C o lo ra c ió n G R A M

2g
100 ml
Alternativa
SAFRANINA GRAM
–Listo para su uso
Safranina O R.A.
Alcohol etilico al 96%
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
• Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y
protegidos de la luz. Después de abierto el contenido
almacenado entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz es
estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
• Temperaturas inferiores a 15°C puede precipitar col orantes
de las soluciones colorantes.
• Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.
0.3 g
90 ml
10 ml
FUCSINA BASICA
–Listo para su uso
Fucsina básica R.A.
Fenol al 5%
Alcohol etilico al 96%
ALCOHOL ACETONA Decolorante para GRAM
–Listo para su uso
Alcohol Etílico al 96%
80%
Acetona R.A.
20%
LUGOL (Solución Yodo/Yoduro) para GRAM
–Listo para su uso
Yodo metalico R.A.
0.4 g
Potasio yoduro R.A.
0.6 g
Agua desmineralizada tipo II
100 ml
VIOLETA CRISTAL (VIOLETA DE GENCIANA)
para GRAM
–Listo para su uso
Violeta cristal (Genciana) R.A.
2g
Amonio Oxalato R.A.
1g
Agua desmineralizada tipo II
100ml
CONTENIDOS
PRINCIPIO
La coloración de Gram ha constituido, desde los albores de la
Bacteriología, un elemento fundamental para la taxonomía e
identificación. Las bacterias Gram positivas que presentan
una gruesa capa de peptidoglicano como estructura
fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las
Gram negativas, que encima de ésta, presentan una delgada
capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacáridos-lipoproteína,
denominada
membrana
externa. La presencia de esta membrana diferencia
actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: las que
no lo poseen, Firmicutes (Gram +) y las que sí, Gracilicutes
(Gram-). Esta coloración permite la clasificación de las
bacterias en GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS
SEGÚN LA COMPOSICIÓN DE SU PARED CELULAR.
Por esto el complejo de color formado con la pared de las
bacterias gram positivas no puede ser removido con el
agente decolorante que es el alcohol acetona.
La célula permanece de color azul violeta, en cambio las
bacterias gram negativas, al decolorarse con el alcohol
acetona, se dejan colorear con la fucsina ó safranina,
quedando de color rosado.
Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cubeta de tinción
•
•
•
•
Frasco lavador
Agua
Mechero Bunsen o alcohol
Cronometro y/o timer
REQUERIDOS
NO
2009-10 V3
9.Examinar al microscopio con lente de inmersión de 100X.
8.Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
Dejar secar al aire.
7.Cubrir la preparación (Placa) con FUSCINA BASICA o
SAFRANINA para GRAMpor un (1) minuto
6.Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
5.Decolorar la placa con ALCOHOL ACETONA Solución
decolorante para GRAM Por 15 - 30 segundos hasta que
la placa decolore totalmente.
4.Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
3.Cubrir la preparación (Placa) con
LUGOL (Solución Yodo/Yoduro) para GRAM
por un (1) minuto.
2.Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
1.Cubrir la preparación (Placa) fijada con
VIOLETA CRISTAL (Violeta de Genciana) para GRAM
por un (1) minuto.
PROCEDIMIENTO
Toda muestra biológica debe se considerada
como potencialmente infecciosa.
MUESTRAS
El material a examinar, como líquidos corporales, exudados,
pus, material de colonias líquido o sólido, se aplica con el asa
que ha estado al rojo sobre un portaobjetos exento de grasa.
Luego se mezcla directamente o con 1 ó 2 gotas de solución
fisiológica de cloruro sódico y se extiende. Después de secar
al aire se procede a la fijación por calor, para lo que se pasa
3 veces, lentamente, el lado inferior del portaobjetos (la parte
del frotis queda arriba) por la parte superior de la llama de un
mechero Bunsen. Luego se deja enfriar y se tiñe.
•
•
•
•
MATERIALES
ADICIONALES
SUMINISTRADOS
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
• La solución R1 Violeta Cristal (Violeta de Genciana) y la
solución R4 Fuscina básica o Safranina son irritantes en
contacto con piel, ojos y mucosas.
• La solución R3 Alcohol acetona y la solución R4 Fuscina
básica o safranina son inflamables, por lo tanto se deben
tomar los cuidados requeridos para el manejo de productos
inflamables en el laboratorio.
• Observe la simbología en los rótulos de las soluciones.
• Las soluciones usadas y las caducadas deben eliminarse
como desechos especiales, debiendo cumplir las
regulaciones locales para el desecho de compuestos
peligrosos.
Juego de soluciones para la coloración diferencial de GRAM
para microscopía
Coloración GRAM
Rosa-Rojo
Microorganismos Gram Negativos
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1.Gurr,E., Syntethic dyes in Biology, Medicine and Chemistry. Academic
Press, London, New York. (1971).
2.Splengler, M.S., Rodeheaver, G.T., Richter, L., Edgerton, Edlich, R.F..
The Gram stain – The most important diagnostic test of infection. J.Am.
College Emergency Physicians 7, 434-438. (1978).
3. Clark, George, Stains and staining (Microscopy), 4 th edition, Williams &
Wilkins, (1981).
BIBLIOGRAFÍA
NOTAS SOBRE EL EMPLEO
• La técnica descrita anteriormente puede modificarse de
acuerdo con las preferencias del operador para lograr
mayor o menor intensidad de coloración, lo cual implica
variaciones en los tiempos de tinción, decoloración,
lavado,...
• Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA
Solución decolorante para GRAM en la fase de
decoloración puede llegar a decolorar los gérmenes
GRAM POSITIVOS.
• Cultivos y preparaciones viejas pueden dar resultados
atípicos. Es por ello que se recomienda utilizar cultivos de
18-24 h como máximo o extensiones recientes.
• Asimismo, es importante controlar la fijación por el calor
(dos-tres pasos de un segundo por llama suave); un
exceso del mismo puede dar coloraciones erróneas.
• Agua altamente clorada puede debilitar la coloración de
contraste.
CONTROL DE CALIDAD
Los controles puedes realizarse con bacterias Gram Positivas
(estafilococos) y bacterias Gram Negativas (Escherichia
Coli). Para ello deben utilizarse cultivos procedentes de
medios de cultivo incubados durante 18-24 horas.
Azul-Violeta
Microorganismos Gram Positivos
RESULTADO
2009-10 V3
Juego de soluciones para la coloración diferencial de GRAM
para microscopía
Coloración GRAM