TERAPIA GENICA EN TUMORES ENDOCRINOS Fabián Pitoia 1 INDICE.............................................................................................................. Página 2 Resumen.............................................................................................................. Página 4 Introducción........................................................................................................ Página 5 Capítulo 1: Sistemas de vectores para terapia génica......................................... Página 7 - Sistemas virales..................................................................................... Página 7 - Retrovirus ............................................................................. Página 7 - Adenovirus............................................................................. Página 8 - Virus herpes simplex............................................................. Página 10 - Vaccinia virus........................................................................ Página 11 - Virus adenoasociados............................................................ Página 12 - Sistemas no virales............................................................................... Página 13 - Liposomas............................................................................. Página 13 - ADN “desnudo”.................................................................... Página 13 - Targeting transcripcional..................................................................... Página 14 Capítulo 2: Estrategias para la terapia génica.................................................... Página 15 - Terapia génica correctiva..................................................................... Página 15 - Terapia génica antiangiogénica............................................................ Página 17 - Terapia génica suicida.......................................................................... Página 19 - Terapia génica inmunomoduladora...................................................... Página 19 - Terapia génica combinada.................................................................... Página 20 Capítulo 3: Empleo actual de la terapia génica en los tumores endocrinos....... Página 21 - Empleo de la terapia génica en carcinoma tiroideo............................. Página 21 - Reeplazo del gen supresor tumoral p53............................... Página 21 - Terapia génica suicida......................................................... Página 22 2 - Inmunoterapia con IL-2 en tumores tiroideos..................... Página 24 - Terapia génica usando el simporter yoduro/sodio............... Página 25 - Inmunización genética: calcitonina..................................... Página 26 - Terapia antisense................................................................. Página 27 - Estrategias de terapia génica para el tratamiento de tumores hipofisarios - Uso de genes activantes de prodrogas................................. Página 28 - Uso de genes supresores de tumor...................................... Página 28 - Uso de genes que regulan el ciclo celular........................... Página 28 - Factores de crecimiento y sus receptores involucrados en la regulación de la angiogénesis............................................. Página 31 - Terapia génica en tumores adrenales................................................. Página 32 Conclusiones.................................................................................................... Página 34 Tabla I: Vectores virales para la terapia génica tumoral................................. Página 35 Tabla II: Estrategias para la terapia génica..................................................... Página 36 Figura 1: Ciclo de vida de los retrovirus......................................................... Página 37 Figura 2: Ciclo de vida del adenovirus........................................................... Página 38 Figura 3: Terapia génica “suicida” ................................................................ Página 39 Figura 4: Ciclo de vida de los virus adenoasociados...................................... Página 40 Figura 5: Inyección de vectores adenovirales dentro de las células tumorales GH3 en ratones....................................................................... Página 41 Referencias..................................................................................................... Página 42 3 RESUMEN La terapia génica puede ser definida como la introducción de ácidos nucleicos dentro de las células con el objetivo de mejorar o curar una enfermedad. Inicialmente los paradigmas de la terapia génica focalizaron su atención en enfermedades causadas por alteraciones en un único gen. Con los avances recientes en la tecnología, la terapia génica se ha transformado en realidad, con más de 2100 pacientes recibiendo esta opción terapéutica en estudios clínicos controlados. Hasta la actualidad no hay resultados publicados sobre resultados en pacientes con tumores endocrinos y la totalidad de los estudios se llevaron a cabo in vitro o en animales de laboratorio. Existen dos métodos principales para la transferencia de genes terapéuticos dentro de células tumorales: usando vectores virales y no virales. Los vectores virales incluyen retrovirus, virus herpes simplex tipo 1, adenovirus, virus adeno asociados y lentivirus mientras que los vectores no virales incluyen a los liposomas y al ADN desnudo. La mayoría de los estudios realizados han demostrado resultados alentadores con respecto al tratamiento de tumores endocrinos, principalmente en carcinomas tiroideos, tumores hipofisarios y carcinoma adrenal; sin embargo, esta intervención molecular todavía no se encuentra disponible para ser considerada como una opción terapéutica en este tipo de neoplasias. Esta revisión remarca los principios de la terapia génica, describe en detalle los tumores que pueden ser candidatos ideales para su uso, así como también las intervenciones terapéuticas que han sido realizadas y las limitaciones y problemas que todavía permanecen por resolver. 4 INTRODUCCION: El cáncer es, básicamente, una enfermedad de los genes. La pérdida, mutación o alteración de genes que codifican moléculas involucradas en la regulación del crecimiento y diferenciación es el hecho inicial que determina el desarrollo de una gran parte de las neoplasias. Ejemplos de esto lo constituyen la activación de genes promotores del crecimiento, protooncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores. Hay componentes hereditarios que afectan de diversas formas según el tipo de neoplasia. De todas maneras, la mayoría de las mutaciones relacionadas con el cáncer son somáticas, es decir, exclusivas de uno o más tejidos, sin afectar a la línea germinal. Por lo tanto, ciertos factores ambientales como carcinógenos químicos o radiaciones pueden ejercer su influencia. También se ha establecido que, en la mayoría de los casos, el cáncer es una enfermedad multigénica y que, más de un gen debe estar alterado para que se produzca la transformación maligna y se establezca un crecimiento invasivo. La terapia génica puede definirse como la modalidad terapéutica en la cual el material genético es introducido dentro de las células para modificar la función de la misma. Las enfermedades que resultan de la herencia de un solo gen mutado, teóricamente, presentan la mayor posibilidad para una terapia génica exitosa. Pero el cáncer resulta de una acumulación de mutaciones. Algunas pueden ser heredadas en la línea germinal y otras son adquiridas en oncogenes y genes supresores tumorales. De todas maneras, todavía no han sido identificadas todas las alteraciones genéticas responsables en el desarrollo de las neoplasias, por lo tanto el reemplazo de los genes alterados para tratar al cáncer parece ser una tarea desalentadora, por el momento. Revisaremos las estrategias actuales en la terapia génica de los tumores endocrinos. Estos enfoques están basados en estudios sobre modelos in vitro o modelos 5 animales. Aunque la mayoría se encuentra en fase pre-clínica, algunos ya se emplean en ensayos clínicos. En primera instancia, analizaremos cuáles son los vehículos que permiten la entrada de estos genes dentro de las células tumorales, posteriormente veremos cuáles son las diferentes estrategias para lograr una terapia génica exitosa, para finalmente detenernos en los resultados de los diferentes ensayos, de acuerdo a las distintas neoplasias endocrinas. 6 CAPITULO 1: SISTEMA DE VECTORES PARA TERAPIA GENICA: En la Tabla I se describen los vehículos con las ventajas relativas y desventajas de cada sistema. Es necesario aclarar que cada sistema puede ser elegido según el tipo de tumor a tratar, como veremos más adelante. SISTEMAS VIRALES Retrovirus: Estos vectores son virus de cadena simple de ARN incompetentes para la replicación, que se producen mediante el reemplazo de genes críticos retrovirales para la replicación ( gag, pol, env) por los genes terapéuticos deseados para la transferencia. Para obtener altos títulos de vectores retrovirales para aplicaciones experimentales o terapéuticas en humanos, el vector ha sido diseñado por ingeniería genética para producir proteínas virales que son necesarias para impedir la formación de partículas replicativas-defectivas virales. Como consecuencia se producen vectores que pueden transmitir genes terapéuticos pero que no pueden replicarse en las células blanco. Desde su primera descripción (1), los vectores retrovirales se han transformado en el sistema más utilizado en protocolos de investigación. El genoma retroviral contiene aproximadamente 10000 pares de bases ( 10 Kb) de ADN. La integración estable de los genes transportados por el retrovirus en el genoma de la célula huésped resulta en una expresión a largo plazo, excediendo un año en algunas publicaciones (2). Los vectores retrovirales se traducen solo en células que se encuentran en división, lo que los hace útiles para el tratamiento de las neoplasias. 7 El vector retroviral más comúnmente usado es el virus de la leucemia murina Moloney (Mo-MLV) (3). Después de que el mismo se une a su receptor extracelular (Fig.1), se produce la internalización y permite la liberación del cápside-core en el citoplasma; una vez ahí, la cadena simple de ARN viral es transcripta en forma reversa en una doble cadena de ADN proviral, finalmente es transportado al núcleo donde se integra de manera aleatoria al genoma celular. Hay que considerar algunas características antes de seleccionar a un retrovirus para terapia génica. Primero, la integración del vector en el genoma de la célula huésped es un proceso que sucede al azar. De acuerdo a esto, esta inserción aleatoria podría resultar en una mutagénesis tras la inserción que pudiera producir la activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores. De todas maneras, hasta el momento, no existen publicaciones de transformación maligna como consecuencia del uso de estos vectores en humanos. Segundo, la producción a gran escala de vectores retrovirales necesaria para el tratamiento in vivo de tumores sólidos, podría resultar en la generación de retrovirus con capacidad de replicación o infección. Los lentivirus son retrovirus complejos que tienen la capacidad de infectar y expresar sus genes en células mitóticas y post-mitóticas. El más conocido es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Luego de la extracción de las partículas infectantes y replicativas este vector derivado es transfectado (4). El sistema de vectores lentivirales tiene todas las ventajas del Mo-MLV pero además posee la habilidad de transfectar células pos mitóticas, como es el caso de las neuronas (5,6). Adenovirus (AV): El uso de vectores adenovirales ha presentado un crecimiento importante en los últimos años debido a: (i) su gran capacidad para transportar grandes cantidades de 8 ADN, (ii) la posibilidad de lograr transferencias in vivo en una amplia variedad de células, ya sean benignas (7-9) o malignas (10,11), (iii) la habilidad del adenovirus para infectar células que se dividen y también a las que no lo hacen y (iv) la facilidad en la producción del vector. Los AV son virus de doble cadena de ADN que muestran tropismo para el epitelio respiratorio, la córnea y el tracto gastrointestinal. Luego de la transfección, la expresión del gen decrece rápidamente, en general en no más de 4 semanas. Además, estos virus no se integran al genoma de la célula blanco (Fig. 2). El proceso de entrada del virus a la célula es iniciado por su unión a una proteína de membrana denominada receptor de cocksakie y AV (CAR) (12). Posteriormente, se produce la internalización al citoplasma. Una disminución progresiva en el pH del endosoma causa un cambio conformacional de las proteínas de la cápside del virión y esto resulta en la liberación de la cápside viral en el citoplasma. De ahí, la cápside sigue su camino hasta el núcleo en dónde comienza la replicación. Unas de las desventajas de los AV es que estos vectores son altamente inmunogénicos (13), lo que hace que su nueva administración sea menos efectiva a medida que se desarrolla esta respuesta inmune. Actualmente, se han desarrollado nuevos vectores adenovirales que resultan menos inmunogénicos (14). Los AV han sido usados en forma experimental para el tratamiento de una gran variedad de tumores endocrinos. Por ejemplo, se ha demostrado su habilidad para transfectar células hipofisarias normales y neoplásicas (15), y se ha utilizado un AV expresando la proteína Rb para el tratamiento in vivo de tumores hipofisarios en ratones Rb +/- (16). Así también, se pudo demostrar la utilidad de este vector para el tratamiento in vitro de líneas celulares de carcinoma medular tiroideo (17) y carcinoma de próstata (18), entre otros. 9 Por lo tanto, los vectores adenovirales tienen muchas ventajas, dentro de las que se incluyen: la posibilidad de infectar una gran variedad de células, infectar células en división y células que no se dividen, alta eficiencia de transfección, ausencia de integración al genoma celular del huésped y fácil manipulación. Las desventajas son: el corto tiempo de duración de la expresión transgénica y la inmunogenicidad (Tabla I). Virus Herpes Simplex: Los virus herpes poseen varias propiedades biológicas interesantes, incluyendo la capacidad de causar una variedad de infecciones clínicas, permanecer latentes en tejidos específicos y de ser reactivados en el sitio de infección original. Hay más de 80 miembros de la familia herpesvirus que incluyen el virus herpes simplex tipo 1 (VHS1), tipo 2 (VHS-2) y varicela-zóster. La mayoría de los vectores para terapia génica han sido desarrollado de cadenas de VHS-1. Este es un virus encapsulado de doble cadena de ADN con un genoma de 152 Kb que codifica para más de 80 genes (19). Una de las propiedades de estos virus que los hace útiles para la terapia génica es la expresión de la enzima timidina kinasa (TK). Esta enzima monofosforila a la prodroga ganciclovir (GCV), que luego continua siendo monofosforilada por las enzimas celulares a GCV trifosfato, el metabolito activo que inhibe la síntesis de ADN (20). El GCV es una prodroga no tóxica para las células de los mamíferos, a menos que estas expresen al gen TK del VHS-1. La transfección de genes "suicidas" VHS1-TK dentro de las células tumorales seguido por el tratamiento con esta prodroga, es otra de las estrategias usadas para el tratamiento de tumores endocrinos, como veremos más adelante. El VHS-1 expresa a la enzima TK durante su ciclo replicativo y permite la actividad antitumoral tras la adición de GCV (Fig. 3). Esta terapia "suicida" tiene otra 10 característica que la convierte en una opción interesante al momento de elegir un vector y es el hecho del denominado “efecto espectador” (bystander effect) (21), por el cual aún las células tumorales vecinas que no fueron transfectadas con el virus mueren tras la administración del GCV. La exposición a esta droga, luego de la trasducción celular con el gen VHS1-TK resulta en la monofosforilación en células que expresan el gen viral. En contraste, la TK endógena no fosforila al GCV. La exposición de las células huésped a esta droga conduce a su muerte y el transporte de los metabolitos tóxicos de la prodroga a través de las uniones estrechas, resulta en la muerte de células adyacentes mediada por el "efecto espectador"( Fig. 3). Por otro lado, la clave para lograr una terapia génica "suicida" exitosa es restringir la expresión del gen a determinadas poblaciones celulares a través del uso de promotores específicos, como veremos mas adelante. Esto es muy importante, ya sea, en el tratamiento de una enfermedad sistémica, como por ejemplo el cáncer metastático, y en el tratamiento local, evitando la expresión de la enzima TK al mínimo en las células no tumorales. Varios tipos específicos celulares se han explorado usando este enfoque, incluyendo el uso de antígeno carcinoembrionario para el cáncer de colon el antígeno prostático específico para el cáncer de próstata carcinoma de mama (24), (23), (22), el DF3/MUC1 en el la scc/11Bhidroxilasa en carcinoma adrenal (25), y el promotor de TG en cáncer tiroideo (26). Todas estas propiedades biológicas del VHS1-TK, así como el potencial para poder planear distintos enfoques según el tipo tumoral, hacen de este virus un vector ideal para la terapia génica. Vaccinia virus: 11 El virus vaccinia pertenece al grupo poxvirus. Se aisló originalmente de un caballo. Al igual que el VHS, posee una gran cadena doble de ADN que contiene 186 Kb. Se replica en células en división y en las que no lo hacen y su acción deletérea se produce luego de la replicación en el citoplasma de las células infectadas, permaneciendo en ese lugar hasta que la célula es destruida. Por lo tanto hay escaso riesgo de recombinación de su material genético con el de la célula blanco. El virus vaccinia es un buen candidato para terapia génica debido a que: i) es de muy simple construcción; ii) infecta a una gran variedad de células y; iii) posee una alta habilidad para producir altos títulos virales. Este virus ha sido usado con éxito en experimentos in vitro para tratamiento de melanomas (30) y cáncer de colon (31). Virus adeno-asociados: Estos son virus pequeños, lineales, de cadena simple de ADN, que contienen escasos genes virales, resultando en la dependencia de otros virus "adyuvantes" como adenovirus, virus vaccinia o herpesvirus, que le proveen las proteínas requeridas para completar su ciclo celular (Fig. 4). En forma similar a lo que sucede con los retrovirus, se integran en el genoma de la célula huésped, pero esta integración difiere en 2 puntos específicos: i) los virus adeno-asociados son integrados en el cromosoma 19 en un proceso no aleatorio, por lo tanto, esto reduce el riesgo de mutagénesis insercional comparado con los retrovirus, ii) estos vectores pierden su habilidad de integrarse con el tiempo, pero continúan expresando el transgénico desde una localización cromosómica por hasta 10 meses. La versatilidad que presentan estos vectores para la terapia génica del cáncer fue demostrada recientemente por el desarrollo de virus específicos que expresan a la VHSTK en células que producen alfafetoproteína (29). 12 SISTEMAS NO VIRALES: Liposomas: Al mezclar una solución lipídica con un ADN plasmídico, esto resulta en la internalización del ADN en una bi-capa lipídica y en la formación de un liposoma, que es capaz de transportar el ADN a una variedad de tipos celulares. Los liposomas llevan el ADN al citoplasma, a través de la fusión de su membrana con la de la célula blanco. Finalmente el ADN plasmídico sigue una localización nuclear donde se expresa de manera transitoria. La transferencia de genes por liposomas es menos eficiente que la que ocurre con los retrovirus y además no es específica. Varios intentos de mejorar la especificidad de los liposomas han incluido el uso de glucolípidos que tienen una dirección específica hacia el hepatocito (30) y el uso de liposomas catiónicos que están ligados a anticuerpos monoclonales específicos (31). ADN desnudo: Wolff y col. (32) fueron los primeros autores en demostrar que los genes pueden ser expresados a nivel celular, luego de la inyección directa dentro del músculo esquelético. Aunque el ADN plasmídico no se integra en el genoma del huésped, la expresión del transgénico puede continuar por mucho tiempo (33). Se han sugerido varias posibilidades para incrementar la eficiencia de la transferencia génica vía utilización de ADN desnudo, entre las que se incluye la electroporación (34). Esto permite que el ADN penetre directamente la membrana celular y evite la degradación enzimática lisosómica. Recientemente, se demostró que los polímeros que actúan débilmente con el ADN, pueden mejorar la eficiencia de transferencia génica luego de la inyección directa intramuscular (35). 13 Estos polímeros protegerían al ADN de la degradación enzimática y podrían servir como un sistema de depósito a partir del cual se liberaran en un período prolongado. TRANSCRIPCION SELECTIVA (“transcriptional targeting”) El principio del “transcriptional targeting” es que ciertos promotores pueden restringir la expresión génica a una población de células en particular, por lo tanto usando este enfoque, el transporte de genes desde un vector viral puede ser diseminado pero la expresión génica ocurrirá solo en un tipo celular predeterminado, debido a un control ejercido a nivel transcripcional. Se han usado promotores específicos con vectores adenovirales para guiar la expresión en determinadas células de la glándula pituitaria, usando al promotor de la PRL (36,37), o al promotor de GH (38). Otros promotores utilizados para terapia génica hipofisaria fueron el de la proopiomelanocortina (39), el de la tirotrofina (40) o el del receptor de GnRH (41). También este enfoque ha sido usado para la terapia de tumores pancreáticos con promotores de somatostatina (42), amilasa (43) y de proglucagon (44) y para el tratamiento de tumores adrenales malignos (promotor scc/11B Hidroxilasa)(25) o tiroideos (promotor de TG) (26). 14 CAPITULO 2: ESTRATEGIAS PARA LA TERAPIA GENICA: Hemos hablado previamente de los diferentes vectores para la terapia génica. Ahora haremos una revisión de los diferentes enfoques terapéuticos usados para el tratamiento de tumores endocrinos, que pueden ser divididos en 4 categorías (45,46) (Tabla II): i) transferencia de genes con efecto directo antitumoral (incluyendo oligonucleótidos antisense o ribozimas para inhibir oncogenes, introducción de genes supresores de tumores, o de genes con efecto antiangiogénico); ii) transferencia de genes que activan prodrogas tóxicas ( referida previamente); iii) transferencia de genes que incrementan la respuesta inmune contra el cáncer ( ya sea por modificaciones genéticas de las células tumorales o a través de células inmunes efectoras) y, finalmente, iv) transferencia de genes que disminuyen la toxicidad de la quimioterapia, tal como el gen de resistencia a multidrogas MDR1. Terapia génica correctiva: La mayoría de las anormalidades endocrinas consisten en la pérdida de genes supresores de tumores o en la activación de protooncogenes. Los genes supresores de tumores regulan la transcripción y proliferación celular, y es necesaria la inactivación de ambas copias del gen para que aparezca una proliferación celular descontrolada. Entonces, el agregado de una copia correcta del gen supresor de tumor en células con una pérdida de función homocigota podría restaurar un crecimiento normal o podría inducir a la apoptosis a las células tumorales. Por el contrario, sólo una mutación, es decir heterocigota de un protooncogen, es suficiente para la transformación maligna de una célula. Los oligonucleótidos antisense, las ribozimas y los anticuerpos intracelulares de cadena simple se pueden usar para disminuir la expresión de oncogenes. La terapia génica antisense con el uso de oligonucleótidos produce una 15 supresión de la expresión de genes dañinos. Estos oligonucleótidos antisense son pequeñas cadenas de ADN (no mayor a 20 nucleótidos) o ADN modificado que contiene una secuencia complementaria a un ARN blanco. Al unirse al ARN (annealing), interfiere con su transporte, corte (splicing), y traslación. En algunos casos esta unión forma un sustrato para las ARNasas celulares. Para la introducción de estos oligonucleótidos se han usado vectores virales y no virales. La inhibición de ciertos genes blanco también se puede llevar a cabo con las ribozimas. Estas son moléculas catalíticas del ARN que reconocen su ARN blanco en una secuencia específica y producen la lisis de la cadena de ARN. Algunos tumores, tales como los de mama y próstata, han sido tratados usando oligonucleótidos antisense o ribozimas. Por ejemplo, se sabe que los factores de crecimiento insulíno-símiles son factores mitógenos importantes para una variedad de tumores endocrinos y no endocrinos (47). Se ha usado con éxito una estrategia antisense del receptor de IGF1, en líneas celulares de carcinoma de mama (48) y próstata (49), y también se los ha usado para escindir el ARNm del receptor de andrógenos y estrógenos (50), los cuáles juegan un rol preponderante en el cáncer de próstata y mama, respectivamente. El ciclo celular posee varios genes blanco para la terapia génica correctiva. Ejemplos de esto lo constituye el gen supresor de tumor p53 que se encuentra mutado en una gran variedad de tumores, fundamentalmente aquellos con comportamiento agresivo como el carcinoma anaplásico de tiroides (51). La re-introducción de una copia normal en líneas celulares de carcinoma anaplásico de tiroides ha sido utilizado con éxito por varios grupos y la combinación de la funcionalidad de esta proteína anteriormente ausente en estas líneas, asociada a quimioterapia y radioterapia resultó en un efecto citotóxico incrementado para estos tumores (52-54). 16 Otro gen supresor de tumor del ciclo celular que es considerado como un blanco para esta terapia es el Rb, que codifica para la proteína p105Rb, que es uno de los reguladores más críticos del ciclo celular. Cuando la proteína del Rb no está fosforilada, es responsable de la detención del ciclo por inhibición de la actividad de la familia de factores de transcripción E2F. La activación del ciclo requiere de la inactivación del Rb a través de la fosforilación por kinasas ciclino dependientes. El Rb está inactivo en los retinoblastomas, en el 90 % de los carcinomas de células pequeñas de pulmón, en los carcinomas paratiroideos y en una variedad de tumores malignos. Por ejemplo, los ratones con una única copia normal del Rb (rb ) desarrollan tumores melanotropos del lóbulo intermedio hipofisario y en algunos casos, carcinoma medular tiroideo e hiperplasia de la médula adrenal (55). La transferencia intratumoral de Rb en estos ratones determinó una disminución en la proliferación celular tumoral hipofisaria con restablecimiento de la inervación por las neuronas dopaminérgicas reguladoras del crecimiento, asociado a una mayor sobrevida comparada con los controles no transfectados (16). Terapia génica antiangiogénica: El crecimiento tumoral y de las metástasis es dependiente de la habilidad de las células tumorales para establecer un aflujo sanguíneo a través del proceso de neoangiogénesis. Este complejo proceso está estimulado por numerosos factores, como por ejemplo: el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la interleukina 8 (IL-8); otros factores actúan como inhibidores de la angiogénesis, ejemplo: trombospondina 1, factor plaquetario 4 (FP4), angiostatina y endostatina. 17 La terapia antiangiogénica considera como blanco a diferentes pasos del proceso de angiogénesis, ya sea a través de la inhibición de la expresión de moléculas angiogénicas, por medio de la sobreexpresión de moléculas antiangiogénicas o mediante destrucción de las células endoteliales tumorales. Esto último puede conducir a la regresión tumoral debido a apoptosis (56). Los ensayos actuales están dirigidos principalmente a: i) suprimir la expresión de factores angiogénicos con oligonucleótidos antisense o ribozimas y ii) transferir genes que alteren a los receptores para los factores angiogénicos o que codifiquen para moléculas antiangiogénicas (57). Sin embargo, el uso de esta modalidad, a menudo resulta en una supresión incompleta del crecimiento tumoral y de las metástasis. Esto probablemente podría solucionarse si se utilizara una terapia génica combinada (antiangiogénica asociada a terapia "suicida"). En los tumores endocrinos, la angiogénesis demostró jugar un rol principal en la proliferación celular y en la secreción hormonal, así, las neoplasias tiroideas evidencian un incremento en la expresión de factores angiogénicos, incluyendo el VEGF (58), y la angiopoyetina 2, y de receptores tirosina kinasa. La sobreexpresión de angiopoyetina 2 y de VEGF se asocia con una progresión de los tumores tiroideos desde una fase prevascular hacia una netamente vascular. Más aún, los carcinomas tiroideos con diseminación linfática, evidencian una mayor expresión de VEGF y los que presentan un comportamiento más agresivo, muestran una disminución en la producción de trombospondina 1 (59). La supresión antisense de la expresión de VEGF en un carcinoma anaplásico tiroideo condujo al desarrollo de un tumor pequeño y pobremente vascularizado in vivo (60). Otros tumores endocrinos pueden resultar en blancos ideales para la terapia antiangiogénica. Por ejemplo, la angiogénesis juega un rol principal en el desarrollo de 18 la glándula adrenal y en la proliferación de tumores adrenocorticales (61) y los feocromocitomas malignos, asi como los paragangliomas, muestran un incremento de la microvasculatura intratumoral (62). Estos tumores podrían ser, entonces, candidatos para este tipo de tratamiento, aunque no hay trabajos hasta el momento que demuestren esta hipótesis. Terapia génica suicida: Este punto fue desarrollado previamente cuando describimos al vector VHS1TK. Terapia génica inmunomoduladora: Uno de los métodos utilizados es la modificación genética de las células tumorales para que expresen diferentes citokinas (ejemplos: IL-2, IL-12, factor estimulante de la colonia granulocítica-macrofágica o IFN ) que son factores quimiotácticos para las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas y los macrófagos, y factores activadores de la respuesta inmune por los linfocitos T. Otro enfoque involucra el uso de vectores que induzcan la expresión de antígenos asociados a tumores (vacunas). Las vacunas recombinantes pueden ser ADN virales, bacterianos o ADN "desnudo". Estos últimos, que pueden persistir y expresar genes codificados durante largos períodos luego de la inyección intramuscular, han demostrado mediar los dos tipos de respuesta inmune, humoral y celular, contra determinados productos codificados en los genes (63). La terapia génica inmunomoduladora demostró resultados interesantes en un modelo de carcinoma medular tiroideo in vitro e in vivo. La infección in vitro de líneas celulares de carcinoma medular murino con un vector adenoviral que transportaba al gen IL-2 generó una respuesta inmunológica en el ratón singénico BALB/C. In vivo, la inyección 19 intratumoral del vector adenoviral resultó en el rechazo y/o estabilización de los tumores, sin toxicidad significante observable en otros órganos (17,64). Terapia génica combinada: Esta nueva estrategia, que combina dos modalidades terapéuticas diferentes, como lo es la terapia "suicida" con la inmunomoduladora, ha sido usada con éxito en experimentos in vitro en líneas de carcinoma tiroideos. En un póster presentado en el 81er encuentro anual de la Endocrine Society en 1999 (65), se comunicó el uso del gen del VHS1-TK asociado al gen de la IL-2 , separados por un sitio de entrada para los ribozomas que permitiera la expresión simultánea de los 2 genes del mismo transcripto. Todo esto fue clonado en un vector retroviral. Posteriormente agregaron al mismo, el gen del promotor de la tiroglobulina (TG) para dirigir la terapia a las células tiroideas en forma específica. Los resultados in vitro demostraron una muerte selectiva de las células tiroideas luego del tratamiento de los cultivos con GCV y además hubo un aumento en la secreción de IL-2 al medio. Este enfoque combinado, empleando citokinas y genes "suicidas" a nivel intratumoral, parece ejercer un efecto antineoplásico incrementado in vivo, como fue observado en un modelo de ratón con carcinoma medular tiroideo, al cual se le inocularon ambos genes (VHS1-TK e IL-2) (66). 20 Capitulo 3: EMPLEO ACTUAL DE LA TERAPIA GENICA EN LOS TUMORES ENDOCRINOS: EMPLEO DE TERAPIA GÉNICA EN EL CÁNCER DE TIROIDES: - Reemplazo del gen supresor de tumor p53: El p53 es una proteína que, en condiciones normales, actúa como un supresor tumoral. Se trata de un factor de transcripción que "vigila" la integridad del genoma. Si el ADN genómico sufre mutaciones, por ejemplo, por efecto de radiaciones ionizantes, agentes quimioterápicos o hipoxia, el p53 detiene el ciclo celular para permitir la reparación del ADN dañado. Si el daño es demasiado severo y las alteraciones del ADN no son posibles de resolver, el p53 induce a la apoptosis para erradicar a la o las células con alteraciones genómicas para prevenir su proliferación. El p53 es la proteína más frecuentemente afectada en las neoplasias humanas (en casi el 40 % de los tumores). Habitualmente un alelo presenta una deleción y el otro se encuentra mutado, lo que contribuye a la progresión tumoral con malignidad creciente y disminución en la diferenciación. Esto es aplicable también para el cáncer tiroideo. Este factor de transcripción se encuentra intacto en la glándula tiroides normal, en las enfermedades tiroideas benignas o en los carcinomas diferenciados pero hay una alta prevalencia de mutaciones del p53 en los tumores tiroideos indiferenciados (casi del 80 % para carcinomas anaplásicos insular (67). (51) y en cerca del 40% para carcinomas foliculares variedad Las mutaciones del p53 parecen ser un evento tardío en los carcinomas tiroideos. Este rol preponderante en la patogénesis de los tumores tiroideos lo ha transformado en un blanco ideal para la terapia génica. En 2 estudios, en los cuales se usaron líneas de carcinoma tiroideo con mutaciones del p53, se demostró que la reintroducción del gen normal (wild type) del p53 causó un fenotipo más diferenciado. En 21 estos trabajos se puso en evidencia el incremento de la expresión de marcadores específicos de diferenciación como la tiroperoxidasa, la TG y el receptor de TSH, todo esto asociado a una inhibición en la proliferación celular (52,53). De acuerdo a lo que se sabe con respecto a la función del p53, su re-expresión en un tumor p53 deficiente podría incrementar la sensibilidad a la radiación o a la quimioterapia. Narimatsu y col. (68) no detectaron un efecto sensibilizante a los quimioterápicos cisplatino, 5-fluoruracilo y doxorrubicina luego de transfectar una línea de carcinoma anaplásico. Sin embargo, Nagayama y col. (54) posteriormente evaluaron la eficacia terapéutica de la transfección mediada por AV del gen p53 en líneas de carcinoma anaplásico con mutaciones del p53 y observaron que la re-expresión del p53 condujo a la muerte celular por apoptosis. Los estudios in vivo (realizando xenotransplante de células tumorales a ratones), demostraron un aumento de la muerte celular tras la administración de doxorrubicina (4 mg/kg, 3 veces por semana). Estos estudios indican que esta estrategia parece ser un arma eficaz dentro de las opciones disponibles para terapia génica de estos tumores, particularmente cuando se combina con quimioterapia. - Terapia génica "suicida": Nishihara y col (69) transfectaron 2 líneas celulares de carcinoma tiroideo (WRO y FRO) con el VHS1-TK bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV), usando un vector retroviral y observaron una disminución, tiempo y dosis dependiente, de la sobrevida celular luego del tratamiento con GCV, asociada a un incremento en la apoptosis. Las dosis bajas de GCV no produjeron daño por sí mismas, pero resultaron en una sensibilización frente a las radiaciones ionizantes. Para minimizar los efectos en otros órganos, la actividad enzimática TK debería, como analizamos previamente, estar circunscripta a los tejidos blanco. Esto se podría lograr 22 realizando la inyección a nivel intratumoral, pero esta estrategia excluiría a las metástasis diseminadas del efecto citotóxico. Braiden y col. (70) usaron un retrovirus recombinante que transportaba a la TK bajo el control del promotor de la TG. Con este vector, ellos transfectaron a la línea diferenciada de tirocitos FRTL-5, a la línea celular maligna derivada de éstas, FRTC, y a la línea de carcinoma anaplásico FRO. Detectaron un incremento 130 y 160 veces mayor con respecto a la sensibilidad al GCV y, 4 y 27 veces mayor, tras el agregado o la ausencia de TSH en las líneas celulares FRTL-5 y FRTC, respectivamente. Estas 2 líneas expresaban TG, pero en el caso de la línea FRO que no lo hace habitualmente, no hubo diferencias significativas en el porcentaje de sobrevida celular entre las que fueron transfectadas y las que no recibieron la transfección. Nagayama y col. (71) utilizaron el sistema denominado Cre-loxP, logrando incrementar la actividad del promotor de la TG. Construyeron AV recombinantes con el gen de la TK del VHS1 bajo el control del promotor de la TG. Por lo tanto Cre activaba la transcripción del gen VHS1-TK solamente en las líneas celulares que expresaban TG (FRTL-5 y FRTC). Esto resultó en un efecto citotóxico, luego del agregado de GCV, in vitro, aumentado 5 a 10 veces, en comparación con otra construcción que contenía un AV recombinante con el gen VHS1-TK fusionado al promotor de TG. Obviamente, este enfoque está limitado a aquellos cánceres que todavía mantienen la expresión de la TG, (la mayor parte de los cánceres tiroideos, ya que la TG es usada como un marcador sensible, aún en casos avanzados). De todas maneras, hay que considerar que la desdiferenciación coincide generalmente con una disminución en la expresión de factores de transcripción específicos tiroideos y esto reduciría la eficiencia de la expresión de la TG y de cualquier transgénico controlado por el promotor de la TG. 23 Recientemente, Zhang y De Groot (72) usaron esta estrategia "suicida" en líneas celulares de carcinoma medular con resultados poco satisfactorios. Ellos relacionan esta falta de respuesta con esta modalidad terapéutica con la ausencia de efecto bystander debido a la escasa presencia de uniones estrechas presentes en las células del carcinoma medular. - Inmunoterapia: IL-2 en tumores tiroideos Aunque los tumores expresan antígenos que pueden desencadenar una respuesta inmune, a menudo evaden la vigilancia del sistema inmune por una disminución en la expresión de antígenos de histocompatibilidad clase I y II. Además, esta respuesta puede estar deprimida como consecuencia de ciertos productos liberados por el mismo tumor. La IL-2 actúa sobre la proliferación y diferenciación de NK, CD4 y linfocitos T citotóxicos y la administración sistémica de IL-2 produce inmunidad antitumoral en modelos animales. Sin embargo, la dosis necesaria para lograr este efecto terapéutico, frecuentemente, causa efectos indeseables en el ser humano. La administración intratumoral de la citokina podría proveer concentraciones más altas y evitar este problema. Alternativamente, el gen de la IL-2 puede ser introducido por medio de terapia génica, dentro de las células tumorales. En 2 publicaciones de Zhang y De Groot (17,64), se utilizó este enfoque como una opción para el tratamiento del carcinoma medular de tiroides. Ellos usaron un AV que transportaba al gen murino de la IL-2 (IL-2m) bajo el control del promotor del CMV humano. Estas líneas celulares transfectadas in vitro secretaron cantidades elevadas de IL-2m. Al inyectar estas líneas celulares por xenotransplante a ratones con carcinoma medular de tiroides, se observó una importante disminución en el crecimiento tumoral. La reinyección de las líneas parentales en animales libres de tumor, luego de 60 días, no mostró producción tumoral, revelando una inmunidad a largo plazo contra las células 24 tumorales. Cuando el AV codificante de IL-2 se inyectó en tumores previamente generados, se observó una regresión en el 69 % de los tumores "pequeños" (menores a 30 mm3) y una estabilización de los "grandes" tumores (mayores a 30 mm3). Para evaluar la seguridad del procedimiento, el AV se administró vía endovenosa para monitorizar los efectos en otros tejidos. La diseminación hacia el hígado determinó una infiltración linfocítica a nivel sinusoidal, pero esto no afectó los niveles enzimáticos de GOT y GPT. Dos de 12 animales mostraron signos de necrosis celular en el bazo pero no hubo alteraciones a nivel pulmonar ni renal. - Terapia génica usando el simporter de ioduro/sodio: Luego de clonar el simporter de Na+/ I - (NIS) (73), se introdujo una nueva clave para dilucidar la patogénesis de las enfermedades tiroideas, incluyendo la del cáncer de tiroides. Por ejemplo, la reducción en la expresión y funcionalidad de esta proteína puede contribuir a la falla en la terapia con radioiodo, debido a una carencia en la acumulación de I131 en los carcinomas tiroideos avanzados (74). Shimura y col. (75) investigaron si la reexpresión de este transportador en células poco diferenciadas conduciría a la recaptación de I131 en tumores tiroideos. Ellos transfectaron una línea celular de carcinoma tiroideo de rata (FRT-Te) con el NIS intacto y posteriormente realizaron un xenotransplante a nivel subcutáneo en ratas Fisher. Los tumores resultantes, concentraron el radioiodo 27 veces más que las líneas parentales. De todas maneras, no se observó un efecto inhibitorio luego del tratamiento con radioiodo, ya que el volumen tumoral no sufrió variaciones 3 semanas luego de esta terapia. También se ha enfatizado en el uso de este simporter para el tratamiento de otros tumores, es decir, expresión de NIS en líneas celulares que habitualmente no lo hacen, para poder usar el radioiodo como otra opción terapéutica. Mandel y col. (76) 25 transfectaron al NIS con el uso de un vector retroviral en líneas celulares humanas de melanoma, hepatocarcinoma, carcinoma de colon y adenocarcinoma de ovario. Las células acumularon ioduro, ya sea en cultivo o en tumores que fueron generados por xenotransplante. Además, demostraron un aumento en la muerte celular luego del tratamiento con radioiodo en los cultivos, pero no se evaluó la respuesta en los xenotransplantes. Debería agregarse que una publicación reciente sugiere que la pérdida de la captación de radioiodo en los carcinomas tiroideos podría ser secundaria a una disminución en la transcripción, causada por una metilación aberrante del gen NIS (77). Las muestras tumorales no mostraron patentes específicas de metilación en correlación con una deficiencia en la expresión del ARNm del NIS, pero el tratamiento de 7 líneas de carcinoma tiroideo con 5-azacitidina o butirato de sodio, considerados como agentes diferenciantes, restauró la expresión del ARNm del NIS en 4 y aumentó la captación de I131 en dos de ellas y esto fue debido a una desmetilación del gen NIS. Entonces, la expresión del NIS y su actividad podrían ser restauradas manipulando la metilación del ADN, al menos en el contexto del cáncer tiroideo, como otro enfoque terapéutico. - Inmunización genética: calcitonina. Como vimos previamente, es posible generar una respuesta inmune por medio de la inyección de ADN plasmídico desnudo (78). En el cáncer medular de tiroides, el marcador tumoral calcitonina puede representar un blanco interesante para la inmunoterapia. Haupt y col. (79) desarrollaron una vacuna plasmídica que codificaba la preprocalcitonina bajo el control del promotor del CMV. Ellos observaron una respuesta inmune en 4 de 5 animales con carcinoma medular luego de su administración, y la coinyección de factores estimulantes de la colonia granulocítica-macrofágica, incrementó esta respuesta específica. 26 - Terapia antisense: El protooncogen c-myc codifica para una proteína nuclear que actúa como un factor de transcripción que produce un estímulo mitogénico. Este gen se encuentra activado de manera constitutiva en una variedad de neoplasias (80). En el cáncer de tiroides, la sobreexpresión de c-myc parece estar relacionada con un pronóstico desfavorable y se ha encontrado un incremento de la expresión del ARNm de c-myc en 7 líneas celulares de neoplasias tiroideas humanas comparado con líneas de células tiroideas normales (81). Estos autores bloquearon la expresión proteica de c-myc con oligonucleótidos antisense contra la región de iniciación de traslación del ARNm y observaron una disminución significativa en la tasa de crecimiento de estas líneas celulares de cáncer tiroideo. Aunque estos experimentos se hicieron primariamente para clarificar el rol biológico de c-myc, también pueden ser considerados dentro de los enfoques actuales para la terapia génica del cáncer tiroideo. 27 ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES HIPOFISARIOS: Los tumores hipofisarios constituyen cerca del 10 al 15% de todos los tumores intracraneanos. Aunque en la mayoría de los casos son considerados como adenomas benignos, pueden producir anormalidades endocrinas, presentar extensión supraselar, y, dependiendo de su tamaño, pueden originar oftalmoplejía y otros síntomas neurológicos. Debido a los progresos recientes en la microcirugía transeptoesfenoidal, al tratamiento médico y a la radioterapia, la mayoría de estos tumores se han transformado en fácilmente tratables, con una larga sobrevida o inclusive, la curación definitiva, luego de estos tratamientos. Sin embargo, en algunos de los tumores de difícil manejo, tales como los tumores invasivos localmente, endocrinamente activos, solo se ha conseguido un éxito parcial y, en estos casos, la curación sería imposible de alcanzar. Para estos tumores, actualmente, se están proponiendo nuevas estrategias, entre las que se incluye la terapia génica. - Uso de genes activantes de prodrogas: Windeatt y col. (82), exploraron la hipótesis de que la transferencia génica usando vectores adenovirales que expresaran a la TK del VHS1 podría ofrecer una alternativa terapéutica para el tratamiento de los prolactinomas que no responden al tratamiento clásico. Para esto, transfectaron por un lado, a células pituitarias (línea secretora de GH/PRL, GH3) y por el otro trataron in vivo a ratas con hiperplasia prolactínica inducida por estrógeno-sulpirida, con este vector adenoviral, bajo el control del promotor proximal del CMV. Así observaron una disminución en los niveles de PRL 28 del orden del 60% en el grupo de ratas tratadas en comparación con un grupo control no tratado, sin evidenciar efectos deletéreos sobre las otras líneas hipofisarias. Otros de los enfoques para restringir la expresión génica en un tejido particular, hace uso de las características peculiares del tejido pituitario, por ejemplo, el gen de la PRL es un gen singular que se expresa en las células lactotropas hipofisarias y en muy bajo grado, en un número de tejidos extrahipofisarios. La expresión hipofisaria de manera casi exclusiva es un ejemplo de regulación por un promotor específico. El promotor de la PRL tiene un sitio de unión para varios factores de transcripción, entre ellos, PIT-1 (83). Esta regulación transcripcional del gen de PRL puede ser explotada utilizando promotores específicos que dirijan la transfección viral a un subgrupo celular específico. Así varios grupos han trabajado con estos promotores: Xy y col. (38) usaron promotores específicos de GH humana y realizaron una transfección con un adenovirus transportando el gen VHS-TK y observaron una expresión elevada del mismo, así como la muerte celular incrementada luego del agregado de GCV en las células productoras de GH/PRL (células GH3). Se observó además una persistencia en la expresión viral por al menos durante 21 días y con relativa baja toxicidad para las células no hipofisarias o las células pituitarias que no expresaban GH. Por xenotransplante en ratones, demostraron que la inyección del transgen durante 10 días permitió observar una marcada reducción del tamaño tumoral (Fig. 6). Por otro lado, Southgate y col. (84) usaron el promotor de la PRL para dirigir la expresión del mismo sistema viral en líneas celulares prolactotropas in vitro y en animales con hiperplasia hipofisaria inducida por estrógenos y sulpirida, observando una disminución del tamaño glandular in vivo y del número de las células lactotropas in vitro. - Uso de genes supresores de tumores y genes que regulan el ciclo celular: 29 Como hemos visto previamente, las mutaciones y deleciones del gen supresor de tumor p53, se asocian con el 40 al 50 % de los cánceres humanos. Sin embargo, hasta el momento, no se han detectado mutaciones en este gen en adenomas hipofisarios, carcinomas o sus metástasis (85). Por lo tanto, es probable que el p53 no juegue un rol importante en la tumorigénesis hipofisaria. Un estudio reciente demostró que las deleciones que afectan a los cromosomas 11q13, 13q12-14 y 10q26 ocurren más frecuentemente en los tumores hipofisarios invasivos que en los no invasivos (86), ocurriendo la primera de éstas en aproximadamente un 30 % de los adenomas pituitarios esporádicos. Esto sugiere que habría una interacción con genes supresores de tumores que provocaría una progresión tumoral. Una vez identificados, los mismos serían candidatos ideales para la terapia génica. El producto del gen Rb regula el ciclo celular y, como previamente vimos, juega un rol fundamental en la diferenciación celular. Recientemente se demostró que la disrupción del gen Rb en ratones conduce a una incidencia del 100 % de tumores pituitarios originados en el lóbulo intermedio de la hipófisis que expresan pro-opiomelanocortina (55). No hace mucho tiempo se desarrolló una estrategia de terapia génica, y se la ha usado in vivo para el tratamiento de estos tumores (16). Se utilizaron adenovirus que codificaban para una copia normal del gen Rb. Se realizó una inyección intratumoral en ratones Rb+/-. Esto disminuyó la proliferación celular, restableció la inervación por las neuronas dopaminérgicas que regulan el crecimiento celular, inhibió el crecimiento tumoral y prolongó la sobrevida de los animales tratados. - Factores de crecimiento y sus receptores involucrados en la modulación de la angiogénesis: Se ha demostrado que la angiogénesis es un factor fundamental para el crecimiento de los tumores hipofisarios (87). Las estrategias que involucran el uso de 30 genes anti-angiogénicos (como vimos previamente en el apartado de generalidades de estrategias), pueden proveer una terapia in vivo efectiva, ejemplo: expresión de cDNA antisense para EGF o VEGF, o la expresión de los mutantes dominantes negativos de sus receptores respectivos, con buenos resultados para el tratamiento de tumores del sistema nervioso central. Por otro lado, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es una proteína neurotrófica que promueve el crecimiento, diferenciación y sobrevida de las neuronas del sistema nervioso periférico simpático, las neuronas ascendentes colinérgicas y de las células nerviosas sensoriales derivadas de la cresta neural (88).. En un estudio, el mismo grupo demostró que los prolactinomas humanos que fueron totalmente resistentes a la terapia farmacológica por carencia de receptores dopaminérgicos D2, expresaban receptores NGF. Ellos además demostraron que, después de la exposición a este factor, las células tumorales disminuyeron la velocidad de proliferación, perdieron su capacidad tumorigénica y re-expresaron el receptor D2 (89). Estos resultados indican que el tratamiento a corto plazo con NGF podría inducir la reversión de los prolactinomas humanos a un estado prolactotropo símil más diferenciado y dopamino- sensible. Este estudio da la posibilidad de que una terapia génica basada en la liberación de NGF in situ, pueda restaurar la susceptibilidad de tumores refractarios al tratamiento convencional con agonistas D2. 31 TERAPIA GENICA EN TUMORES ADRENALES Chuman y col. (25) fueron los primeros investigadores que realizaron experimentos in vitro construyendo vectores para terapia génica suicida con el VHS1TK con el agregado de diferentes promotores específicos de células adrenales y aumentaron su actividad y especificidad con agentes que modulan la vía de la 3'5' adenosina cíclica monofosfato. Una de las características peculiares de las glándulas adrenales es la expresión del gen CYP 111 ( 11hidroxilasa) que cataliza la conversión de 11 desoxicorticosterona y 11 desoxicortisol a corticosterona y cortisol, respectivamente. Aunque el metabolismo esteroideo no es exclusivo de la glándula suprarrenal, los estudios bioquímicos indican que la actividad de la 11hidroxilasa está confinada únicamente a la zona fasciculada y reticular de la corteza adrenal. Estos autores lograron restringir la expresión génica a las células adrenales a través de la utilización de promotores específicos, por un lado el promotor de la CYP 11 1, al cual le anexaron otro promotor, el del gen de la cadena lateral de clivaje del colesterol (p450 scc). Trabajaron in vitro sobre 2 líneas celulares de carcinoma adrenal, y demostraron, en primera instancia, una mayor expresión del VHS1-TK en las células adrenales comparada con otras 5 líneas de carcinomas no adrenales y posteriormente evaluaron el efecto de ciertos agentes diferenciantes sobre la expresión del ARNm endógeno y la actividad del promotor en las células adrenales. Para esto, utilizaron 8 Br AMPc, forskolin (agonista del AMPc) y estimularon a las células con ACTH (que tiene una actividad diferenciante de las células adrenocorticales), comparándolos con dos agentes diferenciantes sin efecto sobre el AMPc (el butirato de sodio y el ácido all-transretinoico) y verificaron los efectos de estos agentes luego de la transfección estable con el VHS1-TK, analizando la sensibilidad al GCV. Así lograron poner en evidencia que 32 las células adrenales transfectadas con el fragmento scc/ 11/ VHS1-TK fueron capaces de expresar a la enzima viral, luego del agregado de los agentes diferenciantes que actúan sobre la vía del AMPc y que estas células eran mucho más sensibles que las líneas parentales al GCV. Esos investigadores crearon, entonces, un vector suicida con toxicidad preferencial para las células adrenocorticales y aumentaron su especificidad y actividad agregando al VHS1-TK, el promotor CYP 111 asociado al promotor proximal de la scc p450, incrementando la sensibilidad al GCV agregando agentes diferenciantes ( 8Br AMPc, forskolin o ACTH). Se sugiere que el uso de esta estrategia podría ser efectivo para el tratamiento de otros tumores endocrinos con propiedades únicas como lo son los originados en las células adrenales. 33 CONCLUSIONES: Desde que la terapia génica fue usada por primera vez en 1990 para la deficiencia de adenosina deaminasa, más de 160 estudios han sido registrados por el National Institutes of Health de Washington, USA, pero el éxito actual de estos procedimientos parece ser un poco desalentador. De todas maneras, la investigación en este campo está avanzando rápidamente. Los proyectos actuales están enfocados en desarrollar adyuvantes cada vez más eficientes, virales o no virales, y en modificar a los antígenos virales para lograr una infección más eficiente o incrementar la especificidad en la transducción de genes exógenos utilizando promotores específicos, como hemos visto detalladamente en los párrafos de esta monografía. Otras perspectivas están apareciendo, considerando la posibilidad de utilizar dos modalidades combinadas para lograr mayor efectividad. Actualmente, están desarrollándose múltiples opciones con un potencial creciente y es muy probable, así como lo considera MG Castro, una de las investigadoras que más ha trabajado en terapia génica hipofisaria (90), que en no más de 5 a 10 años los pacientes podrán tener los beneficios de esta nueva modalidad terapéutica que conlleva un cambio radical en lo que hasta el momento significa el tratamiento de los tumores endocrinos. 34 Tabla I: VECTORES VIRALES PARA LA TERAPIA GÉNICA TUMORAL. Vector ( tamaño) Retrovirus ( 10 kb) Ventajas Desventajas genoma pequeño integración estable transferencia génica eficiente no tóxica para las células infecta células en división requiere células en división transfiere solo secuencias pequeñas bajos títulos expresión transitoria mutagenesis tras inserción integración aleatoria labilidad in vivo títulos virales elevados transferencia génica muy eficiente no tóxica para las células infecta células en división y células que no se dividen expresión transitoria transfiere solo secuencias pequeñas inmunogénica Virus adenoAsociados (5 kb) genoma pequeño se integra en el cromosoma 19 trasferencia génica eficiente infecta células en división y células que no se dividen transfiere solo secuencias pequeñas bajos títulos seguridad? Poxvirus (vaccinia) (187 kb) expresión génica transitoria transferencia y expresión génica altamente eficiente muy inmunogénico segura en pacientes inmunosuprimidos Virus herpes Simplex (152 kb) infecta células en división y células que no se dividen neurotrófico altos títulos virales transgen de gran tamaño potencial para expresión prolongada toxicidad relacionada a infecciones líticas seguridad? Liposomas sintéticos tamaño no limitado ineficiencia en la transferencia ADN "desnudo" expresión transitoria Poca experiencia ineficiencia en la transferencia Adenovirus (36 kb) 35 Tabla II: ESTRATEGIAS PARA LA TERAPIA GENICA 1. 2. 3. 4. 5. Terapia génica correctiva a. Inactivación de oncogenes por antisense y ribozimas b. Introducción de genes supresores tumorales Terapia génica antiangiogénica Terapia génica "suicida" Terapia génica inmunomoduladora a. Inmunización activa (modificación de las células tumorales para incrementar la inmunogenicidad) b. Modificación genética de las células efectoras inmunes Genes de resistencia a drogas para disminuir la toxicidad de la quimioterapia 36 Retrovirus Interacción virus-receptor Internalización U3 ARN VIRAL LTR LTR ADN PROVIRAL LTR LTR U5 Sin Cápside Integración NÚCLEO PROVIRUS INTEGRADO LTR LTR Procesamiento del genoma viral U5 Transcripción Traslación U3 Brote Figura 1: Representación esquemática del ciclo de vida de los retrovirus, mostrando la internalización, transcripción reversa, integración, formación de nuevo virus y liberación. U5: extremo 5’ , U3: extremo 3’, LTR: repeticiones terminales (éstas poseen un rol importante en el control transcripcional y en la integración) Adaptado de Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103118. 37 Adenovirus Interacción virus-receptor/integrina Liberación del endosoma dependiente de pH Internalización CITOPLASMA NÚCLEO Replicación del ADN Genoma ADN episomal Transcripción Transcriptos de ARNm viral Traslación Liberación lítica desde las células Productos de genes virales Figura 2: Ciclo de vida del adenovirus, mostrando la internalización, replicación, armado viral y liberación. Adaptado de Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103-118. 38 Núcleo A Célula de glioma sin división Célula de glioma en división Neurona Vector para terapia génica VHS-TK B Timidinakinasa Ganciclovir C Metabolitos de ganciclovir "BYSTANDER EFFECT" + + + + + + + + MUERTE CELULAR + + No efecto Uniones estrechas Figura 3: Terapia génica "suicida". (A) Las células tumorales son trasducidas con un vector que transporta al gen de la timidina kinasa del virus herpes simplex (VHS-TK). (B) La expresión trangénica en las células afectadas resulta en la síntesis de la enzima timidina kinasa, una kinasa exógena con alta afinidad para la droga ganciclovir. (C) La exposición de las células huéspedes al ganciclovir conduce a la fosforilación de la droga, dando origen a varios metabolitos tóxicos en las células que expresan el gen VHS-TK, determinando la muerte celular. El transporte de los metabolitos fosforilados tóxicos a través de las uniones estrechas conduce a la muerte celular de las células adyacentes por el efecto espectador ("bystander effect"). Adaptado de Cusack JC et al. Surg Oncol Clin of North Am 7: 452. 1998 39 A. B. Interacción virus-receptor/integrina Unidad de transcripción ITR ITR Rep Cap Internalización CITOPLASMA Translocación nuclear Adenovirus adyuvante NÚCLEO ADN dc Integrado al genoma Célula 293 Adenovirus DR Adenovirus FASE LATENTE Adenovirus adyuvante Genoma adenoviral Genoma Virus Replicación Replicación del ADN Adeno-asociado Stock mezcla de AV adyuvante y Virus adeno-asociado Calor a 56 ºC Transcripción Armado viral Transcriptos de ARNm AV y VAA Traslación Centrifugación Liberación lítica desde las células Productos de genes virales FASE DE RESCATE AAVr Figura 4: (A) Ciclo de vida de los virus adeno-asociados (AAV). Luego de la infección de la célula blanco se produce una latencia. Los viriones AAV son rescatados luego de la infección subsiguiente con un adenovirus adyuvante (AVA), el cual provee las secuencias necesarias para la replicación. (B) Representación esquemática de la producción de AAV recombinantes (AAVr). Las células permisivas son co-transfectadas con un plásmido que contiene a la unidad de transcripción (en verde). La infección posterior con un AVA posibilita el rescate de los viriones de AAVr junto con el AVA. Finalmente, estos pueden ser separados, calentando el cultivo a 56ºC y centrifugando posteriormente. Adaptado de Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103-118 40 A B Figura 8: A. Inyección de vectores adenovirales dentro de las células tumorales GH3 en ratones. Se inyectaron adenovirus que transportaban el gen de la timidina kinasa y adenovirus sin este gen y se trató a los ratones con ganciclovir (100 mg/kg, parenteral, una vez al día durante 10 días). Los tumores escindidos se observan en el panel B. Reproducido de Lee y col. J Clin Endocrinol Metab Vol. 84, No. 2: 786-794. 41 REFERENCIAS: 1) Wei, RM, Gibson M, Spear PG y col. 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