luciferasa

LA GAUSSIA LUCIFERASA COMO BIOMARCADOR PARA MONITOREAR
PROGRESIÓN DE TUMOR Y EL TRATAMIENTO RESPONDE A SISTEMA DE
METASTASIS
INTRODUCCION
En la actualidad son muy pocas las técnicas que están disponibles
para la cuantificación de las metástasis sistémica en este trabajo de
investigación se uso la Gaussia luciferasa como un biomarcador para
observar la progresión de un tumor metastasico y sus respuestas al
tratamiento, En tumores de mama se empleara un derivado de la
MDA-MB 231celulas que expresan gaussia luciferasa y luego la carga
tumoral en sangre y orina junto con la imagen de bioluminiscencia.
Para supervisar la respuesta al tratamiento se utilizara Lapatinib
inhibidor dual de la quinasa.
OBJETIVOS
Conocer como se realizaron estas investigaciones.
Conocer la importancia de estos experimentos en el tratamiento y
evolución de los tumores.
Saber a qué conclusiones llegaron.
MARCO TEORICO
LA GAUSSIA es un copépodo mide de 1mm a 27 mm produce una de
las mas brillantes pantallas de biolumuniscencia cuando hacen un giro
para escaparse.Son crustáceos relacionados con los cangrejos y
langostas, pertenecen al phillum Artrophoda
LUCIFERASAS
Son enzimas que oxidan ciertos agentes luminiscentes para emitir luz
(luminiscencia física). Las luciferasas de diferentes organismos han
evolucionado de distinto modo, por lo que tienen diferentes estructuras
y sustratos.
PRODUCCION DE LA BIOLUMINISCENCIA
La producción de bioluminiscencia es una manifestación energética de
algunos animales como dinoflagelados y algunas bacterias, se ha
demostrado que la bioluminiscencia se debe a dos sustancias la
luciferina y la luciferasa que al reaccionar entre sí en presencia de O2
dan la presencia de luz
La luciferina que ha sido cristalizada contendría un núcleo indolico y
según una hipótesis produciría con este una luz azul cuyo espectro
seria posteriormente modificado por secuencias contiguas de
aminoácidos, las luciferasa poseen las propiedades de una proteína y
es de naturaleza enzimática.
La luciferina por acción de la luciferasa se oxida deshidrogenandose y
la consiguiente transformación de energía se manifiesta como luz
visible, la luciferina muestra un elevado grado de especificidad y solo
emite luz al reaccionar con la luciferasa de la misma especie o de
especies muy afines desde el punto de vista sistemático
El espectro de la luminiscencia consiste en bandas de diferente
amplitud que ocupan posiciones diferentes en la región visible del
espectro extendiéndose entre 400 nm y 700nm de ahí derivan los
diferentes colores de luz de los diferentes animales luminiscentes,
azul,verdoso,amarillo,anaranjado, algunos animales pueden emitir
luces de colores diferentes en diferentes partes del cuerpo.
.
Mientras que en la mayor parte de los animales es posible extraer las
dos sustancias que producen la luz y hacerlas reaccionar con el
exterior del organismo en presencia de O2 en las bacterias la reacción
luminosa está ligada a la estructura protoplasmática y no es posible
reproducirla en vitro
En laboratorio puede cultivarse bacterias sobre medios apropiados,
dichas bacterias no son patógenas para el hombre pero pueden serlo
para otros animales, existen bacterias que viven en simbiosis en
órganos especiales de peces confiriéndoles luminosidad continua.
Mientras que la luz producida por bacterias es continua en presencia
de oxigeno y es continua durante la noche y en el día en algunos
animales solo reaccionan ante un estimulo y se le llama fosforescencia
Bioluminiscencia no es = "fluorescencia" o “fosforescencia”.
Fluorescencia: la energía de una fuente de luz es absorbida y
reemitida como otro fotón.
Bioluminiscencia: la energía para la excitación proviene de una
reacción química y no de una fuente de luz
ALGUNOS ANIMALES EMITEN BIOLUMINICENCIA
La bioluminiscencia es un fenómeno relativamente frecuente en
bastantes especies marinas; las últimas estimaciones consideran que
hasta un 90% de los seres vivos que habitan en la porción media y
abisal de los mares podrían ser capaces de producir luz de un modo u
otro. En hábitats terrestres la bioluminiscencia no es tan común. La luz
emitida por el pescado o la carne en descomposición se debe a
bacterias mientras que la de la madera muerta se debe tanto a
bacterias como a los micelios de ciertos hongos
En algunas especies sirve como referencias sexuales y ayudas en el
emparejamiento (el caso de las luciérnagas); en otras funcionan a
modo de cebo (como en el caso de algunos pejesapos) y en otras
como defensas para confundir a los depredadores
ALGUNOS ANIMALES QUE EMITEN FOSFORESENCIA
TIPOS DE LUCIFERASA La fosforescencia la producen algunos algunos poliperos por los poros que
encierram algunas medusas, algunos anélidos moluscos y crustáceos a algunos, así como el brillo
de los ojos de algunos mamíferos que sus ojos brillan en la noche particularmente de las vacas los
gatos que reflejan la luz
La reacción catalizada por la luciferase de firefly lleva a cabo en dos
pasos:

Luciferina + ATP → luciferyl adenilato + PP i

Adenilato luciferyl + O 2 → oxyluciferin + AMP + luz
La reacción es muy energéticamente eficiente: casi la totalidad de la
entrada de energía en la reacción se transforma en luz
Se ha descubierto una sutil diferencia estructural en luciferase que
causa el cambio de color de emisión de bioluminiscencia de un color
amarillo verdoso a rojo. La estructura de luciferase de tipo salvaje y
mutante rojo (S286N) luciferase de la japonesa Genji-Botaru (Luciola
cruciata) en complejo con un análogo intermedio 5 ' - O-[N(dehydroluciferyl)-sulfamoyl] adenosina (DLSA) fue examinado y
estudios mostraron que la luciferase de tipo salvaje acomplejado con
DLSA exhibió una «formulario cerrado' del sitio activo, donde la
cadena lateral de aminoácido isoleucina 288 se desplazó hacia el
anillo de benzothiazole de DLSA, creando un bolsillo hidrofóbico
rígido. El luciferase de tipo salvaje 'forma cerrada' había enlazado el
estado excitado de oxyluciferin en un microentorno muy rígido y no
polar, minimizando la pérdida de energía antes de emitir luz de color
amarillo verdoso. La luciferase de S286N acomplejado con DLSA
exhibió un ' Abrir formulario ' del sitio activo, donde la cadena lateral de
aminoácido de isoleucina 288 no se mueve hacia el anillo de
benzothiazole de DLSA, creando un menos rígida y menos
microentorno hidrofóbico. La luciferase de S286N 'formulario abierto'
tenía un microentorno menos rígido que permite cierta pérdida de
energía desde el estado excitado de oxyluciferina, que dio lugar a la
emisión de luz roja de baja energía.
Ejemplos
Una variedad de organismos regulan su producción de luz usando
diferentes luciferases en una variedad de reacciones de salida de la
luz. Los más famosos son las luciernagas aunque la enzima existe en
organismos tan diferentes como el hongo de Jack-O-linterna
(Omphalotus olearius) y muchas criaturas marinas. En las luciérnagas,
el oxígeno necesario se suministra a través de un tubo en el abdomen
que se llama traquea abdominal. Las luciferases de las luciérnagas de los cuales hay más de 2000 especies - y de la Elateroidea
(luciérnagas, escarabajos y familiares) en general - son lo
suficientemente diversos como para ser útil en filogenia molecular. El
luciferase más minuciosamente estudiado es el de las luciérnagas de
Photinini pyralis de Photinus, que tiene un pH óptimo de 7,8.
También se ha estudiado luciferasa de Renilla reniformis. En este
organismo, la luciferasa está estrechamente asociada con una
proteína de enlace de Luciferina, así como una proteína verde
fluorescente (GFP). Liberación de desencadenadores de calcio de la
Luciferina (coelenterazine) de la proteína de enlace de Luciferina. El
sustrato está disponible para oxidación por el luciferase, donde se está
degradado a coelenteramide con una resultante de la liberación de
energía. En la ausencia de GFP, esta energía sería lanzada como un
fotón de luz azul (nm de longitud de onda 482 de emisión pico). Sin
embargo, debido a la GFP estrechamente asociada, la energía
liberada por el luciferase en su lugar se acopla a través de la
transferencia de energía de resonancia con el fluorocromo de la GFP y
posteriormente es liberada como un fotón de luz verde (emisión
máxima longitud de onda 510 nm). La reacción catalizada es:

coelenterazine + O 2 → coelenteramide + CO 2 + fotón de luz
Recientemente se han identificado luciferases más recientes que, a
diferencia de luciferase de Renilla o Firefly, son moléculas secretadas
naturalmente. Un ejemplo es la luciferase de Metridia (MetLuc) que se
deriva de los Copépodos marinos Metridia Longa. El gen de luciferase
secretada de longa Metridia codifica una proteína de 24 kDa, que
contiene un péptido señal secretoras de N-terminal de residuos del
aminoácido 17. La sensibilidad y la alta intensidad de la señal de esta
molécula de luciferase resulta ventajoso en muchos estudios de
reportero. Algunos de los beneficios de la utilización de una molécula
de reportero secretada como MetLuc es su no-vivir de lisis protocolo
que permite a uno poder llevar a cabo en la celula ensayos y varios
ensayos sobre la misma célula
Luciferase pyralidae
firefly luciferase
APLICACIONES
Luciferase puede ser producida en el laboratorio mediante ingeniería
genética para varios propósitos. Los genes de Luciferase pueden ser
sintetizados y insertados en los organismos o transferidos en las
células. Ratones, gusanos de seda y las patatas son pocos los
organismos que ya han sido diseñados para producir la proteína. ]
En la reacción de luciferase, la luz es emitida cuando luciferase actúa
con el sustrato apropiado Luciferina. Emisión de fotones puede ser
detectada por luz en aparatos sensibles tales como un luminometer o
modificando microscopios ópticos. Esto permite la observación de los
procesos biológicos.
En la investigación biológica, luciferase comúnmente se utiliza como
reportero para evaluar la transcripción actividad en las celdas que se
transfieren con una construcción genética que contiene el gen de
luciferase bajo el control de un promotor de interés.Luciferase también
puede utilizarse para detectar el nivel de celulares ATP en estudios de
viabilidad de células o para ensayos de actividad de quinasa Además,
moléculas de proluminescent que se convierten en Luciferina a la
actividad de una enzima particular pueden utilizarse para detectar la
actividad enzimática en junto o ensayos de luciferase de dos pasos.
Estos sustratos se han utilizado para detectar la actividad de la
caspasa y citocromo P450, entre otros.
Toda imagen de animales en vivo o, en ocasiones, ex vivo son una
técnica poderosa para el estudio de poblaciones de células de
animales vivos, tales como ratones. Diferentes tipos de células (por
ejemplo, la médula ósea células, las células T) pueden diseñarse para
expresar un luciferase que permite su visualización no invasiva dentro
de un animal vivo, usando una técnica de este sensible de cargo-par
de dispositivo cámara (cámara CCD) ha sido utilizado para seguir se y
la respuesta de los tumores al tratamiento en modelos animales. Sin
embargo, factores ambientales y a la interferencia terapéutica puede
causar algunas discrepancias entre la intensidad de carga y
bioluminiscencia de tumor en relación con cambios en la actividad
proliferaría. La intensidad de la señal que se mide por la creación de
imágenes en vivo puede depender de varios factores, como la
absorción de D-Luciferina a través del peritoneo, el flujo de sangre, la
permeabilidad de la membrana de la célula, disponibilidad de cofactors, el pH intracelular y la transparencia de las superpuestas de
tejido, además de la cantidad de luciferase.
Luciferase puede utilizarse en los bancos de sangre para determinar si
los glóbulos rojos están comenzando a destruirse. Los investigadores
forense pueden utilizar una solución diluida que contienen la enzima
para descubrir rastros de sangre restante sobre superficies en una
escena del crimen. Luciferase es una proteína sensible de calor que
se utiliza en estudios sobre la desnaturalización de la proteína,
pruebas de la capacidad protectora de proteínas de choque térmico.
Las oportunidades para el uso de luciferase continuarán
expandiendose
GAUSSIA LUCIFERASA SECRETADA COMO UN BIOMARCADOR PARA
SEGUIMIENTO DE PROGRESION TUMORAL Y LA RESPUESTA AL
TRATAMIENTO DE METASTASIS SITEMICA
 Existen pocas técnicas para:
 Cuantificación de metástasis sistémica
 Detectar la colonización metastasica
 Y evaluarlos en tiempo real
 Se investigo:
 Gaussialuciferasse como un biomarcador circulante
 Se monitorio el crecimiento metastasico del tumor y sus
respuestas al tratamiento
1º Desarrollo tumores de pecho primarios y metastasicos con un
derivado de células que expresan Gaussia luciferasse
2º se observo el volumen del tumor primario la [ ] Gaussia luciferase
en sangre y en orina después de la implantación observándose un
crecimiento del volumen del tumos días posteriores
3º En el modelo experimental se encontró metástasis cerebral así
como en hueso y pulmones, se localizo metástasis por BLI.
4º Se utilizo sangre del ensayo de Gaussia luciferase para supervisar
la respuesta con tratamiento con LAPATINIB
SE DEMOSTRÓ
 1ª El ensayo de Gaussia luciferase secretada refleja la cantidad
de celular cancerígenas en tumores primarios como
metastasicos.
 2º Gaussia luciferase sirve como biomarcador, en el ensayo de
Gaussia luciferase en sangre permite la supervisión de la
respuesta del tratamiento en un modelo metastasico.
MARCADORES TUMORALES
Son cualquier sustancia que puede relacionarse con la la presencia o
progresión del tumor, en la practica en los laboratorios de bioquímica
miden la concentración de marcadores que están presente en el
plasma, se le puede aplicar también a sustancias que se encuentran
en la superficie o en el interior de células fijadas en cortes congelados
o con parafina, un marcador tumoral plasmático ha sido secretado o
liberado por las células tumorales, estos marcadorees no son
productos únicos de las células malignas si no que pueden ser
expresados por el tumor en mayor cantidad que las células normales.
Pueden ser hormonas o enzimas
Se usan para el diagnostico,pronostico y detección de una enfermedad
Son sustancias que pueden encontrarse en:
El cuerpo sangre y orina cuando hay presencia de cáncer
Productos de células cancerosas o en respuesta al cáncer
No específicos
 Los marcadores tumorales se usan para detectar, diagnosticar y
manejar ciertos tipos de cáncer. Aunque una concentración
anormal de un marcador tumoral pueda sugerir la presencia de
cáncer, esto, por sí mismo, no es suficiente para diagnosticar el
cáncer.
 Para algunos tipos de cáncer, las concentraciones de los
marcadores tumorales reflejan el estadio (etapa o extensión) de
la enfermedad.
El marcador normalmente es identificado al combinar la sangre u orina
con anticuerpos sintéticos que reaccionan con la proteína del
marcador tumoral.
USO DE LOS MARCADORES TUMORALES
ALGUNOS DE LOS MARCADORES TUMORALES
El primer marcador tumoral moderno usado para detectar el cáncer fue
la gonadotropina coriónica humana (HCG), la sustancia que los
médicos observan en las pruebas de embarazo. Un nivel alto de HCG
en la sangre puede que indique la presencia de un cáncer de la
placenta llamado neoplasia trofoblástica del embarazo (GTD, por sus
siglas en inglés).
 Antígeno carcinoso CA 15.3:(Se asocia a cáncer de mama)
 Antígeno carcinoso CA 125:(se asocia al cáncer ovárico)
 Antígeno específico de la próstata (PSA):(producido por
células epiteliales de la próstata)
 La alfafetoproteína (AFP)( normalmente solo se produce en
el feto cuando aparece en adulto es marcador tumoral
CARACTERISTICAS DE LA BIOLUMINISCENCIA
 Es una técnica usada en la ingeniería de tejidos, básicamente es
aplicable en ensayos en vivo.
 La bioluminiscencia es parte de técnicas ópticas de imagen, al
igual que la fluorescencia.
Muchos organismos emiten luz entre 440 y 479nm
Usos
 Detectar la cantidad de ATP presente en una superficie.
 Determinación de higiene por ATP-Bioluminiscencia utilizada en
cualquier tipo de industria de Alimentos (Lácteos, Bebidas,
Productos Cárnicos, Comidas Preparadas, etc).
 Determinar presencia de virus en una célula.
 Diversos campos como: microbiología, ingeniería genética, etc.
 Ver como se diseminan las células cancerosas.
Identificar tumores. Por ejm tumor hepático
Ventajas
 Rapidez en la obtención de los resultados: lectura de resultados
en segundos.
 Instrumental de fácil manejo: equipos portátiles.
 Técnica sencilla: hisopado de superficies.
 Elevada Sensibilidad: Detección de muy bajos niveles de ATP.
 Prevención de fallas mayores: permite llevar a cabo acciones
correctivas.
Desventajas
 Costo elevado de los equipos.
 Resultados se presentan en una escala arbitraria que es difícil
de aceptar por los microbiólogos acostumbrados a obtener
resultados exactos como unidades formadoras de colonias
(UFC).
 No indica presencia de patógenos sólo la presencia de ATP.
Los compuestos químicos tales como detergentes y desinfectantes
pueden interferir en la reacción
EXPERIMENTO
 Animales: Ratones
 Anestésicos: Ketamina/Xilazina
 Líneas Celulares y cultivo celular.
 Suero fetal bovino al 10%
 Penicillinstreptomycin al 1%
 Solución de EDTA al 20%
Para este procedimiento:
a)Se utilizó el modelo de mama ortotopico.
El cual consiste en la implantación de células cancerigenas en el
tejido graso de los ratones( Región mamaria ).
b)El modelo experimental de metástasis sistémica
Se aplicó una inyección intracardiaca
a ratones de 6-7 semanas de edad.
PROCEDIMIENTO DE GAUSSIA LUCIFERASA
En el caso de las muestras de sangre y orina.
Se extrajo sangre directamente de las venas de las colas de los
ratones . Y la orina fue recolectada directamente de la uretra
Tratamiento
Se utilizó el medicamento Lapatinib.(evita que proliferen las células
cancerosas)
Administración por sonda oral.
Técnica de bioluminiscencia
Cuantificación de tumor viable
Se utilizó la tinción de H&E.
La sección manchada de los tumores fue analizada donde se
aprecio secciones histológicas necróticas del tumor viable
Tratamiento
Se utilizó el medicamento Lapatinib.
Administración por sonda oral.
Técnica de bioluminiscencia
El LAPATINIK
 El lapatinib es un inhibidor de la kinasa 4-anilinoquinazolina, con
un mecanismo único de acción, ya que es un potente inhibidor
selectivo y reversible de los dominios intracelulares de tirosina
kinasa, tanto de los receptores EGFR (ErbB1) como del gen
HER2+/neu (ErbB2).
 La estimulación de los receptores EGFR (ErbB1) y HER2
(ErbB2) está asociada a la proliferación celular y a múltiples
procesos involucrados en la progresión del tumor, invasión y
metástasis. El lapatinib Actúa sobre la componente intracelular
de los receptores antes citados.
CONCLUSIONES
1.-Se concluye que el experimento se basa en la modificación de los
genes para que se produzca la luciferasa que funciona como un
indicador de las células cancerosas y la cual se mide en orina al medir
uno de los productos que se libera de la reacción de la luciferasa con
la luciferina
2.-Tambien se toma en cuenta el lapatinib que es un medicamento
que ayuda a combatir el cáncer y al reducirse las células cancerosas
también se reducen las células que producirían luciferina y por
consecuencia a nivel de orina ,el producto liberada de la reacción de la
luciferina con la luciferasa se reduciría ,lo cual seria un indicador de
que se combate al cáncer y de que el medicamento surte efecto
3.-Con este estudio de investigación se demostró que la Gaussia
luciferasa refleja con exactitud la cantidad de células cancerosas
viables en los tumores primarios y metastasicos.
4.-Se puede emplear para seguir la progresión de un tumor
metastasico.
5.-Y como biomarcador para la respuesta tumoral a los tratamientos
Gaussia luciferasa
FUENTES
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