S3-MCS15

EXPRESIÓN DE GENES QUE PARTICIPAN EN EL CARCINOMA
HEPATOCELULAR BIEN DIFERENCIADO DE LA RATA
Diana I. Aparicio-Bautista1, J. Arellanes-Robledo1, J. I. Pérez-Carreón1, S. FattelFazenda1, J. Aguirre-García2 y S. Villa-Treviño1.
1
Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y Estudios Avanzados del
IPN. Av. IPN No. 2508. Col. San Pedro Zacatenco, C. P. 07360, México, D. F.
2
Hospital General de México, O. D., Dr. Balmis No. 148, Col. Doctores, C. P. 06726,
México, D. F.
e-mail: ivette2401@yahoo.com.mx
RESUMEN
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto más común y la tercera causa de muerte por
cáncer a nivel mundial. Es considerado un tumor muy vascularizado, lo cual varía de acuerdo al tamaño y
al grado histológico. Debido a que la mayoría de los genes humanos vinculados a enfermedades tienen su
ortólogo en la rata, en este trabajo evaluamos por RT-PCR la expresión del factor de crecimiento de
endotelio vascular (VEGF), un importante modulador del desarrollo vascular de tumores, y la expresión
de genes que se han descrito en diferentes modelos experimentales que participan en la activación del
VEGF. Para este estudio se utilizaron CHC de ratas F-344 inducidos por el modelo del hepatocito
resistente. El análisis histopatológico reveló que todos los tumores se encontraron en el grado de
desarrollo histológico bien diferenciado. El mRNA del VEGF se sobreexpresó 33% y 17% (p<0.05) en
tejido tumoral y no tumoral, respectivamente. La expresión de los genes Sp1, COX-2, IL-1, TNF- y
TGF-1 se sobreexpresaron 24%, 21%, 63%, 8% y 9% (p<0.05) en tejido tumoral, respectivamente;
mientras que en el tejido no tumoral sólo se observó este fenómeno con la expresión de Sp1, COX-2 e IL1 en un 19%, 16% y 76% (p<0.05), respectivamente. Estos resultados sugieren que en el CHC bien
diferenciado de la rata, la expresión del VEGF es inducida por el efecto conjunto de diversos genes que
contribuyen a la progresión de esta enfermedad.
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial el carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto más frecuente y la tercera causa
de muerte, y tiene una incidencia de un millón de nuevos casos por año (Safe, S. y Abdelrahim, M.,
2005). El desarrollo de esta enfermedad es estimulado por una variedad de factores como son: las
infecciones crónicas causadas por virus de la hepatitis B y C, la exposición prolongada a micotoxinas
como aflatoxina B1 y la cirrosis ocasionada por el consumo excesivo de alcohol, además de factores
adicionales como la predisposición genética (Blum, 2002).
El CHC es un proceso complejo asociado con la acumulación de cambios epigenéticos y
genéticos que incluye tres etapas: iniciación, promoción y progresión. Desde la etapa de iniciación existen
cambios en la expresión genética, los cuales generan cambios funcionales y estructurales en las células
que contribuyen al desarrollo de esta enfermedad (Thorgeirsson y Grishman, 2002).
De acuerdo al grado de desarrollo histológico, esta enfermedad se ha clasificado en tres tipos:
bien diferenciado, moderadamente diferenciado y pobremente diferenciado. Aunque frecuentemente se
han encontrado dos o más grados de desarrollo histológico dentro del mismo tumor. Además, la
sobreexpresión de proteínas también se ha relacionado con el grado de desarrollo histológico como es el
caso de la Ciclooxigenasa-2 y el Factor de crecimiento de endotelio vascular en el CHC bien diferenciado
1
(Sung et al., 2004).
El estudio del CHC como el de otras enfermedades, ha sido posible gracias a la utilización de
modelos experimentales que han permitido estudiar las alteraciones moleculares que ocurren en las
diferentes etapas del desarrollo del cáncer (Farber, 1982). Actualmente, la rata se ha establecido como un
modelo de investigación para entender la biología del ser humano y sus alteraciones, con su utilización se
tiene la ventaja de probar el funcionamiento de ciertas sustancias para tratar enfermedades de seres
humanos. Esto se debe a que la rata y el ser humano presentan elementos compartidos, por ejemplo,
poseen un genoma de 2.75 Gb y 2.9 Gb respectivamente, y ambas especies codifican un número similar
de genes. Así, la mayor parte de los genes conocidos de seres humanos que se asocian con enfermedades,
tienen genes ortólogos en el genoma de la rata, lo que hace de esta especie una herramienta útil para la
investigación (Gibbs et al., 2004).
Con el uso del modelo de hepatocarcinogénesis del hepatocito resistente, en este trabajo
identificamos el grado de desarrollo histológico y evaluamos la expresión de genes que participan en la
progresión del CHC y que activan de manera directa o indirecta el factor angiogénico conocido como
factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF).
HIPÓTESIS
Genes que de manera independiente activan la expresión del VEGF en diferentes modelos in
vitro, principalmente en líneas celulares, pueden estar actuando conjuntamente para activar directa o
indirectamente al VEGF en el CHC in vivo.
OBJETIVOS
GENERAL:
 Evaluar la expresión de genes que participan en la progresión del CHC de la rata.
PARTICULARES:
 Identificar el grado de desarrollo histológico del CHC de la rata.
 Determinar la expresión del VEGF, en la progresión del CHC de la rata.
 Determinar la expresión de factores que participan en la activación del VEGF, como Sp1, COX2, TNF-, IL-1β y TGF-β1 en la progresión del CHC de la rata.
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelo de hepatocarcinogénesis química
Ratas Fisher-344 fueron sometidas al modelo del hepatocito resistente (HR) (Semple-Robert,
1987), el cual es un modelo de hepatocarcinogénesis in vivo, éste consiste en la aplicación como
carcinógeno iniciador de N-nitrosodietilamina (DEN), como carcinógeno promotor en los días 7, 8 y 9
post-iniciación la aplicación de 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) y como estímulo proliferativo en el día
décimo las ratas se someten a una hepatectomía parcial. Dieciocho meses después, cuando los tumores ya
estaban formados, las ratas fueron sacrificadas y el hígado fue extraído. Parte de cada muestra de hígado
fue fijada en formaldehído al 10% para realizar el análisis histopatológico con la tinción de Hematoxilina
& Eosina y así identificar el grado de desarrollo histológico de los tumores y otra parte de tejido fue
inmediatamente congelada en nitrógeno líquido y conservada a -70 °C para realizar los ensayos de
expresión genética.
Diseño experimental
Se utilizaron 2 grupos de ratas:
Grupo 1) Tratamiento Completo (TC). Este grupo se sometió al tratamiento completo de
hepatocarcinogénesis, en el cual, la expresión genética se evaluó en el tejido tumoral (T) y en el no
tumoral (NT) por cada rata.
Grupo 2) Control (C). Este grupo no recibió ningún tratamiento.
Genes evaluados
Factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), Factor de transcripción Sp1, Ciclooxigenasa-2
(COX-2), Factor de Necrosis Tumoral– (TNF-), Factor de crecimiento transformante- (TGF-) e
Interleucina-1 (IL-1).
Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)
Los ensayos de RT-PCR se realizaron en un sólo paso con la mezcla de RT y la Taq DNA
polimerasa (Super-Script One-step RT-PCR System, Gibco BRL). Los productos de RT-PCR fueron
visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.8% y teñidos con bromuro de etidio. Las imágenes
de los productos de RT-PCR fueron analizadas por densitometría con el software analizador de imágenes:
2
AnaliSIS, Soft Imaging System GmbH y la intensidad de bandas fue definida como la suma del valor de
la intensidad de cada pixel contenido en la banda. El promedio de las intensidades de las muestras de
tejido normal de cada gen, fue igualado a 1 y éstos fueron normalizados con la intensidad de la subunidad
28S del rRNA correspondiente para cada muestra.
RESULTADOS
Grado de diferenciación tumoral
Como se muestra en la Figura 1, encontramos que los tumores de ratas de 18 meses de desarrollo
presentan las siguientes características: patrón trabecular con células neoplásicas con presencia de
esteatosis, patrón pelioide, patrón tubular y células gigantes. Debido a que estas características
corresponden al CHC bien diferenciado. Estos resultados indican que el CHC de la rata de 18 meses de
desarrollo se encuentra en este grado histológico.
B
A
C
a
D
b
a
b
a
b
F
E
b
a
c
a
b
Fig. 1. A) Hepatocitos normales,
B) CHC con patrón pelioide (a)
y patrón trabecular (b), C) CHC
con patrón trabecular (a) y
células neoplásicas con presencia de esteatosis (b), D) CHC
con patrón sólido (a) y célula
gigante (b), E) CHC con áreas
pelioides (a) y trabeculares (b).
Se observa un espacio porta
rodeador por tumor (c), F) CHC
con patrón trabecular (a), con
esteatosis (b), se observa que las
placas de células neoplásicas
son de mayor espesor que las
placas de los hepatocitos
normales.
Análisis de expresión genética por RT-PCR
De acuerdo con el análisis densitométrico (Figura 2) la expresión del VEGF en tumores fue un
33% (p<0.01), mayor con respecto a las muestras control, mientras que en los tejidos no tumorales la
diferencia fue solo del 17% (p<0.05); al comparar el tejido tumoral con el no tumoral la diferencia no fue
significativa. Así en tumores de hígado de rata la presencia del mRNA que codifica para el VEGF es
mayor que en el tejido no tumoral, sin embargo ambos tejidos muestran una sobreexpresión significativa.
La expresión del factor de transcripción Sp1 en tumores y en no tumores fue un 24% (p<0.01) y un 19%
(p<0.05) mayor respectivamente. Al igual que el VEGF, el Sp1 se encontró sobreexpresado tanto en
tejido tumoral como en tejido no tumoral. Por otra parte, el transcrito de la COX-2 incrementó un 21%
(p<0.05) en tumores mientras que en los tejidos no tumorales fue un 16% (p<0.05) mayor. Por lo tanto,
podemos decir que en el CHC de la rata la expresión del mRNA de la COX-2 está alterada.
Adicionalmente, la expresión de TNF- fue un 8% (p<0.05) mayor en tumores; ésta diferencia no se
observó en el tejido no tumoral. Respecto a la expresión del TGF-β1 sólo fue estadísticamente
significativa en tumores (9%, p<0.05). Al igual que el TNF-, la expresión del TGF-β1 en el tejido no
tumoral no fue significativa. Por último, la expresión de la IL-1β en tumores fue un 63% (p<0.01) mayor,
de la misma forma que en los tejidos no tumorales fue un 76% (p<0.01). Éste gen fue el que mostró una
mayor sobreexpresión tanto en el tejido tumoral como en el tejido no tumoral (Figura 3).
3
Fig. 2. Geles representativos de: 4 tejidos Control,
5 Tumores y 5 No Tumores.
Fig. 3. Comparación de la expresión genética (* p<0.05).
DISCUSIÓN
En este trabajo evaluamos la expresión del VEGF y de genes que están relacionados con su
activación, ya que diferentes líneas de investigación han demostrado que el VEGF, el cual es un factor
angiogénico potencial, juega un papel importante en la progresión de la carcionogénesis. Se han descrito
genes de factores moleculares que estimulan al VEGF a través de diferentes vías de señalización
intracelular que inducen la angiogénesis; sin embargo, estas demostraciones se han dado en modelos
experimentales in vitro principalmente en líneas celulares, los cuales una vez integrados sugieren que
existe una relación de estos factores en el proceso del cáncer de un mismo organismo.
Por tal razón, seleccionamos cinco genes que participan directa o indirectamente en la inducción
del VEGF y los evaluamos en tumores inducidos por el modelo del hepatocito resistente en ratas. Los
genes seleccionados fueron, Sp1, COX-2, TGF-1, TNF- e IL-1
Se ha reportado que la expresión del VEGF está relacionada con la diferenciación celular del
tumor, es decir, es más alta en los tumores bien diferenciados que en los moderada y pobremente
diferenciados. En este contexto a nivel histológico, también se ha encontrado una sobreexpresión de este
factor en tejido no tumoral. Nosotros encontramos que en el CHC bien diferenciado inducido
químicamente, los niveles del mRNA fueron mayores tanto en el tejido tumoral como en el tejido no
tumoral. Este resultado sugiere que el VEGF contribuye en la progresión del CHC bien diferenciado; sin
embargo, análisis posteriores serán de gran utilidad para conocer su expresión en los grados histológicos
moderado y pobremente diferenciados.
Diversos factores de transcripción se han caracterizado como moduladores de la expresión del
VEGF; sin embargo, Shi et al. (2003) a través del análisis de mutaciones puntuales demostraron que el
Sp1 es el factor de transcripción más importante en la regulación del VEGF. Aunque diversos estudios
han demostrado que la expresión del Sp1 correlaciona con la del VEGF; aún no se conocen los
mecanismos exactos por los cuales el Sp1 modula la expresión de este factor. La expresión del mRNA del
Sp1 en este trabajo fue similar a lo reportado anteriormente en otros modelos experimentales, debido a
que tanto en el tejido tumoral como en el no tumoral la expresión del Sp1 fue significativamente mayor
que en el tejido normal. Este resultado sugiere que el Sp1 podría estar participando en la inducción del
VEGF en el CHC de la rata.
Por otra parte, la COX-2 la cual participa en la inflamación y en el desarrollo del cáncer; en el
CHC de seres humanos su participación es controversial, debido a que se ha demostrado que se
sobreexpresa en etapas tempranas del desarrollo del cáncer y en etapas avanzadas se encuentra
disminuida; sin embargo, otro estudio reportó una sobreexpresión en etapas avanzadas las cuales estaban
relacionadas con la presencia de procesos inflamatorios. Adicionalmente, en líneas celulares de CHC la
COX-2 induce la expresión del VEGF (Cheng et al., 2004). En el presente trabajo encontramos que en el
CHC de la rata los niveles del mRNA de la COX-2 estuvieron elevados en el tejido completo. Debido a
que en líneas celulares la COX-2 estimula la producción del VEGF, cabe la posibilidad de que en nuestro
modelo experimental la COX-2 también estimule a este factor, y de esta forma ambos participen en el
desarrollo de la hepatocarcinogénesis.
El factor de necrosis tumoral (TNF-) se ha reportado que en el cáncer de ovario de seres
humanos existe una correlación positiva entre la expresión del mRNA y de la proteína del TNF- con el
grado del tumor (Stuart-Naylor et al., 1993). Adicionalmente en líneas celulares de cáncer de próstata el
TNF- induce la expresión de la COX-2, lo que sugiere que esta citocina puede jugar un papel importante
en la progresión de esta enfermedad (Subbarayan et al., 2001). Nosotros encontramos que la expresión
del mRNA del TNF- fue significativamente mayor en tejido tumoral y no así en el tejido no tumoral.
Estos resultados sugieren que aunque la expresión del TNF- fue significativa solo en los tumores, está
participando en el CHC de la rata y ésta función la realiza posiblemente activando directamente al VEGF
o a través de la COX-2, como se ha demostrado en líneas celulares de cáncer de ovario (Safe, S. y
Abdelrahim, M., 2005).
Por otra parte, se ha reportado que en el CHC se expresan niveles variables del mRNA del TGF1; debido a que, los CHC bien diferenciados presentan mayor expresión de esta citocina. Lo que sugiere
que el TGF-1 esta asociado con el grado histológico. Nosotros encontramos una sobreexpresión del
TGF-1 en el CHC de la rata, lo que sugiere su posible participación en la activación del VEGF como
sucede en cáncer colorectal (Xiong et al., 2002). Lo que indica que el TGF-1 tiene el potencial para
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contribuir en la tumorogénesis in vivo.
La IL-1 se ha detectado en carcinoma de mama en seres humanos y en líneas celulares de
hematoma, en las cuales Hellwing-Bürgel et al. (1999) encontraron que la IL-1 y el TNF- causan la
activación moderada del factor inducido por hipoxia (HIF-1), un factor que transcribe al VEGF. En este
sentido, la IL-1 además de inducir factores angiogénicos como el VEGF y la IL-8, también regula la
expresión de la COX-2, así mismo plantean que ésta sobreexpresión esta dada a través de múltiples vías
de señalización como las de Erk 1/2, JNK y P38 MAPK, de la misma forma la IL-1 induce a la COX-2 a
través del NF-kB. En nuestro trabajo, la expresión de la IL-1, en tejido tumoral y en tejido no tumoral
fue significativamente mayor. Estos estudios sugieren que la IL-1 debido a su multifuncionalidad
mostrada en diferentes modelos experimentales; en el CHC in vivo participa en el desarrollo del cáncer
induciendo de manera directa al VEGF a través de la activación de la COX-2, de NF-kB y de las MAPK
(Shi et al., 2003).
Finalmente, debido a que en un organismo todos los genes, incluidos los evaluados en este
trabajo, funcionan de manera ligada a través de diferentes vías de señalización; con estos resultados
nosotros proponemos que éstos genes pueden estar funcionando en el CHC bien diferenciado de la rata de
la siguiente forma: como se muestra en la Figura 4, el VEGF puede ser activado de manera directa por el
TNF- o a través de la activación de la IL-1, del TGF-1 y de la COX-2; por su parte la COX-2 podría
activar al VEGF de manera directa o a través del TGF-1. La IL-1 puede estar activando al VEGF de
manera directa y de manera indirecta a través de la activación del TNF-, a través de la vía de las MAPK
y activando la COX-2 a través de la vía del NF-kB. Por su parte TGF-1 sólo podría estar activando de
manera directa al VEGF. Finalmente el Sp1 transcribe directamente al VEGF o lo puede hacer a través de
la activación de TGF-1 (Safe, S. y Abdelrahim, M., 2005, Shi et al., 2003, Yang et al. 2005).
En conclusión, la alteración de la expresión genética en el CHC de la rata no fue exclusiva del
área tumoral, si no del tejido completo. Además, genes que se han descrito que modulan de manera
independiente la expresión del VEGF principalmente en modelos experimentales in vitro, pueden
encontrarse integrados realizando esa función en el CHC inducido por un modelo experimental in vivo.
Debido a que la mayoría de los genes humanos vinculados a enfermedades tienen su ortólogo en el
genoma de la rata, el comportamiento de los genes evaluados en el CHC de
la rata podría ser útil para compararlo con el del CHC del ser humano, y así
determinar si el modelo experimental utilizado es adecuado para extrapolar
los resultados entre ambas especies. Finalmente, evaluaciones posteriores
serán de gran utilidad para confirmar nuestra hipótesis.
Fig. 4. Esquema hipotético de la activación
del VEGF, en el CHC de la rata.
BIBLIOGRAFÍA REPRESENTATIVA
1. Blum, H. E. (2002) Molecular targets for prevention of hepatocellular carcinoma. Dig. Dis., 20, 81-90.
2. Cheng, A., Chan, H., To, K., Leung, W., Chan, K., Liew, C. y Sung, J. (2004) Ciclooxigenase-2
pathway correlates with vascular endothelial growth factor expression and tumor angiogenesis in hepatitis
B virus-associated hepatocelular carcinoma. In.t J. Oncol., 24, 853-860.
3. Farber, E. (1982) Chemical carcinogenesis. Am. J. Pathol., 106, 271-296.
4. Gibbs, R., Weinstock, G., Metzker, M., Muzny, D., Sodergren, E., et al. (2004) Genome sequence of
the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. Nature, 428, 493-591.
5. Safe, S. y Abdelrahim, M. (2005) Sp transcription factor family and its role in cancer. Eur. J. Cancer,
41, 2438-2448.
6. Semple, E-Roberts, M., Hayes, A., D., Becker, R., Racz, W. y Farber, E. (1987) Alternative methods of
selecting rat hepatocelular nodules resistant to 2 Acetylaminofluorene. Int. J. Cancer, 30:643-645.
7. Shi, H., Xu, J., Hu, N. Z. y Xie, H. J. (2003) Prognostic significance of expression of cyclooxygenase-2
and vascular endothelial growth factor in human gastric carcinoma. World J. Gastroenterol., 9, 1421-6.
8. Stuart-Nylor, M., Stamp, G., Folukes, W., Eccles, D. y Balkwill, F. (1993) Tumor necrosis factor and
its receptors in human ovarian cancer. J. Clin. Invest., 91, 2194-2206.
9. Subbarayan, V., Sabichi, A., Llansa, N., Lippman, S. y Menter, D. (2001) Differential expression of
Cicloooxygenase-2 and its regulation by Tumor Necrosis Factor- in normal and malignant prostate cells.
Cancer Res., 61, 2720-2726.
10. Sung, Y. K., Hwang, S. Y., Kim, J. O., Bae, H. I., Kim, J. C. y Kim, M. K. (2004) The correlation
5
between cyclooxygenase-2 expression and hepatocellular carcinogenesis. Mol. Cells, 29, 35-8.
11. Thorgeirsson, S. S. y Grishman, J. W. (2002) Molecular pathogenesis of human hepatocellular
carcinoma. Nature Genet., 21, 339-346.
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