Tema 19. Efecto de xenobióticos sobre el metabolismo de ácidos

TEMA 18. EFECTO DE LOS XENOBIÓTICOS SOBRE PROTEÍNAS Y ADN
Una extensa variedad de xenobióticos (Xbs) pueden ejercer efectos primarios o
secundarios sobre los ácidos nucleicos. Es interesante identificar los efectos directos ó
indirectos y los procesos bioquímicos implicados. En este tema veremos los aspectos
básicos, algunos ejemplos de tóxicos específicos, fundamentalmente del ADN y algún
método de estudio.
Como ya se ha comentado en otros temas, muchos Xbs (en su mayoría
carcinógenos) actúan en el organismo mediante la formación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) o a través de la formación de aductos con las proteínas y con el ADN
(ver el tema 16). La formación de aductos requiere la existencia de grupos electrofílicos
(deficientes en electrones) en el Xb (ó carcinógeno) y de centros nucleofílicos (ricos en
electrones) tales como grupos amino, sulfhidrilo, hidroxilo, presentes en otras moléculas
(proteínas, ARN y ADN). Estos aductos distorsionan la estructura de Las proteínas y/o
ácidos nucleicos y, por tanto, su función o replicación en su caso. En el caso del ADN,
normalmente el daño producido puede ser reparado, pero si no lo es, se introduce una
base inapropiada en la nueva cadena de ADN, lo que originaría una mutación.
UNION
COVALENTE
DE
INTERMEDIARIOS
REACTIVOS
A
BIOMOLECULAS
La principal fuente de intermediarios reactivos derivados de los Xb es el hígado, ya
que es el lugar principal de su metabolismo. La unión covalente a proteínas celulares (del
citoplasma, retículo endoplásmico o núcleo), así como a ácidos nucleicos u otras
macromoléculas, causa un daño que dependerá, fundamentalmente, de:
- La reactividad del compuesto y su vida media
- La extensión de la unión
- La molécula a la que se une.
- Límite de tolerancia.
En el tema 16 veremos con más detalle la formación de aductos con proteínas y ác.
Nucleicos. A continuación se muestran, únicamente, algunos ejemplos.
Curso 08/09
1
EJEMPLO de compuestos que inducen toxicidad mediante su unión covalente a
moléculas biológicas.
Xenobiótico
Metabolito reactivo propuesto
Bromobenceno
Órgano blanco y sitio de unión
3,4-epóxido y/o orto-quinona
Hígado
Acetaminofen
N-acetil-p-benzo quinonimina
Hígado
Cl4C
radical triclorometil y/o fosgeno
Hígado
p-aminofenol
quinonimina
Riñón
H
Ipomeanol
epóxido
Pulmón
PROTEINAS
La modificación covalente de proteínas puede tener profundos efectos sobre su
estructura y actividad biológica. Algunos efectos bien conocidos incluyen la
fosforilación, carboxilación, metilación, glicosilación y unión a ácidos grasos. Todo ello
puede afectar a la estructura de membranas, metabolismo energético, transporte de
metabolitos e iones, etc.
La disminución de la incorporación de aminoácidos radiactivos en proteínas es
con frecuencia secundario a los efectos de los tóxicos sobre la producción de energía o
sobre la síntesis de mARN. Muy pocos tóxicos inhiben la síntesis de proteínas por
inhibición de etapas implicadas en su síntesis. Entre ellos están la cicloheximida, que
bloquea la peptidil transferasa, la puromicina, que produce la terminación prematura de
la cadena y liberación de la recien sintetizada. Otros inhibidores (CCl4 y tolueno)
producen la disgregación de poliribosomas en monoribosomas y a veces en subunidades
ribosómicas.
Algunos tóxicos pueden inducir la síntesis específica de proteínas. La
metalotioneína, por ejemplo, es una proteína que une metales (Zn2+, Cd2+, Hg2+, MeHg1+ y otros metales pesados catiónicos). Esta capacidad se debe al alto contenido en
cisteinas (33%) y grupos SH. La administración de éstos metales hace que aumente la
síntesis
de metalotioneína al aumentar, previamente, la síntesis del mARN
correspondiente. Así, la metalotioneína del tejido renal aumenta por exposición repetida
Curso 08/09
2
al mercurio. Otros agentes que inducen la síntesis de metalotioneina son los
corticosteroides y el CCl4.
REACCIONES CON PROTEÍNAS. Entre los intermediarios reactivos que pueden
unirse de forma covalente a las proteínas se encuentran los siguientes:
:
ALDEHIDOS
CARBONILOS  Y :
HALUROSDE ALQUILO
EPÓXIDOS
ACIL GLUCURÓNIDOS
Curso 08/09
3
FORMACION DE ADUCTOS DE ADN
Un gran número de Xbs pueden dañar el ADN. En el siguiente esquema se
observa la conversión de un carcinógeno en un aducto de ADN y las posibles
consecuencias.
C arcin ógen o
C arcin ógen o
p ró xim o
C arcin ógen o
ú ltim o
A d u cto d e
ADN
D etoxificación
R ep aración
M u tación
N orm a l
M u erte
C án cer
Existen 4 grandes clases de compuestos que ejercen sus efectos mediante la
formación de aductos covalentes con bases del ADN (carcinógenos genotóxicos, sus
efectos se estudian en el tema 19):
a) hidrocarcuros aromáticos policíclicos (PAH),
b) aminas aromáticas,
c) nitrosaminas
d) otros agentes alquilantes.
Todos ellos tienen grupos electrofílicos o grupos que se pueden convertir en
electrofílicos metabólicamente (epóxidos, hidroxilaciones). Estos grupos forman enlaces
covalentes con nucleófilos presentes en el ADN, lo que origina la acción cancerígena.
a) HIDROCARBUROS AROMATICOS POLICICLICOS
Se forman como productos de la combustión de petróleo y material biológico,
también se generan en el tabaco, whisky, carnes a la brasa y por combustión incompleta
de combustibles fósiles (carbón y gasolina). Forman aductos con bases púricas,
especialmente guanina, pero solamente tras la activación enzimática a carcinógeno
próximo o último.
Curso 08/09
4
Región
bahíabahía
bahía
Carcinógeno
Carcinógeno próximo
Carcinógeno último
Fenantreno inactivo
b) AMINAS AROMATICAS
Se usan en la industria del tinte ó del caucho (goma). Un ejemplo es el 2acetilaminofluoreno (AAF) que causa en animales múltiples cánceres (vejiga, hígado,
intestino, oído, tiroides y pecho) (en ratas necesita del orden de g). Se ha usado como
insecticida y algunos compuestos relacionados se encuentran en las carnes cocinadas
(millonésima de g).
Carcinógeno
Carcinógeno próximo
Carcinógeno último
Curso 08/09
.
5
c) NITROSAMINAS
Se forman en las carnes y pescados ahumados por interacción entre aminas
naturales y nitritos añadidos como conservantes, pero su presencia mayoritaria está en el
tabaco y sus productos. Actualmente se sabe que los efectos carcinógenos de las
nitrosaminas están relacionados con los mecanismos bioquímicos que las activan (por
ej. las oxidasas microsomales de función mixta).
Espontánea
N-Methylnitrosourea
La mayoría de las nitrosaminas requieren la activación enzimática para formar el
carcinógeno último. El mecanismo bioquímico por medio del cual se produce el cáncer
se cree que tiene relación con la metilación de algunas bases nitrogenadas en el ADN,
probablemente con la escisión (eliminación) de las bases nitrogenadas alquiladas más
que con el nivel de alquilación.
d) OTROS AGENTES ALQUILANTES
Entre los carcinógenos químicos más significativos en la iniciación del cáncer
destacan los agentes alquilantes (metilo, etilo). Estos atacan grupos nucleofílicos del
ADN y
pueden iniciar la secuencia de sucesos que dan lugar al crecimiento y
replicación de células neoplásicas (cancerosas).
Curso 08/09
6
Un ejemplo es el cloruro de vinilo (gas descubierto en 1817, usado en la
industria del plástico como PVC):
Agente monofuncional
CH2=CH-Cl
Grupos metilo
unidos a N (izqda)
u O (derecha)
en Guaninas
contenidas en el
ADN
Cloruro de vinilo
Unión al resto de la molécula de ADN
Otro ejemplo de este grupo es el gas mostaza, con grupos suficientemente
electrófilos que no requieren activación (carcinógeno directo). El término mostaza se
refiere a las ampollas que producen estos agentes en la piel. En agua, los compuestos
originarios forman un electrófilo que reacciona con nucleófilos biológicos. Las mostazas
nitrogenadas reaccionan con las bases de los ácidos nucleicos La reacción del N7 de la
guanina con la mecloretamina se ilustra en la figura.
La base modificada puede aparearse anormalmente durante la replicación (3) e
inducir mutaciones, pero tambien puede ser eliminada del ADN (4), lo que produce
escisión de la cadena, o producir la fragmentación del ADN (5) al romperse el anillo.
También puede haber entrecruzamiento de cadenas de ADN (6). Puesto que los agentes
alquilantes modifican el crecimiento celular, la mitosis, la diferenciación y la función de
la célula, las células que se están dividiendo más rápido, son las más susceptibles a la
acción de estos agentes. En células que se dividen lentamente, los procesos de
Curso 08/09
7
reparación del ADN pueden revertir los efectos de la modificación del ADN. Las
mostazas nitrogenadas son, por tanto, mutágenas y carcinógenas. Sin embargo, y debido
a la propia acción de estos agentes sobre las células en división, muchos de ellos se usan
en el tratamiento contra el cáncer.
Finalmente, la estructura de las ADN polimerasas también influye en la
inhibición de las mismas por tóxicos. La polimerasa- contiene uno o más grupos SH
críticos, por lo que es muy sensible a sustancias que reaccionan con estos grupos, como
es el caso de la N-etilmaleimida. La polimerasa- no tiene grupos SH críticos por lo que
no es sensible a tales sustancias.
EFECTO DE LOS XENOBIOTICOS SOBRE EL ARN
La acción sobre el ARN no es tan importante como en el caso del ADN. Aunque
un tóxico puede inhibir la síntesis de todas las especies de ARN (mARN, tARN y
rARN), el mARN es el que exhibe las manifestaciones más tempranas de la toxicidad,
lo que implica una disminución de los niveles de enzimas y proteínas de vida media
corta.
En muchos casos la inhibición de la síntesis de mARN es secundaria a otros
mecanismos. Por ej. la actinomicina D (antibiótico, inhibidor específico de la síntesis de
ARN), se une a la desoxiguanosina del ADN (se intercala entre 2 pares G-C adyacentes)
y bloquea el movimiento de la ARN polimerasa (ARNp) sobre el molde de ADN. A
bajas dosis se inhibe la síntesis de rARN y a altas dosis la de mARN. Otro ej. es la
inhibición de la síntesis de mARN secundaria a la interferencia en la producción de
energía (inhibición de la fosforilación oxidativa o alteraciones en la estructura
mitocondrial).
La estructura de las ARNp también influye en la inhibición de las mismas por
tóxicos. Así, las ARNp muestran distinta sensibilidad a la -amanitina, toxina de la
amanita faloides (ver tema 17).
Curso 08/09
8
TEST DE GENOTOXICIDAD (TEST DE AMES)
Se han desarrollado muchos tests de genotoxicidad para medir la capacidad de
mutágenos y carcinógenos de producir cambios cuantificables en el genotipo de células
procariotas y eucariotas detectables mediante cambios en el fenotipo. Normalmente se
utiliza para ello la mutación de genes, daño cromosómico, daño y reparación del ADN y
transformación celular. Se han desarrollado ensayos en bacterias, hongos, células de
roedores, humanas, etc.
La mayoría de los ensayos de transformación en mamíferos miden la aparición de
células alteradas morfológicamente por el agente mutágeno o carcinógeno. Suelen usarse
células derivadas de fibroblastos de ratón, que son células muy uniformes tanto en su
crecimiento como en la morfología. Sin embargo, si el efecto es mediante un mecanismo
no-genotóxico o epigenético, como ocurre con los promotores de tumores, no se detecta
mediante estas técnicas. Ello se refleja parcialmente en la pérdida de relación entre
mutagénesis y carcinogénesis. Hasta el momento se dispone de pocos ensayos para la
identificación de promotores tumorales, y la mayoría de ellos han sido identificados a
través de experimentos de iniciación-promoción en roedores.
Una de las pruebas que se utilizan para correlacionar la capacidad carcinogénica
con la capacidad de afectar al ADN celular es el denominado TEST de AMES. Se realiza
añadiendo a cultivos de Salmonella typhimurium el carcinógeno cuya mutagenicidad se
pretende analizar. Estos cultivos se realizan en un medio carente de histidina, de forma
que solamente crecen bactaerias con mutaciones en alguno de los genes que metabolizan
este aminoácido. A mayor número de colonias mayor capacidad mutagénica del
carcinógeno. El mayor problema de este Test es la utilización de bacterias, las cuales no
son capaces de activar metabólicamente muchos carcinógenos como ocurre en humanos y
animales. Ello llevó a la adición al medio de cultivo de extractos de hígado de animales.
Así se consigue reproducir, con bastante fiabilidad, la correlación observada en los
ensayos con animales, ahorrando tiempo y dinero.
Curso 08/09
9
SITIOS DE ACCIÓN DE FÁRMACOS SELECCIONADOS USADOS EN EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER
Síntesis de
Pirimidinas
Mercaptopurina
Tioguanina
Inhibe la síntesis del anillo
Síntesis de
purinas
de purina
Inhibe las interconversiones
de nucleótidos
Ribonucleótidos
Hidroxiurea
Metotrexato
Inhibe la reductasa de
Inhibe la síntesis del
Ribonucleótido
anillo de purina
Inhibe la formación de dTMP
Fluorouracilo
Inhibe la formación
de dTMP
Arabinósido de C
Daunorrubicina
Doxorrubicina
Bleomicinas
Etopósido
Dañan al ADN y
previenen su
reparación
Desoxirribonucleótidos
Mostazas nitrogenadas
Agentes alquilantes
Modifica el ADN
ADN
Actinomicina D
Inhibe la síntesis de ARN
ARN
CCl4
Tolueno
Disgregación de
polirribosomas
Vinblastina
Vincristina
Inhibe la función
Asparaginasa
Desamina a la asparagina
e inhibe la síntesis de proteínas
Proteína
Microtúbulos
Enzimas, factores, etc.
Curso 08/09
10