Gremmeniella abietina - congreso forestal español

CONTROL BIOLÓGICO DE GREMMENIELLA ABIETINA CON
ENDÓFITOS EN PLÁNTULAS DE PINO CARRASCO EN
INVERNADERO
Carmen Romeralo Tapia 1
Leticia Botella Sánchez 2
Oscar Santamaría Becerril 3
Julio Javier Diez Casero 1
1 Instituto
Universitario de Investigación
g
en Gestión Forestal Sostenible,, Universidad de
Valladolid-INIA, Palencia, España.
2 Universidad de Mendel, Brno, República Checa.
3 Universidad de Extremadura, Badajoz, Cáceres, España.
Vitoria, 13 de Junio de 2013
Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet
Masa de 50ha de Pino silvestre afectada por G. abietina en Suecia
(Jesper Witzell)
Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet
•
Destrucción
ó de plantaciones y bosques naturales de confíeras
fí
por todo el
mundo: en el centro y norte de Europa, NorteAmérica y Japón.
•
Hospedantes: géneros Pinus, Picea, Abies y Larix.
•
En España aislado de pies sintomáticos de Pinus
Pin s halepensis.
halepensis
•
No ha habido brotes epidémicos.
•
Aislado por primera vez en pino carrasco en 1999 (Santamaria et al. 2001)
Área afectada
Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet
•
•
Síntomas:
í
Apariencia:
Defoliación copas
Picnidios
Esporas
Distorsión ramillos
Micelio
Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet
•
C
Control
ld
de la
l enfermedad:
f
d d
1. Químico. Fungicidas: Maneb, Ziram, Cloralonil.
2. Medias selvícolas. Evitar la dispersión de la enfermedad (claras, eliminación de los
árboles muertos, reducción de fuentes de inóculo).
3. Mejora genética: hospedantes/árboles resistentes.
4. Biológico: antagonistas; i.e., Phaeotheca dimorphospora, Trichoderma, Gliocladium sp.
Control biológico
•
•
Método
Mét
d alternativo
lt
ti de
d control
t l de
d enfermedades
f
d d de
d las
l plantas.
l t Los
L productos
d t químicos
í i
van en detrimiento por su peligroso efecto en el medio ambiente.
Los principales mecanismos de control biológico se basan en
diferentes tipos de interacción entre el organismo y su antagonista (HEYDARI &
PESSARAKLI, 2010 ):
1)Micoparasitismo.
2)Antibiosis.
3)Producción de metabolitos.
4)Competición por nutrientes.
5)Inducción de la resistencia.
Defensa de las plantas a los patógenos
1))
Defensas p
preformadas o p
preexistentes (y
(ya están en la p
planta antes del ataque
q
o contacto con el patógeno).
1.1. Estructurales
(cutícula tricomas,
(cutícula,
tricomas células lignificadas)
lignificadas).
1
1)
1.2. Químicas preformadas
(metabolitos secundarios).
secundarios)
Defensas
f
inducidas (se activan como consecuencia del contacto con el
patógeno).
2.1. Estructurales (cambios en la
estructura y función de la pared
celular).
2.2. Bioquímicas (mayor concentración
de compuestos, liberación de
compuestos fungitóxicos…etc).
Metabolitos secundarios
Funciones:
•
Defensa contra predadores y
patógenos.
•
Agentes alelopáticos.
•
Atrayentes de polinizadores o
a los dispersores de las
semillas
•
Ejemplo: la presencia de
altos niveles de compuestos
fenólicos en algunas
maderas ha explicado su
protección natural contra la
pudrición.
Hongos endófitos
• Los endófitos
óf
incluyen a cualquier organismo que vive dentro de la planta que
resulte neutral beneficioso o perjudicial para su hospedante.
• Están presentes en todas las plantas, muy extendidos en la naturaleza.
• Han sido registrados como agentes de control biológico (e.g.
(e g Trichoderma).
Trichoderma)
• Son capaces de activar el sistema de defensa inducido de la planta mediante la
activación
ó de las rutas metabólicas
ó
secundarias, produciendo compuestos
fenólicos que protegen a la planta.
• Pero también
1)Micoparasitismo.
Micoparasitismo
2)Antibiosis.
3)Producción de metabolitos.
4)Competición por nutrientes.
5)Inducción de la resistencia.
Objetivos
Evaluar el efecto de la presencia de varios endófitos
ó
en la infección
ó
producida por el patógeno Gremmeniella abietina en plántulas bajo
condiciones de invernadero.
Nuestra hipótesis:
¿Podrán los endófitos reducir o inhibir el crecimiento del patógeno?.
Materiales y Métodos
•
Plántula
á
de pino carrasco de 2 años
ñ de edad :
Altura: 17,03 ± 3,22cm
Diámetro: 3,23 ± 1,03mm
•
Seis aislados de Gremmeniella abietina.
•
Cinco endófitos aislados de pies sanos de pino carrasco :
- Trichoderma sp.
sp
- Aureobasidion pullulans
- Aureobasidion sp.
- Dothiomycete sp.
- Endófito 20.3 (no encontrado enGenBank).
Inoculaciones
- En Diciembre para imitar el
patrón de comportamiento del
hongo.
Proceso:
10 cm del ápice
Quitar acículas
•
•
•
•
•
Pinus halepensis.
Combinación (aislado*endófito) x 8.
En total: 336 plántulas.
Todo el experimento repetido (x2).
Variables respuesta: Longitud relativa
de la necrosis, Contenido en fenoles
totales.
Bisturí
Micelio
Cubrir con Parafilm
Corte por la mitad con bisturí
Medición de la plántula
La longitud relativa de la necrosis se calculó:
Longitud delanecrosis
LRN 
Longitud
g
dela p
plántula
Medición de la necrosis
Fenoles totales (Singleton & Rossi 1965; Robles et al. 2003)
(1) Cortar un trozo de
10cm de la plantula
(4) Extraer los fenoles
con methanol al 70%.
70%
Reacción colorimétrica
(2) Secar en estufa a
40ºC 1 semana
(3) Moler hasta polvo
fino
(5) Cuantificar el contenido en fenoles
con un espectofotómetro (absorbancia
a 760nm)
Re aislamiento de G.abietina
(1) Cortar un trozo de
2cm con necrosis
(2) Liofilizar durante
24h
(3) Moler a polvo
fino
Mycol. Res. 104 (5) : 527–532 (May 2000)
PCR detection of Gremmeniella abietina,
abietina the causal agent
of Scleroderris canker of pine
Richard C. HAMELIN, Martin BOURASSA, Jimmy RAIL, Mathieu
DUSABENYAGASANI Volker JACOBI and Gaston LAFLAMME
DUSABENYAGASANI,Volker
(4) Extracción de ADN
(5) PCR Anidada cebadores
específicos NSGrem 3-4-5-6
específicos.
3456
Re
e aislamiento
a s a e to de G
G. ab
abietina:
et a PCR
C a
anidada
dada
Región 18S del ADN ribosómico
Cebadores (primers) empleados:
1ª Ronda)) NS Grem 3// NSGrem 4
2ª Ronda) NS Grem 5/ NSGrem 6
BMC Microbiology
Microbiolog 2005 5
5:65
65
Specific and sensitive detection of the conifer
pathogen Gremmeniella abietina by nested PCR
Qi Yi Zeng,
Qing-Yin
Z
P Hansson
Per
H
and
d Xiao-Ru
Xi R W
Wang
Res ltados
Resultados
Seis meses después de las inoculaciones todos los endófitos redujeron la necrosis
comparados
d con los
l controles.
t l
Longitu
ud relativa de la
a necrosis
0,3
a
0,25
b
02
0,2
b
b
b
b
0,15
0,1
0,05
0
Aureobasidion sp.
Aureobasidion
pullulans
Endófito 20.3
Endófito
Dothiomycete sp.
Trichoderma sp.
Control
Contenido en Fenoles totales
0,8
R² = - 0,64
p < 0,001
N= 112
Longgitud relativa de la necrosiss
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
500
1000
1500
2000
Contenido en fenoles totales (Equivalentes en ácido gálico/peso seco)
2500
• Correlación Pearson p=0,05.
• Plantas con mayor necrosis tenían menor contenido en fenoles totales.
p
• Activación del sistema de resistencia inducido de la planta.
3000
Re aislamiento de G.
G abietina
•
Cuerpos de fructificación: el 41,86% de las plantas mostraron picnidios.
PCR anidada: resultados preliminares
M
Gel electroforesis
2% Agarosa
120V, 70 minutos
850 pb
b
Detección de G. abietina
con cebadores
específicos.
C
C
C
Conclusiones
1
1.
La presencia en las plántulas
á
de los hongos endófitos
óf
redujo la necrosis
producida por Gremmeniella abietina de forma significativa en comparación
con las plantas control. Todos los endófitos produjeron esta reducción.
2.
El contenido en fenoles totales estuvo relacionado de forma inversamente
proporcional a la longitud de la necrosis; es decir las plantas con menos
necrosis presentaron mayor contenido en fenoles totales lo que coincide con
la bibliografía y sugiere la activación del sistema de defensa inducida de la
planta por parte de los hongos endófitos.
3.
El método más apropiado para comprobar qué hongo estaba produciendo las
necrosis en nuestro experimento fue la extracción de ADN y la amplificación
mediante 2 rondas de PCR de una región específica de G. abietina mediante
dos cebadores de la especie.
Agradecimientos
Proyecto del Ministerio AGL2008
AGL2008-03622
03622 Control Biológico de Gremmeniella abietina
en España
Contacto
carmenromeralo@gmail.com; carmen.romeralo@pvs.uva.es