Anexo 2: LNH difuso de célula grande. Estudios de Biología molecular Dra. Milagros Balbín Laboratorio de Biología molecular HUCA Enero 2008 La heterogeneidad morfológica, clínica y genética de los linfomas B difusos de célula grande sugiere la existencia de subtipos y subestructuras biológicamente relevantes que aún están por definir. Los estudios de biología molecular pretenden profundizar en la biología del tumor, con el fin de conseguir una estratificación de los tumores de acuerdo con las alteraciones biológicas que albergan, y de encontrar marcadores biológicos que puedan ser utilizados como factores pronósticos o dianas terapéuticas. En este sentido los estudios de expresión génica a gran escala, utilizando microarrays de DNA están generando nueva información que permite clasificar los linfomas en distintos subtipos y generar nuevos modelos pronósticos. Subtipos identificados mediante estudios de expresión génica a gran escala. Inicialmente se identificaron dos subgrupos basados en la similitud en la expresión de un grupo de genes en el tumor y en células normales del centro germinal o en células B activadas in vitro (1-2), y más tarde se ha identificó un tercer grupo (34). Estos grupos se han denominado: - linfoma difuso de célula grande tipo centro germinal (GCB –DLBCL en inglés) - linfoma difuso de célula grande tipo células B activada (ABC - DLBCL) - linfoma difuso de célula grande primario mediastínico (PM – DLBCL) El tipo GCB se caracteriza por la expresión de genes relacionados con los que expresan las células del centro germinal, incluyendo BCL-6, CD10 o HGAL y está asociado frecuentemente a la translocación t(14;18) mientras que los tumores del tipo ABC tienen un patrón de expresión de genes relacionados con los de las células B activadas, teniendo una activación constante de la vía de NFkB, vía que juega un papel importante en la proliferación, diferenciación y supervivencia de las células B, y que además puede ser una diana terapéutica. Los reordenamientos y amplificaciones en 3q son más frecuentes en el tipo ABC. El tercer grupo de tumores identificado posteriormente por otros investigadores es el primario mediastínico (PM). Estos tumores expresan bajos niveles de los componentes de la vía del receptor de células B y tienen una firma molecular específica de citoquinas, así como activación de la vía de NFkB. Estas características las comparte con los Linfomas de Hodgkin. El parecido de los perfiles de expresión de estos tumores con los del linfoma de Hodgkin es de particular interés, puesto que ambos tipos tienen presentaciones clínicas similares, y comparten algunas lesiones genéticas, tales como ganancias en los cromosomas 9p y 2p que incluyen alteraciones de las vías de JAK2 y REL, haciendo pensar que el desarrollo de estos tumores tenga una célula de origen que puede ser común. La distinción molecular entre estos subgrupos sugiere que éstos corresponden a diferentes entidades clínicas, y tiene importancia porque difieren en valor pronóstico, teniendo el grupo PM una tasa de curación más alta (supervivencia a los 5 años del 64%), el grupo GCB una tasa de supervivencia a los 5 años del 59 % y el grupo ABC tiene una tasa media de supervivencia a los 5 años del 30 % (2). Se han llevado a cabo otros estudios de perfiles de expresión que han identificado subgrupos alternativos de tumores dentro del linfoma B de célula grande difuso (5), indicando que mediante distintos métodos de clasificación se han podido capturar diferentes aspectos de la heterogeneidad de estos linfomas. En concreto estos subgrupos se han denominado: - Subgrupo fosforilación oxidativa (Ox Phos), que muestra un incremento en la expresión de genes que regulan la función mitocondrial, el transporte de electrones, la apoptosis y el proteasoma, incluyendo alteraciones en la familia de BCL-2. - Subgrupo de tumores de receptor de célula B (BCR). Tienen una mayor expresión de genes reguladores del ciclo celular, genes de reparación de DNA, componentes de la vía de señalización del receptor de células B, y numerosos factores de transcripción específicos de células B, incluyendo BCL-6. Las alteraciones que implican la región 3q son más frecuentes en este subgrupo. - Subgrupo de tumores con “respuesta inflamatoria” (Host response HR). Este subgrupo tiene una expresión aumentada de genes relacionados con respuesta inmune/inflamatoria. Estos tres subgrupos no difieren en la respuesta clínica de los pacientes, pero pueden ser de interés para la identificación de dianas terapéuticas. Por ejemplo, el grupo BCR es más sensible a inhibidores de BCL6. Los estudios anteriores se han realizado principalmente en la época previa a la introducción del Rituximab en la terapia. La introducción de rituximab ha modificado la supervivencia, mejorándola en todos los grupos. En algunos casos, se ha perdido el valor predictivo de algunos marcadores, como la expresión de BCL-2 (6). Se han intentado definir los subgrupos GC y ABC de linfomas mediante la utilización de inmunohistoquímica con un pequeño grupo de marcadores (CD10, BCL-6, MUM1) (7) pero no es suficientemente reproducible y la clasificación en subgrupos mediante inmunohistoquímica pierde el valor pronóstico en grupos de pacientes tratados con terapia que incluye rituximab (8). Estudios mediante selección de grupos de genes y cuantificación mediante PCR en tiempo real. Lossos et al (9) han intentado generar un modelo técnicamente más sencillo con fines de ser introducido en la rutina clínica, evaluando la expresión de RNA de 36 genes candidatos que habían sido seleccionados como marcadores para predecir supervivencia en linfoma B difuso de célula grande. Midieron la expresión de esos 36 genes en tumores de 66 pacientes tratados con quimioterapia basada en antraciclinas. Con los 6 genes que más diferencias de expresión tenían y que presentaron un valor predictivo mayor en análisis univariante, construyeron un modelo basado en la contribución relativa de cada uno de ellos en un análisis multivariante, donde - LMO2, BCL-6 y FN1 predicen una mayor supervivencia y - CCND2, SCYA3 y BCL-2 predicen peor supervivencia. Con este modelo pudieron subdivir los pacientes en grupos de alto, intermedio y bajo riesgo, con supervivencias del 15%, 49% y 65% respectivamente. Este modelo era independiente del IPI. Recientemente, el mismo grupo ha intentado validar la expresión de uno de estos genes, LMO2, detectándolo mediante inmunohistoquímica, y en pacientes tratados con terapias que incluyen rituximab (10). Aplicación de estos modelos en la actualidad A pesar de que existen datos moleculares, genéticos y clínicos que apoyan la existencia de los subgrupos de tumores GC, ABC y PM, en la actualidad no hay una forma clara y reproducible de identificar estos subtipos de linfomas si no es mediante el perfil de expresión por microarrays. La existencia de distintas plataformas necesita aún validación y estandarización de múltiples parámetros y métodos de análisis. El coste de estos estudios es asimismo bastante alto. Lo ideal será encontrar un grupo de genes que defina de forma robusta estos subgrupos y su estudio se pueda introducir de forma sencilla en la rutina. Todos los modelos comentados anteriormente necesitan ser validados en grupos de pacientes independientes del grupo inicial y especialmente en grupos de pacientes tratados mediante terapias que incluyen el rituximab. Para confirmar estos modelos propuestos de forma prospectiva, se necesita prestar una atención importante a la uniformidad en la recogida y el manejo de las muestras. Los estudios de expresión de RNA necesitan preferentemente material congelado de forma adecuada. Los estudios de inmunohistoquímica deberán estar uniformizados asimismo en relación a la fijación del tejido, el método para desenmascaramiento de antígenos, la utilización de los mismo anticuerpos y la aplicación uniforme de los puntos de corte para decidir la positividad de la reacción. Bibliografía 1. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000;403(6769):503-11. 2. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2002;346:1937-47. 3. Rosenwald A, Wright G, Leroy K, et al. Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin lymphoma. J Exp Med. 2003;198:85162. 4. Savage KJ, Monti S, Kutok JL, et al. The molecular signature of mediastinal large B-cell lymphoma differs from that of other diffuse large B-cell lymphomas and shares features with classical Hodgkin lymphoma. Blood 2003;102:3871-9. 5. Monti S, Savage KJ, Kutok JL, et al. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood 2005; 105:1851-61. 6. Mounier N, Briere J, Gisselbrecht C,et al. Rituximab plus CHOP (R-CHOP) overcomes Bcl-2-associated resistance to chemotherapy in elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Blood. 2003;101:4279-84. 7. Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, Gascoyne RD, Delabie J et al. Confirmation of the molecular classidication of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood 2004; 103: 275-282 8. Nyman H, Adde M, Karjalainen-Linsberg M et al. Prognostic impact of immunohistochemically defined germinal center phenotype in diffuse large Bcell lymphoma patients treates with immunochemotherapy. Blood 2007; 109: 4930-4935. 9. Lossos IS, Czerwinski DK, Alizadeh AA et al. prediction od survival on diffuse large B-cell lymphoma based on the expression of six genes. New Engl J Med 2004; 350: 1828-1837. 10. Natkunam Y, Farinha P, His ED et al. 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