aplicación a semillas de maíz de cepas de bacillus subtilis y/o sus

APLICACIÓN A SEMILLAS DE MAÍZ DE CEPAS DE BACILLUS
SUBTILIS Y/O SUS METABOLITOS PARA CONTROL DE
PATÓGENOS DE RAÍZ
Resumen ejecutivo
Este estudio evalúa los efectos de las señales medioambientales en la tasa de
crecimiento de diferentes cepas de Bacillus subtilis y la biosíntesis de
compuestos con actividad antagónica contra hongos que ataquen la raíz de
maíz, para lo cual se realizaron aislados Bacillus de campos de maíz.
El informe hace énfasis en la importancia de los estudios que se enfocan en las
características fisiológicas, los parámetros kinéticos y los requerimientos
nutricionales de los agentes de biocontrol introducidos en un campo y puede
ayudar a desarrollar estrategias para reforzar la adaptación de un inoculante a
un nicho ecológico.
Los objetivos del proyecto fueron: seleccionar cepas de B. subtilis con actividad
antagónica contra hongos que ataquen la raíz de maíz; separar los metabolitos
producidos por estas cepas; y evaluar en invernadero y en campo el efecto
antagónico contra hongos de las cepas seleccionadas y los metabolitos
aislados.
Las cepas de Bacillus subtilis crecieron en un medio Papa Dextrosa Agar
(PDA), se incubaron a 25 °C y después de dos días se inocularon las bacterias
a dos cm y de manera concéntrica.
Se usaron parámetros kinéticos para analizar usando el programa estadístico
S-Plus 4.0 para Windows. La conducta fisiológica de las cepas bajo diferentes
pH y condiciones de temperatura afectaron la tasa de crecimiento que fue
diferente para cada cepa, lo que permitió establecer condiciones de crecimiento
óptima y subóptima.
De los que mostraron actividad antagónica se probó su capacidad de
protección en ensayos
in vitro de semillas inoculadas con hongos
fitopatógenos. Para esto se crecieron los hongos en medio de PDA. Se
impregnaron semillas con los diferentes aislados bacterianos que habían
mostrado actividad antagónica y otras semillas se impregnaron con agua
destilada estéril (los que fueron considerados controles). Las semillas
impregnadas se colocaron en placas de petri que contenían medio PDA y que
se habían inoculado en el centro con los hongos patógenos. Se incubaron a
25°C permitiendo el crecimiento del hongo, después se evaluó la actividad
protectora de las bacterias.
Las
bacterias
que
mostraron
la
mejor
actividad
antagónica
fueron
caracterizadas para demostrar que eran diferentes. Se utilizó una prueba de
sensibilidad a antibióticos y su caracterización metabólica.
Con el fin de evaluar la sensibilidad/resistencia de los aislados hacia diversos
antibióticos, se realizaron antibiogramas, utilizando multidiscos BIO-RAD, cat.
71080380 impregnados con los siguientes antibióticos: Amikacina (30 µg),
Ampicilina (10 µg), Cefalotina (30 µg), Ceftriaxona (30 µg), Cloranfenicol (30
µg), Dicloxacilina (1 µg), Enoxacina (10 µg) Eritromicina (15 µg) Gentamicina
(10 µg), Netilmicina (30 µg), Penicilina (10 U) y Trimetoprim-Sulfametoxazol
(25µg).
Las células libres sobrenadantes obtenidas fueron usadas en una prueba
cuantitativa para actividad de antagonismo hacia los fitopatógenos fúngicos. La
fuente de carbón usada y el crecimiento fisiológico bajo diferente temperatura y
condiciones de pH fueron factores sumamente determinantes de los
compuestos antifúngicos.
La conclusión a que llega el investigador es que es importante considerar las
condiciones óptimas de crecimiento y el estatus nutricional de las diferentes
cepas de Bacillus subtillis para la producción de metabolitos antifúngicos.
Demanda o problemática que atiende
Estudiar las señales medioambientales en la tasa de crecimiento de diferentes
cepas de Bacillus subtilis, así como la biosíntesis de los compuestos con
actividad antagónica contra hongos que atacan a la raíz del maíz.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Se logró seleccionar una colección de cepas de Bacillus subtillis con actividad
antagónica contra hongos patógenos de la raíz de maíz.
Se implementó una metodología para evaluar el efecto antagónico de las cepas
de Bacillus.
Se determinó que la actividad de las proteasas de algunas de las cepas
seleccionadas pudieran estar asociadas con el efecto antagónico.
Se determinaron los perfiles electroforéticos en geles de dos dimensiones de
aislado de Bacillus con alta actividad antagónica, y se encontraron diferencias
importantes en las proteínas que son secretadas al medio de cultivo entre éstas
cepas y una cepa control carente de actividad antagónica.
En los ensayos de invernadero, si bien no se logró la infección por Fusarium, sí
se logró seleccionar cepas bacterianas que promovieron el crecimiento de las
plantas de maíz utilizadas.
Impactos
Si bien se ensayaron diferentes métodos de aislamiento, no se logró establecer
un protocolo de purificación que permitiera obtenerlos en forma pura, pero se
generó información que servirá a futuro para diseñar una estrategia de
purificación y hacer posible la obtención de un producto.
Algunas de las estrategias utilizadas permitieron caracterizar un poco más a las
cepas bacterianas con actividad antagónica. Así, se logró establecer que
existen diferencias en las proteínas que son secretadas al medio de cultivo,
entre las diferentes cepas, en el mismo estado fisiológico.
También se determinó que las proteasas secretadas al medio de medio de
cultivo posiblemente estén participando en el efecto antagónico.
Así mismo, en los ensayos de invernadero y varios de los realizados en campo
no se logró la infección por Fusarium, lo que impidió realizar validaciones
contundentes con la protección.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
No se puede estimar costos. Este estudio representa un avance científico que
servirá de base para estudios posteriores.
Ámbito de aplicación
Comunidad científica nacional.
Información adicional o comentario
El género Bacillus incluye una variedad de especies industrialmente
importantes que son comúnmente usadas en la industria de la fermentación.
Las cepas de Bacillus de diferentes fuentes pueden ser cultivadas bajo
temperatura extrema y condiciones de pH para producir productos que son
estables en una amplia variedad de medioambientes rigurosos.
La amplia divergencia de los tipos fisiológicos encontrados en Bacillus spp se
atribuyen a la diversidad genética de las cepas en condiciones no patogénicas,
la relativa facilidad de cultivo y la manipulación genética y la eficiente
secreción de proteínas y metabolitos, todo lo cual hace de Bacillus uno de los
organismos preferidos para uso industrial.
Clave del proyecto: SAGARPA 2004-C01-15
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: maíz; fitomejoramiento
Investigador: doctor SILVIA VALDÉS RODRÍGUEZ, volalde@ira.cinvestav.mx
v_olalde@yahoo.com.mx
Institución: Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional