA(S)
ml
0.05
0.05
Aspirar (o decantar)
2.0
Aspirar (o decantar)
2.0
Aspirar (o decantar)
Numero P.I. -:
1700467/es
Fecha de revisión: 2008-02-19
Revisión nr :
060324/1