Resumen - Universidad Autónoma de Querétaro

VARIABILIDAD DE VIRUS DEL MOSAICO DE LA CAÑA EN PLANTAS DEL
MAÍZ (SCMV) EN LA COMUNIDAD DE NEXTEPAC JALISCO
Calvillo Medina R. P. (1); Silva Rosales L.(2); Ruiz Castro S.(2)
(1)Facultad de Ciencias Naturales
(2)
Universidad Autónoma de Querétaro
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional,
Unidad Irapuato
RESUMEN
En el presente trabajo se realizó la secuenciación de una muestra de planta de maíz (Zea
mays) infectada con el virus del mosaico de la caña de azúcar de la comunidad de Nextipac
en el municipio de Zapopan, Jalisco; analizando el gen que codifica para la proteína viral
P1. Es sabido que este gen presenta la región UTR, la cual ha sido usada para realizar
filogenia del microrganismo. En el proyecto se analizaron nueve muestras de maíz de las
cuales todas salieron positivas para el virus en el análisis de RT-PCR. Sin embargo
después de la clonación, la transformación bacteriana, la extracción del ADN plásmico y la
digestión de dicho material genético se obtuvo una única muestra positiva para la
secuenciación. A pesar de esto, en los resultados finales no se logró estudiar la secuencia
genética por la duración del programa “Verano de la Ciencia”.
INTRODUCCIÓN
El virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV) es uno de los fitopatógenos que más
perdidas causa en los cultivos de todo el mundo. Infecta a la planta del maíz (Zea mays)
causando clorosis en la hojas y enanismo en los frutos (Xianchun et. al. 1999). Este virus
pertenece a la familia de los potyvirus, se encuentra ubicado taxonómicamente en el
subgrupo que contiene cuatro distintos virus: el MDMV, JGMV, SrMV y SCMV (Kuntze
et. al., 1997). Dichos microrganismos son transmitidos por áfidos, el control directo del de
estos virus no es eficiente, ya que no se ha podido controlar la persistencia del virus en el
vector (Xu et. al., 1999). La manera más efectiva de evitar pérdidas millonarias en la
industria agrícola es por medio de la introducción de plantas resistentes al microorganismo
(Fuchs et. al., 1998) El problema que causa el virus se amplia al no poder distinguir entre
el MDMV y el SCMV, ya que ambos infectan al maíz causando sintomatologías muy
parecidas que sólo se pueden diferenciar por análisis de nucleótidos de ambos virus
(Ignjatovic et. al., 1995). Las similitudes entre estos dos virus muestran líneas evolutivas
muy cercas que es necesario clarificar por medio de estudios genéticos (Shukla et. al.,
1989). Por estos motivos es prudente conocer la línea evolutiva del SCMV para así poder
generar plantas resistentes al patógeno y evitar las perdidas de los cultivos. En el presente
trabajo se analizó la secuencia UTR de gen que codifica para la proteína viral P1 que según
Espejel y colaboradores (2006), muestra amplia variabilidad genética para realizar estudios
filogenéticos.
METODOLOGÍA
Todos los experimentos se realizaron por duplicado por la falta de experiencia de la
estudiante que los efectuó. En aislados de ARN total de nueve plantas de maíz (Zea mays)
obtenidas de la localidad de Nextipac ubicada en el municipio de Zapopan, Jalisco. Estas
nueves muestras se trabajaron con la siguiente numeración 10,17.5, 20, 21.5, 32, 41, 41.2,
43,45.2 Para el RT, se usó un l el oligo 3´ complementario a la región UTR del genoma
viral, ajustando la concentración de ARN a cinco µl y agregando la enzima la enzima RT
polimerasa Super Strip II de la compañía Invitrogen a concentración 200U/l.
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Para el PCR se agregaron 50 l del cDNA obtenido en la reacción RT, un l del primer
3´(30 pmol/l), un l del primer 5´(30 pmol/l) y 0.5 l de Taq DNA polimerasa de la
marca Fermentas (5U/l). Una vez obtenido el cDNA del PCR se realizó la clonación con
el vector pGEM Easy Vector™ de Promega, posteriormente se hizo la transformación
bacteriana usando a la bacteria E. Coli cepa JM 109, las cuales crecieron en agar LB
adicionado con ampicilina en una concentración 100 g/ l. Cada colonia que proliferaó en
estas placas; se aisló en cajas petri nuevas con el mismo agar y se hicieron crecer en medio
LB líquido con ampicilina a la misma concentración anterior para realizar la extracción del
plásmido. Como análisis de diagnostico se realizó PCR en colonia con cinco l de las
bacterias disueltas es 10 l de agua estéril usando 0.2 l de la enzima Taq DNA
polimerasa de la marca Fermentas. Para la extracción del plásmido se utilizó el kit
GeneJET™ Plasmid Miniprep de la compañía Fermentas. Cuando se obtuvo el plásmido
con el inserto viral se digirió este fragmento con la enzima de restricción ECOR 1 de la
compañía Invitrogen, con la cual se liberó el inserto de interés. Para corroborar la presencia
del fragmento viral en la nueves muestras en el RT-PCR, la clonación, el PCR en colonia y
la digestión del plásmido se efectuó elecroforesis a geles de agarosa al 0.8%, estos se
corrieron a 120 voltios utilizando dos l de marcador de un kb y un colorante de azul de
bromofenol y azul de xinencianol agregado a cada muestra de ADN puesta en el gel. Una
vez corridos los geles se tiñeron con bromuro de etidio y revisados con luz UV. Después
de esto se mandó secuenciar el ADN en el departamento correspondiente del CINVESTAV
unidad Irapuato.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
De las nueve muestras estudiadas, se logró mandar secuenciar una muestra, la 32 por
cuestiones de tiempo no se pudo analizar la secuenciación de este ADN.
En la figura 1 se muestra el resultado de RT-PCR realizado a las nueve muestras. Se puede
observar la presencia del fragmento viral en estas, el cual pesa 790 pb. Del lado izquierdo
en el primer carril del gel se ve el marcado de 1kb. Las últimas dos bandas del lado
derecho corresponden al control negativo (C-) y al control positivo (C+). En algunos
carriles se observan dos bandas, esto se dio por la falta de afinidad de los oligos usados en
el RT-PCR. Las bandas que se ven al final del gel corresponden a los oligos dimerizados,
la presencia de estos primers se puede evitar modificando las temperaturas y tiempos en el
PCR (Brownie et. al., 1997).
Figura 1. RT-PCR de las muestras 10,17.5, 20, 21.5, 32, 41, 41.2, 43, 45.2 C+ y C-
Las transformaciones bacterianas de las nueve muestras crecieron en el agar, sin embargo
no todas mostraron el fragmento viral al realizar el PCR en colonia. Esto se debe a que las
bacterias pudieron haber inserto el plásmido en su organismo; el cual les proporcionaba
capacidad para crecer en el medio con antibiótico. Sin embargo el ADN no incluía el
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inserto viral por lo cual salieron negativas en el PCR (Robles y Doers, 1994).
En la figura 2, se muestran el PCR en colonia positivo de las muestras 32 colonia 7
(izquierda), la 21.5 colonia 1 y 45. 2 colonia 9 (centro); la 32 colonia 4 y la 45.2 colonia 5
(derecha). En el primer la izquierda y los dos últimos de la derecha se muestran lo mismo
que en la anterior figura.
Figura 2. PCR en colonia de las muestras 17.5 (1,2), 21.5 (3,4, 5) y 32 (6,7,8 y 9) figura de la izquierda. En el
centro las 21.5 (1), 32(2), 43(3) y 45.2 (4,5,6,7,8 y 9). Derechas 10 (1), 17.5(2), 20 (3), 32(4) y 45.2 (5).
Después de la realización del PCR en colonia a las muestras y sus respectivas colonias que
salieron positivas se hizo la extracción y digestión del plásmido. El último de estos dos
experimentos fue el que más problemas presentó. Esto pudo haber sido por la falta de
experiencia al realizar el pipeteo de la enzima ECOR 1 o por la poca cantidad de ADN
viral en las muestras. Lo cual causó la digestión de muy poco ADN insertado en el
plásmido y por esto no se observó la banda estudiada (figura 3). La poca cantidad de ADN
viral insertado en el plásmido se observar en la figura anterior ( centro y derecha) en las
cuales las muestras 21.5 (1), 45.2 (9), 32(4) y la 45.2 (5) presentan una banda muy tenue,
lo que indica poca cantidad de ADN. No se realizó la recuperación del material genético en
los geles para así analizar la concentración de este.
En la figura 3 se observa las digestiones realizadas a las muestras anteriores 32(7)
izquierda, 21.5(1), 45.2(9) centro; 32(4) y 45.2(5). La imagen muestra que la única que
presenta el fragmento viral es la 32(7) izquierda. Las tres imágenes tienen en el primer
carril de la derecha el marcador de 1 kb y la del centro tiene un control positivo en el
último carril de la derecha. Este control se usó para probar la eficiencia de la enzima
ECOR 1.
Figura 3. Digestión de las muestras que presentaron el fragmento viral en el PCR en
colonia.
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Por último se mando secuenciar el ADN obtenido de la muestra 32(7), la cual fue la única
que salió positiva en la electroforesis de la digestión. No se logró estudiar dicha
secuenciación por falta de tiempo.
CONCLUSIONES
Se logró obtener el ADN digerido de sólo una muestra, sin embargo no se pudo realizar los
análisis de bioinformática por falta de tiempo y la poca experiencia que se tenía en las
técnicas usadas en el proyecto. Sería necesario tener periodos de tiempo más largos para
poder concluir proyectos tan complejos y así poder abarcar los objetivos planteados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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