LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
POR LABORATORIO DE
ITS
InDRE – RNLSP
2012
SECRETARIA DE SALUD
SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG
SECRETARIO DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ
SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA
QC. ISRAEL PARRA ORTEGA
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE PRUEBAS
QFB. ALICIA LUNA VÁZQUEZ (INDRE)
QFB. MARICELA GORDILLO MARÍN (UIFL)
JEFES DE LABORATORIO DE ITS Y UIFL
ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA DIAGNOSTICO DE VIH/ITS
La RNLSP exclusivamente para Infecciones de transmisión sexual no existe por lo
que siempre ha formado parte de la Red de VIH-ITS la cual inicia sus actividades
desde mediados de la década de los ochentas, como consecuencia del
descubrimiento del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Inicialmente esta
Red se dedica al diagnóstico de la infección por VIH en personas que acuden a
solicitar la detección de anticuerpos. Posteriormente con los avances sobre la
epidemiología de la enfermedad, en 1989 se divide en tres redes diferentes: Red
de donadores, en la cual participan los Centros Estatales de la Transfusión
Sanguínea; Red de Vigilancia Epidemiológica, conformada por los Laboratorios
Estatales de salud Pública (LESP) y el Programa de VIH y la Red de Población
Abierta, en la cual se logra la participación de centros de salud y algunos
hospitales ubicados en todo el país. Todas estas redes fueron coordinadas por el
InDRE hasta 1994 cuando el control de la Red de Donadores es transferido al
Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, al dejar de ser la disposición de
componentes sanguíneos del ámbito de competencia del InDRE.
La Red de Población Abierta estaba financiada en su totalidad por el InDRE, quién
era responsable del envío de reactivos para el diagnóstico de VIH a los LESP, que
tenían como función, la coordinación estatal con los organizamos responsables de
la utilización del reactivo. Esta Red funciono de manera regular hasta el año 2000
en el cual por situación presupuestal, se decide suspender el funcionamiento de la
misma.
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE VIH/ITS
La Red para la Vigilancia Epidemiológica continua funcionando con 31 LESP y el
InDRE como institución coordinadora, normativa y rectora. Está Red realiza
trabajo en conjunto para el diagnóstico de la infección en algunos laboratorios con
base en las atribuciones de cada LESP, la correcta identificación de casos difíciles
o cuando se requiere de pruebas suplementarias (referencia) y en el control de
calidad de muestras, reactivos y analistas involucrados en este trabajo.
El único estado que no participa es el Distrito Federal por no contar con laboratorio.
SITUACION ACTUAL DE LA RED
Se realizo un análisis de la capacidad diagnóstica y de la infraestructura de los
miembros de la Red, mediante el envío de una encuesta, lo que permitió identificar
la capacidad instalada en cada LESP.
El 100% de los laboratorios tienen la capacidad de realizar diagnostico presuntivo
y confirmatorio para VIH y el 77% realiza el diagnostico de ITS.
La capacidad para la realización de pruebas de seguimiento en personas que
viven con VIH ha aumentado notablemente en los últimos años.
Actualmente la
tercera parte de los laboratorios de la red tienen la capacidad instalada para la
realización de pruebas de seguimiento.
Las metodologías utilizadas en los Laboratorios de la Red son heterogéneas, sin
embargo el 93.5% de ellos utilizan reactivos evaluados por el InDRE, lo que nos
permite conocer el desempeño y el funcionamiento de los mismos y la trazabilidad
de los resultados.
El trabajo desarrollado por la red nos ha permitido identificar las siguientes
fortalezas y debilidades:
Fortalezas:

Capacidad diagnostica para VIH en el 100% de los laboratorios de la red.

Control de calidad mediante el envío de paneles para la evaluación del
desempeño.

Concordancias superiores al 90%
en 26 de los 31 laboratorios que
conforman la red.

Existencia de normas y guías nacionales e internacionales que favorecen la
homogeneidad en la aplicación de los métodos.

Capacidad diagnostica para pruebas de seguimiento en el 32% de los
laboratorios de la RED.

Muy buena calidad de la mayoría de los reactivos existentes en el mercado,
utilizados por la red para el diagnostico y seguimiento de la infección por el
VIH.

Capacitación y actualización continua del personal que realiza el
diagnostico de VIH/ITS.

Curso de actualización en VIH/ITS avalado por la Facultad de Medicina,
evaluado con calificación de 9.5 por la UNAM.

Visitas de auditoría y supervisión a todos los miembros de la red de
laboratorios.

Participación del InDRE y otros miembros de la Red en programas
internacionales para la evaluación del desempeño.
Debilidades:

Trabajo desvinculado de la Red y el Programa para la Prevención y Control
de la Infección por el VIH (CENSIDA).

Falta de coordinación con las áreas de vigilancia epidemiológica estatales y
federales.

Desvinculación entre la Red y las demás instituciones del Sector Salud.

Procesos de adquisición de materiales y reactivos prolongados y
complicados.

Necesidad de inclusión de reactivos en el catalogo de auxiliares de
diagnostico del cuadro básico.

Realización de algunas pruebas de seguimiento en laboratorios particulares
con métodos y procedimientos de desempeño desconocido.

Duplicación de funciones entre las instituciones que realizan diagnostico y
seguimiento de pacientes.

Falta de lineamientos nacionales referentes al uso de reactivos para
diagnostico y seguimiento de pacientes.

Falta de vinculación entre los bancos de sangre, la red y los sistemas de
vigilancia epidemiológica.

Falta de oportunidad en los resultados.

Falta de control de calidad externo para las pruebas de seguimiento.
FUNCIONES Y RESPONSABILIDADES DE LA RED
Las funciones de la red de laboratorios de diagnóstico deben responder a los
propósitos de la vigilancia epidemiológica de las enfermedades infecciosas y otras
de interés en salud pública, según se disponga en el Consejo Nacional de
Vigilancia Epidemiológica, pero en términos generales se considerarán los
siguientes:

Implantar y mantener un sistema de intercambio de información.

Promover acuerdos bilaterales o multilaterales entre las instituciones
participantes para hacer efectiva la prestación de los servicios y la
ejecución de programas y proyectos de interés común.

Identificar, coordinar y desarrollar actividades conducentes a la
armonización de métodos de diagnóstico.

Formular y ejecutar un programa para la preparación, mantenimiento
e intercambio de cepas, reactivos y materiales de referencia.

Organizar y dictar cursos, seminarios y talleres sobre temas de
interés común y de trascendencia regional.

Llevar a cabo trabajos de investigación colaborativos, especialmente
de tipo aplicado sobre temas de interés de la red.

Participar en el programa de acreditación de laboratorios y
evaluación periódica del desempeño con el fin de orientar a los
participantes en la realización de sus actividades.

Facilitar el intercambio de expertos para apoyar proyectos de interés
nacional o para proveer cooperación técnica a otros países.

Diseñar, organizar y participar en un programa de control externo de
calidad de laboratorios tendientes a asegurar la confiabilidad del
producto de la actividad diagnóstica.
FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL (InDRE)
Funciones generales
El InDRE desde sus inicios ha promovido el trabajo en red y entre sus funciones
se encuentran:

Establecer la normatividad, tendiente a la estandarización de
las técnicas de diagnóstico en uso ya la comparación de los
resultados.

Proporcionar supervisión y asesoría a los niveles intermedios
o locales, según el grado de desarrollo del sistema.

Llevar a cabo la referencia nacional para el diagnóstico de
casos especiales o de confirmación.

Acreditar, evaluar y supervisar a los laboratorios de la red.

Capacitar personal.

Desarrollar investigación aplicada.

Evaluar nuevas tecnologías con miras a mejorar la calidad del
diagnóstico

Producir patrones, reactivos y productos biológicos de
referencia según las necesidades de salud del país.

Controlar la calidad de medios y reactivos para el diagnóstico.

Publicar y actualizar un directorio de las instituciones
participantes.

Coordinar sus actividades con las de otros laboratorios de
referencia nacionales o del extranjero.
Funciones específicas para el diagnóstico de Sífilis.
1. Coordinación de la Red Nacional de Laboratorios
para la vigilancia
epidemiológica de Sífilis.
2. Realizar el diagnóstico de Sífilis por la técnica de USR y FTA-ABS
laboratorios que no cuenten con infraestructura, reactivos y/o insumos.
3. Realizar estos métodos como referencia a las muestras que envíen con
resultados previos que deseen sean confirmados.
4. Procesar todas las muestras enviadas al InDRE para Control de Calidad por
el método de USR para Sífilis.
5. Capacitar a los LESP e Instituciones del Sector Salud que lo requieran, en
las diferentes técnicas utilizadas en el diagnóstico de Sífilis de acuerdo a su
nivel dentro de la Red.
6. Capacitar a todo el personal que solicite entrenamiento teórico- práctico en
los métodos empleados para el diagnóstico de Sífilis.
7. Realizar la captura y emisión de resultados del laboratorio.
8. Realizar evaluación del desempeño para Sífilis a través del envío de paneles
cuatrimestralmente.
9. Participar en el curso teórico práctico anual del Departamento de
Enfermedades Emergentes y Urgencias.
10. Participar en Pruebas de Proficiencia para sífilis con el CDC.
11. Coordinación de la Red Nacional de Laboratorios
para la vigilancia
epidemiológica de Sífilis.
12. Realizar el diagnóstico de Sífilis por la técnica de USR y FTA-ABS
laboratorios que no cuenten con infraestructura, reactivos y/o insumos.
13. Realizar estos métodos como referencia a las muestras que envíen con
resultados previos que deseen sean confirmados.
14. Procesar todas las muestras enviadas al InDRE para Control de Calidad por
el método de USR para Sífilis.
15. Capacitar a los LESP e Instituciones del Sector Salud que lo requieran, en
las diferentes técnicas utilizadas en el diagnóstico de Sífilis de acuerdo a su
nivel dentro de la Red.
16. Capacitar a todo el personal que solicite entrenamiento teórico- práctico en
los métodos empleados para el diagnóstico de Sífilis.
17. Realizar la captura y emisión de resultados del laboratorio.
18. Realizar evaluación del desempeño para Sífilis a través del envío de paneles
cuatrimestralmente.
19. Participar en el curso teórico práctico anual del Departamento de
Enfermedades Emergentes y Urgencias.
20. Participar en Pruebas de Proficiencia para sífilis con el CDC.
Funciones específicas para la producción, evaluación y suministros de
reactivos y equipos diagnósticos.
Suministrar a la RNLSP de reactivos y equipos diagnósticos altamente
especializados, sean elaborados por el InDRE o adquiridos de otras fuentes,
previa evaluación de su eficacia.
Mantener actualizadas las técnicas de diagnóstico de las enfermedades
infecciosas y unificar criterios y conceptos de análisis e interpretación
diagnósticos.
Mantener en la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública un programa
permanente de actualización en el manejo, control e interpretación de metodología
de laboratorio.
ANTECEDENTES HISTÓRICOS DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES
EMERGENTES Y URGENCIAS/ LABORATORIO DE ITS
El Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) se crea en
1985 dentro del entonces Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales
(ISET) como respuesta del instituto y la Secretaria de Salud, a la necesidad de
contar con un laboratorio dedicado exclusivamente al diagnóstico y control de las
enfermedades sexualmente transmitidas. Inicialmente el laboratorio solo realizaba
el diagnóstico para algunas de las llamadas ETS clásicas como son sífilis y
gonorrea.
En 1987 debido a la epidemia cada vez más importante causada por
la infección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se incluyen los
métodos de diagnóstico presuntivo y confirmatorio para este virus.
Posteriormente en 1997, el laboratorio de ETS del Instituto Nacional de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos se convierte en el Departamento de VIH
y Otras ITS, conformado por 4 laboratorios (VIH, ITS bacterianas, ITS virales y
Hepatitis virales ) establecidos como laboratorios nacionales de referencia que
realizan la confirmación de los diagnósticos realizados por los laboratorios
estatales de salud publica, laboratorios estatales pertenecientes a hospitales o
clínicas,
servicios coordinados de salud, centros estatales de la transfusión
sanguínea, centros de salud en el D.F. y otras dependencias (IMSS, ISSSTE,
Ejército, Marina, PEMEX, etc.).
Para principios de 1999 se anexan los laboratorios de Carga viral para VIH,
Protozoosis y un laboratorio de nivel de bioseguridad 3 al Departamento.
En el 2004 con base a las necesidades epidemiológicas del país, el área cambia
de nombre y se convierte en el Departamento de Enfermedades Emergentes, con
la incorporación del laboratorio de virus hemorrágicos, el laboratorio de apoyo a
urgencias y desastres y la coordinación de los laboratorios de nivel 3 de
bioseguridad en apoyo a la liberación intencional de agentes biológicos.
DIAGNOSTICO DE SIFILIS
Treponema pallidum es el agente etiológico de la sífilis, enfermedad de
transmisión sexual descrita desde la antigüedad y cuya importancia ha sido
reconsiderada a raíz de la descripción de la asociación con la infección por el VIH.
Esta bacteria pertenece al orden de las Spirochaetales y a la familia
Spirochaetaceae. Presenta una movilidad característica de tirabuzón, con
desplazamiento muy rápido sobre el campo microscópico de observación. Varias
propiedades de las espiroquetas hacen difícil su detección y recuperación en el
laboratorio, por ejemplo capta los colorantes pobremente dificultándose su
observación por éstos procedimientos, por lo que su observación debe hacerse
siempre
en
microscopía
de
campo
oscuro
o
por tinción fluorescente,
procedimientos con los cuales se visualiza el microorganismo con todas sus
características. Además el microorganismo no se ha podido cultivar en ninguno de
los procedimientos ensayados. El tioglicolato puede conservarle en forma viable
hasta por un máximo de 22 días, pero aquí no se multiplica, simplemente se
conserva.
Existen varias cepas de Treponema que han sido aisladas y cultivadas en
anaerobiosis, sin embargo ninguna es patógena ni corresponden a T. pallidum
(cepas Nichols, Noguchi, Kazan y cepa Reiter).
Con respecto a su diagnóstico, conviene ante todo insistir en que no hay prueba
de laboratorio que sustituya a la historia clínica y al examen físico, por tanto el
estudio de todo paciente sospechoso de sífilis debe de iniciarse con una buena
historia y un examen físico completo.
La fase primaria y secundaria de la enfermedad, así como las lesiones de la sífilis
congénita recientes son ricas en T. pallidum y por tanto su investigación directa es
un auxiliar importante para confirmar el diagnóstico. Esto se realiza por la técnica
de campo obscuro que es de utilidad, sobre todo en aquellos casos en que los
niveles de anticuerpos no son detectables (principalmente sífilis primaria).
A pesar de lo específico de este diagnóstico, las pruebas más utilizadas en la
actualidad son los exámenes indirectos (pruebas serológicas), las cuales detectan
anticuerpos en un tiempo promedio de 4 semanas después de ocurrida la
infección.
Las pruebas serológicas útiles en el diagnóstico de la sífilis se pueden dividir en
dos grandes grupos:
1. Las que investigan los anticuerpos heterólogos y que utilizan antígeno de
origen no treponémico Ejem: USR,VDRL, RPR.
2. Las que investigan anticuerpos específicos y que utilizan antígenos de orígen
treponémico. Ejem: FTA-Abs, TPHA
ALGORITMOS
ALGORITMO MAESTRO (DIAGNÓSTICO)PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA Treponema pallidum EN SÍFILIS ADQUIRIDA
Muestra*
Suero o
Plasma
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Estándar de calidad
en servicio: 3 días
Estándar de calidad
en servicio: 5 días
Reactivo
No reactivo
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Reportar
Negativo
Si se solicita
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
* Las muestras recibidas por el área son de 32 Estados de la RNLSP y otras instituciones pertenecientes a la Secretaria de Salud
así como también del IMSS, ISSSTE, DDF, particulares, etc.
Ref: Informe anual de pruebas del InDRE
Bitácora de recepción de muestras del laboratorio.
ALGORITMO MAESTRO(DIAGNÓSTICO)PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA Treponema pallidum EN SÍFILIS CONGÉNITA
Muestra*
Suero o
Plasma
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Reactivo
No reactivo
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Estándar de calidad
en servicio: 5 días
Prueba treponémica
FTA-ABS IgM
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
Reportar
Positivo
IgM
Reportar
Negativo
IgM
* Las muestras recibidas por el área son de 32 Estados de la RNLSP y otras instituciones pertenecientes a la Secretaria de Salud
así como también del IMSS, ISSSTE, DDF, particulares, etc.
Ref: Informe anual de pruebas del InDRE
Bitácora de recepción de muestras del laboratorio.
ALGORITMO MAESTRO( REFERENCIA) PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA Treponema pallidum EN SÍFILIS ADQUIRIDA
Muestra* de suero o plasma
y referencia documentada
del resultado obtenido
previamente
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Estándar de calidad
en servicio: 3 días
Estándar de calidad
en servicio: 5 días
Reactivo
No reactivo
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Positivo
Negativo
Positivo
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
Reportar
Positivo
IgG
Negativo
Reportar
Negativo
IgG
* Las muestras recibidas por el área son de 32 Estados de la RNLSP y otras instituciones pertenecientes a la Secretaria de Salud
así como también del IMSS, ISSSTE, DDF, particulares, etc.
Ref: Informe anual de pruebas del InDRE
Bitácora de recepción de muestras del laboratorio.
ALGORITMO MAESTRO (REFERENCIA) PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Treponema pallidum EN SÍFILIS CONGÉNITA
Muestra* de
suero o plasma de recién
nacido y referencia
documentada del resultado
obtenido previamente
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Reactivo
No reactivo
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Estándar de calidad
en servicio: 5 días
Prueba treponémica
FTA-ABS IgM
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
Reportar
Positivo
IgM
Reportar
Negativo
IgM
* Las muestras recibidas por el área son de 32 Estados de la RNLSP y otras instituciones pertenecientes a la Secretaria de Salud
así como también del IMSS, ISSSTE, DDF, particulares, etc.
Ref: Informe anual de pruebas del InDRE
Bitácora de recepción de muestras del laboratorio.
ALGORITMO MAESTRO (CONTROL DE CALIDAD)PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA Treponema pallidum A LA RNLSP
Muestras*
de la RNLSP
(sueros)
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Estándar de calidad
en servicio: 3 días
Reactivo
No reactivo
Reportar
Positivo
Reportar
Negativo
* Las muestras recibidas por el área son de 32 Estados de la RNLSP
Ref: Informe anual de pruebas del InDRE
Bitácora de recepción de muestras del laboratorio.
ALGORITMO MAESTRO PARA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE Treponema pallidum DEL InDRE A LA RNLSP
Muestras del Banco de
Sueros para diagnóstico de
Treponema pallidum
Selección de
muestras positivas a
pruebas no
treponémicas y
treponémicas.
Selección de
muestras negativas
a pruebas no
treponémicas y
treponémicas.
Elaboración de
alícuotas
Preparación y
envío a la
RNLSP
Análisis de
concordancia
Estándar de calidad
en servicio: 2 envíos
ALGORITMO MAESTRO PARA EL PANEL DE PROFICIENCIA DE Treponema pallidum DEL CDC AL InDRE
Panel de
proficiencia para
Treponema
pallidum enviado
por el CDC
Pruebas no treponemicas
VDRL, RPR, USR
Reactivo
No reactivo
Reportar
positivo
Reportar
negativo
Prueba treponémica
FTA-ABS IgG
Estándar de calidad
en servicio: 5 días
Positivo
Negativo
Reportar
Positivo
IgG
Reportar
Negativo
IgG
TOMA Y MANEJO DE MUESTRAS
La muestra de suero o plasma a utilizar se obtendrá de acuerdo a las indicaciones del
Manual de Toma, Manejo y Envío de Muestras del InDRE. Para la obtención de suero
puede emplearse el tubo de tapón rojo con gel y para la obtención de plasma el tubo de
tapón morado con anticoagulante (EDTA); sin embargo estas muestras se pueden recibir
debidamente separadas en tubos de plástico, criotubos, viales, etc. correctamente
etiquetadas.
METODO DE DETECCION DE ANTICUERPOS REAGINICOS CONTRA
TREPONEMA PALLIDUM (USR)
1. Equipos
Agitador orbital Marca H Gemmy Industrial, Modelo VRN-210 (No. de Serie 221440) con
velocidad ajustable, fijado a 180 r.p.m.
Micropipeta automática Marca Finnpipette vol. variable 20-200 ml
Micropipeta automática Marca Finnpipette vol. variable 5-40 ml
Microscopio Optico Marca Olympus, Modelo BX41TF (No. de Serie 1L0039)
Balanza semianalítica digital, Marca Denver Instrument Company, Modelo TR-203 (No. de
serie T0115271)
Mezclador Vortex
Refrigerador vertical para almacenamiento de muestras biológicas y reactivos (2-8°C)
Ultracongelador (-70°C) para conservación del banco de muestras.
2. Materiales
Placas de vidrio,fondo plano con arillo de cerámica de 18 mm. de diámetro.
Espátula.
Matraz volumétrico de 100 ml.
Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Probeta de 100 ml.
Puntas amarillas para micropipetas.
Bata.
Guantes de látex.
Cubrebocas.
Lentes de seguridad.
Bote para desechos punzocortantes.
3. Reactivos y Materiales biológicos
Solución salina isotónica: 0.9 NaCl%. Pesar 0.9 g. de NaCl y disolverlo perfectamente en
100 ml. de Agua destilada.
Immutrep USR PLUS
Antigen, Marca Omega Diagnostics, frasco con 10 ml.
Ref.OD111A; incluye
Suero Control Positivo el cual contiene anticuerpos contra Treponema pallidum, frasco
con 0.5 ml.
Suero Control Interno Negativo.
Suero Control Positivo de un solo analito: Accurrun Anti-Treponema (syphilis).Marca BBI
Diagnostics, No. de catálogo A-155-5010.
4. Pasos del Método
4.1 Método Cualitativo sin Diluciones
4.1.1 Las muestras y los reactivos deben de estar a temperatura ambiente (25-30°C)
antes de iniciar la prueba.
4.1.2 Elaborar mapa de colocación de muestras considerando también los pozos para
los controles(Fig.1)
4.1.3 Dispensar una gota (50L.) de suero y controles homogeneizados en los pozos
correspondientes de la placa de acuerdo al mapa.
4.1.4 Añadir 1 gota (22 L.) de antígeno previamente homogeneizado (no es preciso
mezclar los
dos componentes).
4.1.5 Rotar la placa a 180 r.p.m. durante 4 minutos.
4.1.6 Inmediatamente después observar el resultado en el microscopio (aumento 100x).
4.1.7 Registrar los resultados como:
-No reactivo (ausencia de floculación)
-Reactivo (agregados finos, medianos o grandes)
4.1.8 Realizar el método cualitativo con diluciones a las muestras reactivas.
SS
F
M
1
CN
CP
M
2
M3
Fig.1
4.2 Método Cualitativo con Diluciones
4.2.1
Colocar 50L de solución salina 0.9% en 5 pozos de la placa.
CP
AC
SSF: Solución Salina Fisiológica
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
CP AC: Control Positivo ACCURRUN
M: Muestra
M4
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
Adicionar 50L de la muestra a evaluar en el primer pozo, mezclar con la
solución salina y retirar 50L de esta dilución con la pipeta para mezclarla con la
solución salina del siguiente pozo; repetir hasta el último pozo con solución salina.
De esta forma las diluciones de la muestra son 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32.(Fig.2)
Añadir 22l de antígeno previamente homogenizado a la muestra. (no es
necesario mezclar los dos componentes).
Agite la placa por 4 minutos a 180 r.p.m.
Inmediatamente después observar el resultado en el microscopio (aumento 100x).
Si en la última dilución existe floculación, se repetirá el ensayo realizando más
diluciones hasta obtener la dilución donde se observe la ausencia de floculación.
Se reportará la última dilución en la que se observó floculación.
50l
SUERO
POSITIVO
50l
Dilución
1:2
50l
Dilución
1:4
50l
Dilución
1:8
50
l
50
l
50
l
50
l
SSF
SSF
SSF
SSF
50
l
50
l
50
l
50
l
SSF
SSF
SSF
SSF
50l
Dilución
1:16
Fig.2
INTERPRETACIÓN POR EL LABORATORIO
Método Cualitativo sin Diluciones
Agregados finos, medianos o grandes
Reactivo
No se observan agregados
No Reactivo
Método Cualitativo con Diluciones
El título que se reporta es la máxima dilución que produce floculación (Fig.3)
1:2
POS
1:25
6
NEG
1:12
8
NEG
1:16
POS
1:8
POS
1:4
POS
1:64
NEG
1:32
POS
Fig.3
Prueba cualitativa de una muestra título 1:32
METODO DE DETECCION DE ANTICUERPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM
POR INMUNOFLUORESCENCIA (FTA-ABS)
Reactivos:
-
-
Antígeno. Treponema pallidum cepa Nichols. Suspensión
liofilizada de T. pallidum cultivado in vivo en testículos de conejo.
Sorbente. Extracto liofilizado de treponema reiter inactivado por
autoclave.
Conjugado anti-inmunoglobulina M humana - fluoresceína.
Suero testigo positivo. Suero extraído de pacientes con diagnóstico
confirmado de sífilis. (No contiene anticuerpos tipo IgM).
Suero testigo negativo. Suero proveniente de pacientes sanos.
Suero testigo inespecífico. Suero humano liofilizado que muestra
una reacción positiva no específica en la prueba de FTA-Abs.
Solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH = 7.2 a 7.4.
Medio de absorción para factor reumatoide (RF). Preparación
liofilizada de anti-anticuerpos humanos para la detección de IgM.
Solución de montaje PBS-glicerol
Material y Equipo:
-
Microscopio de epifluorescencia
Portaobjetos para inmunofluorescencia cubiertos con teflón de 8
pozos.
Cubreobjetos
Pipetas automáticas de 20 y 50 µl
Trabajos preliminares:
1.-
2.-
3.-
4.-
Reconstitución del antígeno.
a) Reconstituir la suspensión liofilizada del antígeno con 1 ml de
agua destilada.
b) Dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
c) Homogeneizar la suspensión por pipeteo 10 veces.
d) Colocar 10 µl de la suspensión en cada pozo y secar en una
estufa a 37°C durante 3 horas.
e) Fijar la preparación con acetona durante 10 minutos.
f) Almacenar a -70°C hasta su uso.
Lavar los portaobjetos con el antígeno fijado, en una cámara de
Koplik con una solución de PBS por 10 minutos, cambiar el PBS y
lavar nuevamente por 5 minutos. Finalmente enjuagar con agua
destilada.
Descomplementar los sueros, incubando a 56°C durante 30 minutos,
o calentar a 56°C por 10 minutos cuando han pasado más de 4 horas
de haberse descomplementado.
Permitir que los sueros alcancen la temperatura ambiente para ser
procesados.
Procedimiento:
1.2.3.-
Diluír lo sueros 1 : 5 con el sorbente (10 µl de suero + 40 µl de
sorbente) y mezclar.
Diluír simultáneamente y de la misma manera los controles positivo,
negativo e inespecífico.
Pasar 50 µl de la mezcla anterior a un criotubo con 50 µl de medio de
absorción para factor reumatoide RF. Incubar a 37°C para eliminar
los anticuerpos de grupo no específicos contra
Treponema y absorber el factor reumatoide.
4.-
Colocar 10 µl del suero problema diluído a un pozo del portaobjetos
con el antígeno fijado, lavado y secado previamente. Hacer lo
mismo para cada uno de los sueros control.
5.Incubar a 37°C durante 30 minutos en cámara húmeda.
6.- Realizar dos lavados, con PBS durante 10 y 5 minutos
respectivamente. Se enjuagan en un baño con agua destilada y se
le permite que secar al aire.
7.Adicionar 10 µl del conjugado anti-IgM previamente titulado(diluído 1
50) a cada pozo. (Ejemplo: 10 µl de conjugado + 490 µl de PBS).
8.Incubar a 37°C durante 30 minutos en cámara húmeda.
9.Lavar como se describe en el punto 6.
10.- Agregar 2 gotas de la solución de montaje y colocar un cubreobjetos.
11.- Realizar la lectura con objetivo de inmersión 100X.
Resultados:
1.-
2.3.-
Verificar la ausencia de fluorescencia en los testigos negativo e
inespecífico. Es posible observar únicamente las siluetas de los
treponemas.
Reacción negativa. No se observa fluorescencia o existe un ligero
tono verde en los treponemas observables.
Un resultado positivo se presenta cuando se observan los
treponemas fijados en el portaobjetos con la fluorescencia
característica (brillo verde manzana). La intensidad de la
fluorescencia observada se reporta de 1 a 4 cruces.
Departamento de Enfermedades Emergentes y Urgencias
LINEAMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO
DE
Neisseria gonorrhoeae
2012
Introducción
El género Neisseria pertenece a la familia Neisseriaceae, en donde existen dos
especies de importancia, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.
N. meningitidis (meningococo) figura entre los 3 principales agentes causales de
meningitis infantil. Esta afección es muy grave debido a su alta tasa de mortalidad
entre los niños, y a la elevada frecuencia con que los pacientes que salvan la vida
llegan a presentar consecuencias neurológicas muy serias.
Neisseria gonorrhoeae es el agente causante de blenorragia o gonorrea,
enfermedad muy antigua descrita. Fue observada en 1879 por Albert Neisser en
exudados purulentos de uretra de un paciente que presentaba uretritis gonocócica
y cultivada por primera vez en 1882 por Leistikow.
La gonorrea es, generalmente, una infección de transmisión sexual (ITS). En
varones, el cuadro clínico es sintomático en 75,0% a 85,0%, lo contrario sucede
en mujeres, donde la infección en la mayoría de casos es asintomática.
Las infecciones más frecuentes causadas por el gonococo son: uretritis, cervicitis,
proctitis, salpingitis, faringitis, vulvovaginitis en niñas, y oftalmía del recién nacido y
adultos, entre otras. Es poco frecuente la infección sistémica y la artritis
gonocócica.
El éxito del aislamiento primario del gonococo depende de una adecuada
obtención de la muestra, contar con personal debidamente capacitado y de la
calidad de los medios de cultivo; además, que la identificación confirmatoria del
mismo garantiza el diagnóstico clínico y orienta el tratamiento del paciente
infectado.
Existen
diversas
pruebas
de
laboratorio
para
confirmar
el
diagnóstico
bacteriológico del gonococo: pruebas bioquímicas, serológicas con anticuerpo
monoconal, hibridación del ácido desoxiribonucleico (ADN), amplificación del ADN,
siendo el más común el método bioquímico de utilización de carbohidratación en
base CTA, conocido como el método “convencional” o método del crecimiento.
Objetivo
Establecer los procedimientos técnicos para realizar el diagnóstico bacteriológico
de la infección causada por N. gonorrhoeae en la población.
Medidas de Bioseguridad
Agente
Sensible a los desinfectantes como hipoclorito de sodio al 1%, etanol al 70%,
glutaraldehído, yodo y formaldehído.
Sensible al calor húmedo a presión (121°C por 15 minutos) y al calor seco (160°C170°C por una hora).
Se ha reportado que puede sobrevivir hasta 48 horas en vidrio, papel hasta 3 días,
plástico por 24 horas y asientos de baño por varias horas.
Debido a la producción de betalactamasas de origen plasmídico y/o cromosomal,
se ha incrementado el número de cepas resistentes a penicilina.
Riesgos en el laboratorio
Infecciones adquiridas en el laboratorio: Se han reportado 4 casos en Estados
Unidos.
Muestras en las que puede estar presente: exudados de conjuntiva, uretra o cervix
uterino, líquido sinovial, orina, heces y líquido cefaloraquídeo.
Riesgos primarios: inoculación parenteral accidental, contacto directo o indirecto
de las membranas mucosas con material clínico infeccioso, etc.
Precauciones
Contención: Nivel 2 de bioseguridad para toda actividad que envuelva material
clínico y cultivos.
Ropa de protección: Usar bata de laboratorio y guantes cuando exista posibilidad
de contacto de la piel con el material infeccioso.
Obtención de la muestra
Las muestras deberán obtenerse antes que el paciente inicie el tratamiento con
antimicrobianos. Para cada zona de muestreo (uretra, cervix, nasofaringe, ocultar,
etc.) se aplicará un procedimiento específico, debiendo recolectarse la muestra,
preferentemente con hisopos de baja toxicidad como dacrón o alginato de calcio.
No se deben utilizar hisopos de algodón, ya que son tóxicos para la bacteria.
Transporte de la muestra
Las muestras (hisopados clínicos, biopsias, etc.) deben llegar al laboratorio en
buenas condiciones, de tal manera que el gonococo se mantenga viable y pueda
ser aislado.
Si se trata de un aislamiento sospechoso de ser gonococo y es enviado al
Laboratorio Referencial para el respectivo diagnóstico confirmatorio, el remitente
debe asegurarse que el cultivo esté viable y libre de contaminantes, porque la
presencia de éstos en el medio de transporte puede ocasionar la no viabilidad de
la bacteria.
Las muestras o cultivos sospechosos deben ser transportados en medios
adecuados, dependiendo del tiempo que demorará para llegar a su destino. Estos
se clasifican en:
1) Medios no Nutritivos, como el Amies con carbón, el cual es adecuado cuando la
muestra va a llegar al laboratorio dentro de las seis horas de su obtención. El
tiempo es muy importante para las muestras procedentes de portadores
asintomáticos o de pacientes tratados con antimicrobianos, las que podrían
presentar escasos gonococos viables.
a. Procedimiento:
- Depositar la muestra junto con el hisopo (utilizar hisopo sintético).
- Introducir el hisopo al tubo, previamente rotulado, que contiene el medio de
transporte.
- Romper el mango sobrante y cerrar bien la tapa del tubo del hisopo.
2) Medios Nutritivos o de Crecimiento, tal como el Transgrow o Placas JEMBEC o
en medio de crioconservación, cuando las muestras no van a ser sembradas
dentro de las seis horas. El tiempo óptimo de transporte en éstos medios es de 24
a 28 horas.
a. Procedimiento
- Sembrar la muestra sobre la superficie del medio de cultivo haciendo estrías.
- Hacer una incubación previa antes del transporte, a 35°C-37°C durante 18-24
horas.
PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Fundamento
El agente etiológico de la gonorrea es Neisseria gonorrhoeae, bacteria Gram
negativa, que tiene forma de coco a la observación microscópica, se agrupan
generalmente en pares, dando la apariencia de riñones o granos de café, no forma
esporas, ni presenta flagelos.
Presenta pili y microcápsulas, metabolismo
oxidativo e utiliza la glucosa sin
producción de gas. Es una bacteria muy exigente, que desarrolla en medios de
cultivos artificiales, con vitaminas, hierro y ciertos aminoácidos.
Asimismo,
requiere de humedad 50-70%, anhídrido carbónico 7-10% y temperatura 35°C37ºC.
Para el diagnóstico de gonorrea se considera al cultivo como el estándar de oro en
la demostración del agente etiológico, pero es importante tomar en cuenta que en
las infecciones agudas, el diagnóstico presuntivo basado en la presencia de
diplococos gramnegativos intracelulares en frotis de exudados genitales, identifica
el 95% de las infecciones en el hombre, pero solo del 50 al 65% de las infecciones
en mujeres; motivo por el cual, es indispensable el aislamiento de la bacteria,
aunado también a la presencia, cada vez más frecuente, de cepas productoras de
beta lactamasa; aunque también existen técnicas basadas en el hallazgo de
antígenos gonocócicos, que pretenden sustituir al cultivo (coaglutinación y ELISA).
Método para el cultivo e identificación de Neisseria gonorrhoeae
Material y Equipo

Cajas petri 15 x 100 mm

Tubos de ensayo de vidrio clase A (borosillicato) 10 x 75 mm

Asas de siembra (nicrón, aluminio)

Guantes

Hisopos de algodón

Portaobjetos

Papel Kraft

Pinzas de acero inoxidable

Piseta de plástico

Papel seda

Canastillas para tinción

Mechero Fisher

Jarra de anaerobiosis

Incubadora 35°C – 37°C

Microscopio compuesto, binocular, con lentes objetivo de 10X, 40X y 100X

Vela de parafina pura (sin olor y color)

Autoclave

Balanza

Jarra de cierre hermético tipo GasPak System

Refrigerador doméstico 4°C-8°C

Potenciómetro
Reactivos

Solución de cristal violeta

Solución de lugol

Solución de safranina

Solución de alcohol-acetona 1:1

Agua estéril

Aceite de inmersión

N,N-Dimethyl-1,4 phenylenediamonium HCl o N,N,N.N-tetramethyl-pphenylenediamine-HCl solución 1 % .

Medios diferencial CTA-carbohidrato (Glu, lac, fru, mal y sac)

Peróxido de hidrógeno 30 %

Agar Thayer-Martin modificado (ATMM)

Agar chocolate enriquecido (ACH)
Material Biológico

Muestra de exudado cervical o uretral extendidas en un portaobjetos. (Ver
Manual de Toma manejo y Envío de Muestras del InDRE)

Colonias bacterianas en cajas Petri con agar Thayer-Martin de 24 – 48 Hrs
de incubación.

Colonias bacterianas características de N. gonorrhoeae en cajas Petri con
agar Gelosa chocolate especial de 24-48 Hrs de incubación. (Fig 1)
Examen directo de la muestra
Procedimiento para el frotis de la muestra
De las muestras obtenidas con asa bacteriológica o hisopo, preparar dos frotes
tan finos como sean posibles y que abarquen una buena extensión en el
portaobjeto (limpio, desengrasado, no rayado). Para evitar alteraciones de la
morfología celular, no debe frotarse vigorosamente.
Cuando la muestra se obtiene por hisopado, ésta se debe rotar suavemente sobre
la superficie del portaobjetos.
Deje secar la muestra a temperatura ambiente o a calor suave, para luego realizar
la coloración de Gram.
Coloración de Gram (modificado por Hucker).
Cubrir el frotis con cristal violeta durante un minuto.
Lavar con agua corriente.
Aplique la solución de lugol para Gram durante dos minutos.
Lavar con agua corriente.
Decolore con alcohol-acetona (1:1).
Lavar con agua corriente.
Cubra el frotis con safranina durante 20 a 30 segundos.
Lavar con agua corriente.
Deje secar la lámina al aire o suavemente con papel absorbente.
Observar la lámina al microscopio con lente objetivo de inmersión.
Interpretación del resultado del examen directo
Positivo : Si se observa la presencia de diplococos intracelulares Gram negativos
típicos (ovales, de formas arriñonadas agrupados en pares).
Sospechoso : Si sólo se observan diplococos Gram negativos extracelulares
Negativo : Si no se observan diplococos Gram negativos
En términos generales, el informe del examen directo (coloración de Gram), debe
indicar además la presencia y cantidad de leucocitos polimorfonucleares. Este
dato es muy importante para el clínico, ya que puede indicar estar frente a un caso
de infección no gonocócica.
La coloración de Gram es de gran valor para el diagnóstico de gonorrea aguda en
varones (tiene una sensibilidad y especificidad de 99,0%), mientras que en la
mujer es considerablemente menor (especificidad de 45,0% a 55,0%) debido a la
presencia de flora bacteriana nativa, siendo necesaria la realización del cultivo.
Cultivo
Procedimiento
1) La muestra se siembra de inmediato en medio selectivo de Thayer – Martin.
2) Distribuír el inóculo por estriado masivo en toda la caja, en condiciones
asépticas.
3) Incubar entre 35 – 37°C en atmósfera húmeda (70% de humedad), con 3 al 5%
de bióxido de carbono (CO2).
Nota. Para el proceso de incubación se puede usar una de las siguientes
opciones:
Frasco de boca ancha con algodón humedecido, que contenga del 3 al 10% de
bióxido de carbono (el CO2 se genera utilizando una vela de parafina que se
enciende y apaga dentro del recipiente).
Jarra de anaerobiosis, con sobres generadores de CO2 (gas-pack).
Incubadora de CO2 con depósito de agua.
4) Al cabo de 24 a 48 Hrs se buscan colonias pequeñas, no pigmentadas (blancas
o grisáceas), convexas, mucoides y no hemolíticas, de un diámetro de 0.5 a 1 mm,
5) A las colonias características de Neisseria, se les hace tinción de Gram, prueba
de oxidasa y prueba de catalasa.
6) Realizar una re-siembra de las colonias sospechosas, distribuyendo la muestra
por cuadrantes para aislar en el medio gelosa chocolate especial.
7) Repetir los puntos 3, 4 y 5.
Fig 1. Inoculación de muestras en Agar Thayer Martin
Fig. 2. Inoculación en Jarra de Anaerobiosis (gas pack)
Fig 3. N. gonorrhoeae en Agar Thayer Martin
Identificación confirmatoria semi-automatizada
La identificación de N. gonorrhoeae, de forma automatizada, utiliza pruebas
estandarizadas y miniaturizadas, así como una base de datos específica, que para
este efecto se encuentra incluida en el software del equipo utilizado.
Fundamento
Cada galería de identificación está formada por 10 microtubos que contienen
substratos de forma deshidratada para la realización de 12 pruebas de
identificación bioquímica (reacciones enzimáticas y/o para la fermentación de
azucares), así como la investigación de una penicilinasa. Las reacciones
producidas durante la incubación, se traducen en cambios de color espontáneos o
revelados por la adición de reactivos. Después de dos horas de incubación a 3537°C, se realiza visualmente la lectura de las reacciones y la identificación se
obtiene ingresando los datos al programa del instrumento.
Material y Equipo

Puntas estériles para pipeta automática de 200 µl

Asas bacteriológicas

Guantes de nitrilo

Cubrebocas

Papel secante

Mechero Fisher

Incubadora

Micropipeta automática de 50 a 250 µl

Densitómetro o patrón de referencia No 4 de MacFarland

Equipo para identificación
Reactivos

Aceite de inmersión

Galería de identificación bioquímica y enzimática Api NH

Reactivo revelador James

Reactivo revelador ZYM B

Ampolletas de cloruro de sodio al 0.85%
Material Biológico

Colonias bacterianas características de N. gonorroheae en cajas Petri con
agar Gelosa Chocolate especial de 24 Hrs de incubación.
Procedimiento
1) Tomar una cámara de incubación (fondo y tapa) y anotar en la lengüeta lateral
la clave de la muestra. Sacar una galería de su bolsa hermética y colocarla en la
cámara (húmeda) de incubación.
2) A partir de un cultivo reciente (24 horas) puro, tomar con un asa estéril unas
colonias para realizar una suspensión en la ampolleta de cloruro de sodio 0.85%.
3) Ajustar la suspensión a una turbidez igual al patrón 4 de MacFarland (utilizar un
densitómetro).
Inoculación de la Galería
1) Colocar en los pozos correspondientes a los sustratos PEN, GLU, FRU, MAL,
SAC, ODC y URE 55 µl en cada uno y 150 µl en los tres últimos correspondientes
a LIP/ProA, PAL/GGT, bGAL/IND, procurando no formar un menisco convexo.
2) Adicionar en los siete primeros pozos una gota de aceite de parafina y cerrar la
cámara de incubación.
3) Incubar dos horas a 35 – 37 °C en atmósfera aeróbica.
Lectura de la Galería
1) Leer las reacciones con la ayuda de la tabla de lectura de la ficha técnica
Nota: Añadir una gota del reactivo ZYM B en los pozos LIP/ProA y PAL/GGT y
una gota del reactivo de James en el pozo bGAL/IND.
2) Esperar tres minutos y leer las reacciones con la tabla de la ficha técnica.
3) Si después de dos horas de incubación varias reacciones son dudosas, reincubar la galería dos horas más y leer de nuevo (excepto las pruebas
enzimáticas)
Interpretación
Codificar las reacciones en un perfil numérico de acuerdo al valor asignado en la
hoja de resultados para cada prueba (1, 2 o 4). Sumar los valores de las pruebas
positivas para cada grupo y obtener un código de cuatro cifras.
Nota: No codificar la primera prueba (Penicilinasa)
Identificación
Visual:
Buscar el perfil numérico en la lista de perfiles de la ficha
técnica
Automatizada:
Seguir el procedimiento para la operación del equipo.
Patrón de Identificación
Tabla de la muestra patrón de identificación
PAL
βGal
ProA
GGT
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
PEN
GLU
FRU
MAL
SAC
ODC
URE
N. gonorrhoeae
+
+
-
-
-
-
-
B. catarrhalis
-
+
-
-
-
-
N. cinerea
-
-
-
-
-
N. lactamica
-
+
-
+
-
Microorganismo
Donde:
LIP
PEN: Penicilinasa
PAL: Fosfatasa Alcalina
GLU: Glucosa
βGAL: Beta galactosidasda
FRU: Fructosa
ProA: Prolina arilaminidasa
MAL: Maltosa
GGT: Gamma glutamiltransferasa
SAC: Sacarosa
IND: Indol
ODC: Ornitin descarboxilasa
URE: Ureasa
LIP: Lipsas
IND
Prueba de utilización de carbohidratos en base CTA
Prueba convencional ampliamente utilizada por los países en desarrollo, no es
muy costosa pero requiere de un buen inóculo y de mayor tiempo de incubación
(de 18 a 72 horas), en comparación con las pruebas rápidas que sólo requieren de
2 a 4 horas, dependiendo del kit empleado.
Condiciones Específicas
Esta prueba debe realizarse con cultivo joven de 18-24 horas, procedente de sub
cultivo en agar chocolate con suplemento enriquecedor.
Procedimiento
a. Inocular la bacteria en estudio en tubos de 13x100 mm que contienen el medio
diferencial CTA-Carbohidrato.
Depositar un buen inóculo.
b. Inocular por picadura en el tercio superior del citado medio diferencial y luego
diseminar por estriación sobre la superficie inclinada (pico de flauta).
c. Incubar a 37°C sin CO2 durante 18-72 horas. Frecuentemente, resulta
suficiente 18-24 horas.
d. Examinar e interpretar: Es positiva, cuando el medio ha cambiado del color rojo
inicial hacia el amarillo
claro o pálido en el área del inóculo. Si el color amarillo se extiende por todo el
medio diferencial, podría tratarse de bacterias contaminantes. En estos casos se
debe hacer
una coloración de Gram y repetir la prueba, previa descontaminación, en medio
selectivo Agar Thayer Martin Modificado (ATMM).
Fundamento de la prueba
a. La prueba consiste en determinar la capacidad de la bacteria sospechosa de
ser gonococo de utilizar oxidativamente, uno o más carbohidratos (glucosa,
lactosa, maltosa, y sacarosa), mientras se va desarrollando.
b. El carbohidrato presente en el medio diferencial se encuentra en un agar base
cisteína-tripticasa, el cual tiene como indicador rojo de fenol, siendo el pH del
medio de cultivo 7,1±0,1.
c. N. gonorrhoae sólo utiliza glucosa, produciendo acidificación del medio, sin
producción de gas, lo cual se evidencia por el viraje de color rojo a amarillo.
d. Kellog y Orwing determinaron que esta prueba tiene una sensibilidad de 97,6%
y una especificidad de 100,0%.
Pruebas de Sensibilidad a los Antimicrobianos para N. gonorrhoeae
Introducción
Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana están indicadas para cualquier
microorganismo que contribuye a un proceso infeccioso en el que se justifique el
uso de terapia antimicrobiana y cuando se sabe que el microorganismo pertenece
a especies capaces de presentar resistencia a los agentes antimicrobianos
comúnmente usados en el tratamiento.
Las pruebas de susceptibilidad son
también importantes en estudios epidemiológicos sobre la resistencia y cuando se
estudian nuevas terapias.
Las pruebas de susceptibilidad generalmente son útiles como una guía para la
selección de antimicrobianos, en cada caso, o bien para la modificación de un
tratamiento.
En la actualidad, las técnicas para determinar la susceptibilidad de un
microorganismo a un antimicrobiano pueden realizarse por los siguientes métodos:
a)
Método de dilución: Consiste en incorporar diluciones de un antimicrobiano a
un medio de cultivo (caldo o agar), después se inocula el microorganismo a
estudiar. La concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento
visible después de la incubación, se denomina Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI).
b)
Método de difusión con discos: En un medio de agar, sembrado
uniformemente con el microorganismo en prueba, se colocan discos impregnados
con antimicrobianos a concentraciones predeterminadas y después de un periodo
de incubación se observa la susceptibilidad o resistencia de acuerdo a los
patrones establecidos.
c)
Método de dilución y difusión con tiras: En un medio con agar, sembrado
masiva y uniformemente con el microorganismo, se colocan tiras plásticas
impregnadas con gradientes exponenciales y predefinidos del antimicrobiano, las
cuales liberan de manera inmediata y efectiva el antibiótico sobre el agra, creando
un gradiente contínuo de concentración debajo de la tira. Después de la
incubación se puede distinguir una elipse de inhibición del crecimiento. El valor
CMI es determinado en la escala de la tira donde la elipse intercepta.
d)
Métodos automatizados: En el comercio se encuentran diferentes aparatos
que además de las pruebas de susceptibilidad, el sistema permite identificar a la
bacteria, como por ejemplo,
mini API,
AutoBac o el MS-2 y los aparatos
semiautomatizados (replicador de Steer).
Cada método utilizado tiene sus ventajas y sus limitaciones y su utilidad
dependerá de las necesidades y recursos de cada laboratorio.
Las pruebas de sensibilidad deberán efectuarse en los siguientes casos:

Para practicar encuestas epidemiológicas en laboratorios de referencia con
objeto de obtener información básica sobre la sensibilidad y vigilar las
tendencias de resistencia a medicamentos.

En los laboratorios de ITS que practican gran número de pruebas, como
complemento de los procedimientos utilizados para vigilar la eficacia clínica
de las recomendaciones y orientar el tratamiento.

Para el estudio de nuevos agentes antimicrobianos.

Para facilitar la información a los clínicos, en caso de fracaso del
tratamiento.
Pueden utilizarse dos procedimientos diferentes: la difusión en disco y la
determinación de la CIM por una técnica de dilución en agar. Solo se recomienda
esta última para vigilar las tendencias de la resistencia medicamntosda y para el
estudio de nuevos fármacos.
Un método útil para laspruebas de sensibilidad a los antimicrobianos es el método
de difusión en agar (Kirby Bauer) que pro su sencillez, rapidez, economía y
reproducibilidad.
DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE BETA-LACTAMASA
Desde el año 1976 se reporta la presencia de cepas productoras de betalactamasa (penicilinasa), así como de cepas resistentes a otros antibióticos
utilizados en el tratamiento de la gonorrea.
La prueba de susceptibilidad antibiótica para el gonococo comúnmente se realiza
mediante el método de concentración inhibitoria mínima (CIM), con el objetivo de
realizar vigilancia de resistencia antibiótica y evaluar los esquemas del
tratamiento.
OBJETIVO
Establecer los procedimientos para realizar la detección de la enzima betalactamasa en cepas de gonococo.
CONDICIONES GENERALES
Haber realizado el aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae.
La cepa no debe estar contaminada y debe ser un cultivo joven, de preferencia, de
subcultivo en agar chocolate enriquecido.
Las técnicas que comúnmente utilizamos en el Laboratorio de Referencia Nacional
son:
Método de la cefalosporina cromógena, Cefinase (prueba directa).
Método yodométrico rápido (prueba indirecta).
MÉTODO DE LA CEFALOSPORINA CROMÓGENA, CEFINASE
Fundamento
Consiste en un disco de papel impregnado con cefalosporina cromógena
(NITROCEFIN) que cambia de amarillo a rojo cuando el anillo beta-lactámico es
hidrolizado por la enzima beta-lactamasa. Esta prueba tiene un amplio espectro de
susceptibilidad , es fácil de realizar y no requiere de mucho tiempo.
Procedimiento
Con la ayuda de una pinza estéril, coger un disco por prueba a realizar y colocarlo
dentro de una placa petri vacía.
Humeder el disco con 1 gota de agua destilada estéril.
Impregnar varias colonias de N. gonorrhoeae en la superficie del disco
humedecido con un asa estéril o un mondadientes.
Observa la reacción durante 1 a 5 minutos.
Interpretación del método
Si la cepa en estudio produce beta-lactamasa, el disco cambiará de amarillo a rojo
Algoritmos
Departamento de Enfermedades Emergentes y Urgencias
LINEAMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO
DE
ITS en Primer Nivel
2012
Infecciones de Transmisión Sexual
Introducción
Las infecciones de transmisión sexual (ITS) son un grupo de padecimientos de
distribución mundial y en la actualidad constituyen el grupo más frecuente de
enfermedades infecciosas en personas entre 15 y 50 años. Las cinco ITS clásicas
son: gonorrea, sífilis, chancroide, linfogranuloma venéreo y el granuloma inguinal.
Las ITS son un problema importante en salud pública, que se ha reconsiderado
recientemente a partir de la descripción de su asociación con la infección por VIH,
sobre todo de las ITS úlcerogenitales. Actualmente las enfermedades producidas
por virus junto con Clamydia y Gardnerela, tienden a sustituir en importancia y
frecuencia a las enfermedades bacterianas clásicas, por lo que estos agentes se
consideran como la segunda generación de las ITS, ya que son más difíciles de
identificar y tratar, además de que pueden desencadenar graves complicaciones
que conducen a enfermedades crónicas, discapacidad e incluso la muerte.
Aunque las tasas de infección para hombres y mujeres son muy similares, son
estas últimas junto con los lactantes, las que sufren la mayoría de las
complicaciones y secuelas graves. Las ITS en embarazadas pueden producir
infecciones en el recién nacido (oftalmia neonatal, blenorragia, ceguera, etc.),
partos prematuros o la muerte del producto antes de nacer y frecuentemente, la
enfermedad pélvica inflamatoria es causa de infertilidad y embarazos ectópicos.
Entre los microorganismos causantes de este tipo de enfermedades se encuentran
diversos grupos de agentes, dentro de los cuales tenemos:
Virus, bacterias, hongos, protozoarios y ectoparásitos. Durante las últimas dos
décadas, el espectro de las ITS se ha expandido grandemente y actualmente
incluye por lo menos 50 síndromes clínicos distintos, causados por más de 25
organismos patógenos conocidos, de esta manera, el mismo microorganismo
puede causar diferentes síndromes y el mismo síndrome puede deberse a
diferentes microorganismos.
La identificación de estos agentes se realiza utilizando diversas metodologías
según el tipo de microorganismo que está involucrado y los métodos utilizados son
tan diversos como las observaciones en fresco, la identificación de los antígenos
del agente en la muestra clínica, el aislamiento por cultivo, la evidencia del
contacto con el agente mediante técnicas serológicas, etc.
Obtención y manejo de la muestra
La toma y manejo de muestras requieren condiciones especiales en cada caso y
se recomienda que la muestra:
1) Se debe tomar cuando existe la sintomatología y en algunos casos en los
contactos asintomáticos del caso
2) El paciente NO debe estar bajo tratamiento antimicrobiano
3) Para su toma se tienen que usar materiales adecuados, como los hisopos de
alginato de calcio o de dacrón
4) Cuando se indique, la siembra para el aislamiento debe hacerse de inmediato y
si no es posible, hay que emplear buenos medios de transporte, protegiendo la
muestra de las condiciones ambientales principalmente de la desecación
El tipo de muestra apropiada para el diagnóstico de infecciones de las vías
genitales depende del sitio de la infección y del organismo responsable. Las
infecciones de los genitales inferiores pueden ser clínicamente indistinguibles y ser
causadas por diferentes agentes y cada uno requiere de técnicas de colección y
aislamiento específicas. Por ello se recomienda una buena comunicación con el
médico, para conocer la naturaleza de los agentes que sospecha como causales
Existen casos en mujeres y en hombres donde es necesario muestrear otros sitios
anatómicos, sobre todo en los pacientes que refieren contacto oro-genital, anogenital u oro-anal.
Muestras de canal endocervical
1) Se utiliza un espejo para revisar el cérvix. Antes de tomar la muestra el
exocervix se limpia con un hisopo de algodón para eliminar moco y exudado
2) .El hisopo debe introducirse dentro del canal endocervical de 2 a 4 cm, se rota
presionando contra la pared y se saca, evitando el contacto con las superficies
vaginales
3) Los hisopos recomendados son los de alginato de calcio o de dacrón, con
mango de aluminio o plástico. No se recomienda el uso de hisopos de algodón.
Si no se puede evitar el uso de este tipo de material, se recomienda agitar
vigorosamente el hisopo en el medio de transporte, y luego presionarlo contra
la pared del tubo para quitar el exceso de líquido. El hisopo se elimina de
inmediato para prevenir la introducción de factores inhibitorios
4) El cepillo citológico se usa para agentes intracelulares y para toma de
muestras para tinción de papanicolau y solo debe utilizarse después del uso
del hisopo
Muestras de canal vaginal
Se coloca el espejo y se obtiene una muestra de la pared posterior vaginal,
introduciendo el hisopo y dejando pocos segundos para la absorción de material.
Si el himen está intacto, el espejo no debe ser utilizado, solo se introduce el hisopo
en el orificio vaginal.
Muestras de canal anal
1. Se coloca al paciente en posición supina (boca abajo) y se inserta un hisopo
aproximadamente 3 cm dentro del canal anal
2. Con cuidado se rota el hisopo sobre las criptas del anillo anal y se esperan
unos 30 seg para que se absorba la muestra
Observación en fresco
Las observaciones en fresco son de gran utilidad sobre todo en mujeres en las
cuales existe exudado vaginal y en el caso de tricomoniosis, vaqinosis bacteriana
y candidiasis.
1. La recolección se debe realizar del exudado vaginal del fórnix posterior
utilizando un hisopo de algodón.
2. La muestra recolectada se coloca inmediatamente en un portaobjetos con una
gota de solución salina fisiológica, se pone por encima el cubreobjetos y se
observa inmediatamente al microscopio, con objetivo de 40X y poca
iluminación.
En el caso de exudado abundante, el hisopo se coloca en un tubo con 1 ml de
solución salina y se observa inmediatamente.
Gardnerella vaginalís es un bacilo pequeño con extremos redondeados,
pleomórficos, Gram-negativos a Gram variables, no capsulados, no poseen
flagelos, ni forman esporas. Existe discusión de si esta bacteria pertenece o no la
flora normal, pues se ha aislado en mujeres que no tienen signos y síntomas, sin
embargo la mayoría de los autores concuerdan que existe una fuerte correlación
entre vaginosis bacteriana y el aislamiento de G. vaginalis.
En 1983, Amsel, determinó que las muestras de exudado vaginal deberían de
cumplir 3 de los 4 siguientes criterios para establecer un diagnóstico de vaginosis
bacteriana:
1) Que el exudado sea homogéneo
2) Que el pH del exudado sea mayor de 4.5 (medición que se puede realizar con
tiras reactivas de papel pH)
3) Que la prueba de KOH resulte positiva (al exudado que queda sobre el espejo
vaginal se le añaden unas gotas de solución de KOH al 10% y se reporta como
positiva si se desprende un olor característico a “pescado" el cual se debe a
aminas volátiles).
4) Que se demuestre la presencia de células clave o células guía (que son células
del epitelio vaginal con un aspecto granuloso, con límites poco precisos, llenas
de bacilos que se observan en fresco o por la tinción de Gram).
Estos criterios son muy útiles cuando no se cuenta con los medios adecuados
para el aislamiento.
Preparación de frotis
1) Mediante un hisopo o asa para cultivos se deposita una pequeña cantidad de
muestra sobre un portaobjetos
2) La muestra se extiende sobre la superficie para obtener un frotis delgado. El
frotis debe prepararse por rotación y no tallado para conservar así la integridad
de las células presentes en la muestra (por ejemplo, polimorfonucleares)
3) Una vez obtenido el frotis, se deja secar completamente y se fija a la llama
cuidando de no sobrecalentar
4) Se hace una tinción por el método de Gram y cuando es aconsejable, una de
Giemsa o de Wright, ante la sospecha de Chlamydia
De uno y de otro grupo hay múltiples pruebas, pero de ellas sólo muy pocas han
quedado como verdaderamente útiles. La realización de estas pruebas es rápida y
en general sencilla, sin embargo es conveniente que todo el personal que las
realice esté perfectamente adiestrado en ellas y se lleven a cabo programas de
control de calidad que aseguren la uniformidad en el diagnóstico serológico de la
sífilis
Con respecto a las pruebas serológicas, se sabe que existen situaciones en las
que las técnicas, principalmente las que utilizan antígeno no treponémico pueden
ser reactivas sin haber infección y contrariamente en formas tardías de sífilis
pueden ser negativas.
Agoritmos
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