PRACTICAS DE GENETICA HUMANA Departamento de Biología Molecular Curso 2007-2008

Departamento de Biología Molecular
PRACTICAS DE GENETICA HUMANA
Curso 2007-2008
Profesora responsable: María Victoria Mendiola
Alumno:
Grupo:
Las Prácticas de Genética Humana son de realización obligatoria para todos
los alumnos de la asignatura. Se controlará la asistencia y se corregirá el cuaderno
de prácticas. Por otra parte, los contenidos teóricos de estas prácticas serán
también material de los exámenes teóricos de Junio y Septiembre.
Se realizará un total de seis prácticas que tendrán una duración de 5 días,
con el siguiente plan de trabajo:
Día 1.
Práctica 1.
Día 2.
Práctica 2.
Día 3.
Fin Práctica 2, Práctica 3 y Práctica 4.
Día 4.
Práctica 5 (1ª parte).
Día 5.
Práctica 5 (2ª parte) y Práctica 6.
Indice
Práctica 1. El cariotipo humano ............................................
p2
Práctica 2. Transformación bacteriana ....................................
p7
Práctica 3. Estudio de árboles genealógicos ...........................
p 10
Práctica 4. Herencia poligénica ............................................
p 18
Práctica 5. Análisis de polimorfismos ....................................
p 23
Práctica 6. Genética de poblaciones
p 31
....................................
1
PRACTICA 1
EL CARIOTIPO HUMANO
Cariotipo normal y de individuos con alteraciones
cromosómicas
Objetivo y material
El objetivo de esta práctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende que el alumno
aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de cariotipos que reflejan
alteraciones cromosómicas, obtenidos de individuos que presenten diferentes síndromes.
Para ello se utilizará un programa de ordenador en el que se muestran los cromosomas
metafásicos teñidos pertenecientes a diversos individuos. El alumno deberá ordenar el
cariograma y determinar si existen anomalías cromosómicas en cada individuo.
Introducción
El cariotipo es el complemento cromosómico particular de un individuo y viene definido
por el número y morfología de los cromosomas en la metafase mitótica. En la especie humana la
dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales).
Utilizando técnicas de tinción estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos en
metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la
posición del centrómero que define su morfología. Los autosomas se numeran del 1 al 22
ordenados por tamaños decrecientes y por la posición del centrómero. Los cromosomas sexuales
X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamaño, el cromosoma X
se incluiría en el grupo C, y el Y, en el grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda
constituido así:
Grupo
A
Pares cromosómicos
1, 2 y 3
B
4y5
C
D
E
6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12
13, 14 y 15
16, 17 y 18
F
G
X, Y
19 y 20
21 y 22
Características
Cr. muy grandes casi metacéntricos (1 y 3
metacéntricos, pero 2 submetacéntrico)
Cr. grandes y submetacéntricos, con dos brazos
muy diferentes en tamaño
Cr. medianos submetacéntricos
Cr. medianos acrocéntricos con satélites
Cr. pequeños, metacéntrico el 16 y
submetacéntricos 17, 18
Cr. pequeños y metacéntricos
Cr. pequeños y acrocéntricos, con satélites.
El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero
sin satélites.
(Todos los cromosomas autosómicos están ordenados en orden decreciente de tamaño, excepto el
cromosoma 21 que ahora se sabe que es más pequeño que el 22)
2
Sin embargo, atendiendo solamente a estos parámetros no es posible identificar
inequívocamente cada par de cromosomas. Para ello es necesario utilizar diferentes técnicas de
bandeo cromosómico. Los distintos patrones de bandas que se consiguen son constantes y
específicos de cada técnica y determinan la distribución de regiones cromosómicas que se
revelan positiva o negativamente según el método utilizado.
Clasificación de los cromosomas
A
1
2
B
4
3
5
C
6
7
8
9
10
11
12
D
1
14
E
16
15
17
18
Crs.
sexuales
19
20
21
22
X
F
Y
G
Citogenética clínica
En 1956, Tijo y Levan determinaran el complemento cromosómico diploide del hombre
(2n = 46). En 1959 Lejeune describió la primera cromosomopatía o enfermedad originada por
una alteración cromosómica, el síndrome de Down producido por una trisomía del cromosoma
21. Desde entonces, la Citogenética Humana ha ido desarrollándose como una ciencia médica.
3
Hay dos tipos fundamentales de cromosomopatías:
- Variaciones cromosómicas estructurales: afectan a la estructura del cromosoma en
cuanto a la ordenación lineal de los genes. Aquí se incluyen deleciones, duplicaciones,
inversiones y translocaciones.
- Variaciones cromosómicas numéricas: afectan al número de cromosomas. Incluyen las
poliploidías (triploidía: 3n; tetraploidía: 4n) y los diversos tipos de aneuploidía (trisomías: 2n+1;
monosomías: 2n-1).
Por otra parte, las anomalías cromosómicas pueden afectar a los autosomas o a los
cromosomas sexuales.
Las alteraciones cromosómicas más frecuentes en humanos son:
Anomalías autosómicas:
Síndrome de Down, por trisomía del cromosoma 21, translocación 21/21 o translocación 14/21.
Síndrome de Patau, por trisomía del par 13.
Síndrome de Edwards, por trisomía del par 18.
Síndrome Cri du Chat, por deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5 (5p).
Síndrome de DiGeorge, por deleción parcial del brazo largo del cromosoma 22 (22q11).
Cromosoma Filadelfia, formado por una translocación entre los cromosomas 9 y 22.
Anomalías de los cromosomas sexuales:
Síndrome de Klinefelter, por una constitución XXY, XXXY, XXXXY.
Síndrome XYY, cromosoma Y extra en varones.
Síndrome de Turner, constitución X0.
Síndrome XXX, cromosoma X extra en mujeres.
Actualmente se ha llegado a profundizar bastante en el conocimiento del cariotipo
humano y se sabe que es relativamente frecuente la aparición de anomalías cromosómicas. Por
ejemplo, cerca de un 25% de los abortos ocurridos antes de la octava semana de gestación tienen
cariotipos anormales y un 0,5% de los recién nacidos presentan aneuploidías.
Estas alteraciones no sólo pueden producir anomalías en el propio individuo portador sino
que, por tratarse de anomalías genéticas, pueden transmitirse a la descendencia en el caso de que
afecten a las células germinales. La detección anticipada de anomalías cromosómicas permite
dictaminar las posibilidades de que la descendencia de una pareja portadora de una de ellas pueda
presentarla o no. Para ello es preciso conocer el cariotipo de cada progenitor, lo que permite
emitir un diagnóstico de su posible descendencia, con lo que el individuo será consciente de sus
posibilidades.
El estudio del cariotipo tiene también su aplicación en el diagnóstico prenatal. Es posible
determinar la constitución cromosómica del feto antes de su nacimiento pudiendo así observarse
si presenta alguna anomalía cromosómica detectable. Hoy en día, el diagnóstico prenatal se
practica a posteriori del inicio de la gestación y los resultados positivos suelen plantear
conflictos éticos y emocionales. Si bien, en muchos casos este tipo de diagnóstico es el único
posible, como cuando la anomalía cromosómica se produce en las células germinales de uno de
los progenitores.
4
Protocolo
En la pantalla se presentarán los cromosomas desordenados sobre la plantilla donde hay
que ordenar el cariograma. Pinchando con el ratón y arrastrándolos, se irán colocando sobre la
casilla correspondiente. Habrá que ordenarlos por parejas según su tamaño, la posición del
centrómero y las bandas, teniendo en cuenta las siguientes reglas:
- pinchando en “align all”, todos los cromosomas se colocarán en posición vertical,
facilitando su ordenación.
- el brazo largo de cada cromosoma se sitúa hacia abajo. Para dar la vuelta a un
cromosoma, pinchar dos veces sobre el mismo.
- los autosomas se disponen en orden decreciente de tamaños mientras que los
cromosomas sexuales deben ir por separado.
- hay en total 5 cariotipos distintos (5 muestras o “samples”). Se recomienda empezar por
la primera y hacer como mínimo las muestras 1, 2 y 3.
Siguiendo estas instrucciones generales, proceder de la siguiente manera:
1. Contar los cromosomas y apuntar el número.
2. Buscar y colocar los cromosomas más pequeños y acrocéntricos que corresponden al
grupo G y, cuando está presente, al cromosoma Y que será el más largo de los anteriores. En total
serán 5 si es XY o 4 si es XX.
3. Buscar otros 6 cromosomas acrocéntricos pero más grandes que los
anteriores y que constituyen el grupo D. Colocarlos emparejados.
4. Buscar los 4 cromosomas más pequeños que nos quedan, que son
metacéntricos. Colocarlos en el grupo F.
5. Buscar los cromosomas del grupo E que son 6, algo mayores que los F. Dos de las
parejas, la 17 y 18, son submetacéntricos y la 16 metacéntricos.
6. Buscar los 6 cromosomas del grupo A. Son los mayores. Los pares 1 y 3 son
metacéntricos (el 1 mayor que el 3) y el 2 submetacéntrico.
7. Buscar los 4 cromosomas del grupo B que son los submetacéntricos de mayor tamaño.
8. Buscar los 14 cromosomas del grupo C. Encontraremos más de 14 cromosomas, ya
que el cromosoma X es idéntico a los que constituyen el par 12. Para diferenciarlo hay que
recurrir al estudio de las bandas lo mismo que, en general, para numerar las parejas dentro de
cada grupo.
En el caso de que haya más de 46 cromosomas, buscar a qué grupo pertenece el
sobrante, colocarlo allí y señalar el síndrome a que da lugar esta anomalía. En caso de que el
número de cromosomas sea inferior a 46 señalar el cromosoma que falta así como el síndrome a
que da lugar esta anomalía.
Si el número de cromosomas es de 46, estudiar cada cromosoma para comprobar si hay
algún tipo de alteración estructural (deleciones, translocaciones...).
Cuando hayamos terminado, pinchando en “Verify” el programa nos indicará si los
cromosomas están colocados correctamente. Sobre los que no aparezca la marca roja, es que
están mal colocados. A veces simplemente hay que colocar bien el cromosoma dentro de su
casilla, si no no se detecta.
Por último, hay que hacer el diagnóstico del cariotipo obtenido. Pinchando en “diagnosis”
saldrán varias opciones; se elegirá la que se estime oportuna, y el programa nos dirá si hemos
acertado. Si el diagnóstico no es correcto, vuelve a observar el cariograma detenidamente. Si lo
es, puedes pasar a la siguiente muestra.
5
Preguntas de la práctica:
1.- ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de
otros?
2.- ¿Qué células del organismo llevan el cariotipo diploide completo?
3.- ¿Qué mecanismos cromosómicos producen anomalías del cariotipo humano?
4.- ¿Se manifiestan siempre las alteraciones cromosómicas en el fenotipo del
individuo que las transmite? Explica tu respuesta.
Respuestas:
6
PRACTICA 2
TRANSFORMACION BACTERIANA
Objetivo y material
Familiarizar al alumno con técnicas de biología molecular de uso general tanto en
estudios de genética básica como en aplicaciones tecnológicas. Se observará la adquisición de
resistencia al antibiótico Ampicilina de una cepa de Escherichia coli inicialmente sensible al
antibiótico.
Introducción
La transformación es un proceso por el cual las células captan ADN libre presente en el
medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia con
que ocurre varía enormemente de unas especies a otras. Para que ocurra la transformación, la
bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas
condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana
celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula.
En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de
competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas
técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen poros en la pared, lo
que permite una transformación bastante eficiente. Algunos de estos métodos son la
electroporación, consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso
eléctrico muy breve e intenso, o tratamientos químicos con sustancias como el cloruro cálcico o
el TSB. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del
cultivo se hacen competentes.
La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos
permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular superenrollada en casi
cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno
de los más utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, el ADN
introducido llevará un marcador seleccionable.
Materiales
La bacteria a transformar será una estirpe de E. coli de uso común en el laboratorio, que
se denomina DH5. Estas bacterias son sensibles al antibiótico Ampicilina, es decir, no son
capaces de crecer en un medio de cultivo que contenga dicho antibiótico.
El ADN que introduciremos en estas bacterias será un plásmido, denominado pUC18, que
contiene un gen cuyo producto confiere resistencia al antibiótico Ampicilina.
Como medio de cultivo líquido utilizaremos LB (10 g/l triptona, 5 g/l extracto de
levadura, y 5 g/l de ClNa), un medio rico en nutrientes en el que las bacterias se multiplican con
rapidez. El medio de cultivo sólido será LA (LB con agar al 1.5%). Tanto LB como LA se
tendrán ya preparados y esterilizados, pero el medio sólido habrá que repartirlo en placas de Petri
y añadir en su caso el antibiótico para conseguir un medio selectivo para los transformantes.
Para la inducción de la competencia y posterior transformación usaremos el medio TSB,
que contiene, aparte de los componentes del LB, lo siguiente: 10% PEG, 5% DMSO, 10mM
MgCl2, 10 mM MgSO4. También se utilizará TSB suplementado con 20mM de glucosa.
7
Protocolo
Durante todo el proceso, y para evitar la contaminación del cultivo bacteriano, habrá que
trabajar en condiciones de esterilidad.
Día 0
1.
Inocular las bacterias en 10 ml de LB e incubar a 37ºC con agitación toda la
noche.
Día 1
1.
Diluír 1/10 el cultivo bacteriano (1 ml del cultivo en 10 ml de medio de cultivo
LB fresco)
2.
Incubar una hora a 37ºC con agitación.
3.
Durante el tiempo de incubación, aprovecharemos para comprobar que la estufa
esté a 37ºC y descongelar reactivos. También prepararemos el medio sólido. El bote de LA ya
preparado, esterilizado y solidificado, lo introduciremos en el microondas para que se funda.
Después se deja enfriar hasta unos 50ºC (que se pueda coger el bote sin quemarse) y se añade, en
su caso, el antibiótico Ampicilina. Utilizaremos un stock de Ampicilina disuelta en agua
destilada y estéril a una concentración de 100 mg/ml. Queremos alcanzar una concentración final
de antibiótico en el medio de cultivo de 100 g/ml. Se mezcla suavemente y se vierte sobre
placas de Petri (unos 25 ml por placa). Se deja sobre una superficie plana hasta que solidifique.
Todo esto se debe realizar en condiciones de esterilidad.
4.
Medir la D.O. (densidad óptica, o absorbancia) a 600 nm de 1ml del cultivo.
Queremos que las bacterias se encuentren en fase exponencial, por lo que la D.O. debe estar entre
0.3 y 0.9. Una D.O. de 0.5 se corresponde aproximadamente con una concentración de 108
bacterias/ml.
5.
Centrifugar las células, 10 minutos a 4000 rpm. Mientras se centrifuga, coger
hielo picado de la máquina para el paso siguiente.
6.
Tirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de bacterias en 1/10 del
volumen inicial (1ml) de TSB frío y dejar en hielo 10 minutos. Durante este tiempo, las bacterias
van adquiriendo el estado de competencia.
7.
Poner dos tubos eppendorf estériles en hielo. Marcarlos como A y B. Poner en
cada uno 100 l de células.
8.
Al tubo A, añadirle 2 l (0,5 g) del ADN plasmídico.
9.
Incubar 5 minutos más en hielo.
10.
Sacar los tubos del hielo. Añadir a cada uno 900 l de TSB con glucosa.
11.
Incubar 15 minutos a 37ºC para dar tiempo a que se expresen los genes recién
introducidos en la célula.
12.
Sembrar 100 l de cada tubo en una placa de LB+ampicilina. Sembrar también
100 l en una placa de LB sin antibiótico.
13.
Dejar las placas en la estufa de 37ºC hasta el día siguiente.
Día 2
1.
Observar el crecimiento en las placas. Contar las colonias que hayan crecido en las
placas de LB+Ampicilina. Una incubación excesivamente larga de estas placas, o un número
muy elevado de colonias, podrían dar lugar a la aparición de "colonias satélite" de pequeño
tamaño alrededor de las colonias grandes; estas pequeñas colonias no se contabilizan, pues no
8
representan bacterias que hayan adquirido el gen de resistencia, sino más bien bacterias que
consiguen crecer gracias a que las bacterias resistentes degradan el antibiótico a su alrededor.
Preguntas de la práctica
1.
Calcular el número de transformantes por g de ADN añadido, con la
fórmula: (nº de colonias / g ADN añadidos) x10 (porque hemos sembrado sólo
la décima parte de la transformación)
2.
Calcular la frecuencia de transformación utilizando la fórmula
nº transformantes / g ADN
Frec. transf =
________________________
nº células totales
Para calcular el número de células habrá que partir de la D.O. del cultivo
inicial y de ahí calcular, primero, cuántas células había en el cultivo de partida, y
segundo, cuántas en el tubo A.
3.
En la placa de LB+Ampicilina sembrada con 100 l del tubo B no debería
haber colonias. ¿Sabrías explicar por qué? ¿Para qué se realiza este control?
4.
Describe qué observas en la placa de LB sin Ampicilina, y explícalo.
Respuestas
9
PRACTICA 3
ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA
Objetivo y material
El objetivo de esta práctica es que el alumno aprenda a confeccionar y esquematizar
árboles genealógicos; a determinar, en la medida de los posible, el genotipo de los individuos que
lo componen, y a conocer la transmisión de algunos caracteres sencillos y de fácil observación.
El material biológico de esta práctica serán los propios alumnos y sus familiares para la
observación de algunos caracteres genéticos. Con sus datos se elaborarán las genealogías.
Introducción
El hombre presenta ciertas características especiales que lo califican como un material
difícil para el estudio genético. De hecho, estas características son:
1. Hay una gran diversidad genética de individuos, y también la estructura genética de las
poblaciones humanas varía continuamente debido a las migraciones, la mezcla de razas, etc.
2. Por motivos éticos y morales no se practican cruzamientos experimentales, de los que
por otra parte no se obtendría gran información, ya que:
a) de cada parto suele nacer un solo individuo
b) las gestaciones son largas
c) entre una generación y la siguiente transcurre mucho tiempo
d) el tamaño de las familias es pequeño.
En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigación genética
presentan características mucho más ventajosas. Por ejemplo en los ratones, ocurre una
generación cada dos meses y los descendientes de cada pareja pueden contarse por decenas. En
Drosophila, la generación dura 20 días y se cuentan los descendientes por centenares.
Así, en estos organismos y otros de características similares, los cruzamientos
experimentales constituyen uno de los mejores métodos para el conocimiento de los caracteres
hereditarios.
Por lo tanto, la genética humana tiene que recurrir para su desarrollo a métodos indirectos
tales como el uso de pedigrís o árboles genealógicos, análisis de poblaciones, etc.
A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de técnicas
genealógicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos caracteres determinados
genéticamente y de los genes que los controlan, hasta llegar a varios millares. Posteriormente, las
técnicas citogenéticas y moleculares han permitido identificar nuevos genes y determinar su
localización cromosómica.
Protocolo
La práctica en sí consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones
fenotípicas para cada uno de los caracteres monogénicos que se describen a continuación, de
donde el alumno deducirá su genotipo en cada caso. Los datos se tomarán en una hoja como la
que se indica al final de esta práctica. Se usará una hoja de datos para cada persona.
10
Descripción de los caracteres
1) Disposición del lóbulo de la oreja. Lóbulo separado de la mejilla o pegado lateralmente a la
mejilla.
2) Línea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro denominado
"pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden contabilizar.
3) Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en forma de U fuera de
la boca.
4) Pigmentación del iris. Ojos azules frente a ojos más oscuros, sean éstos verdes o marrones. Lo
que se compara es la ausencia total o no de pigmentación en la superficie del ojo. En ausencia de
ésta, se observa la lámina interna azul del iris, y los ojos serán totalmente azules. La presencia de
pigmento en las capas superiores del iris enmascara en mayor o menor grado el color azul del
fondo. Otros genes determinan el color exacto y su intensidad para ojos verdes, marrones, etc.,
pero en esto no nos fijaremos.
5) Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia atrás la última
falange del pulgar en un ángulo de casi 90º respecto a la anterior ("dedo del autoestopista"). Esta
capacidad puede manifestarse sólo en una de las manos, y la expresividad del rasgo es variable.
6) Dedo meñique doblado. El meñique puede estar recto, o bien con la última falange doblada
hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre una mesa y se observa si los dedos
están paralelos o si los meñiques se doblan hacia dentro.
7) Longitud relativa del dedo índice. Dedo índice más o menos largo que el anular. Se realiza la
observación como en el caso anterior. Se trata de un carácter de expresión influenciada por el
sexo.
8) Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos en las mejillas.
9) Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque sólo haya algo de pelo en
alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo.
10) Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser más corto o más largo que el
índice adyacente.
11) Capacidad de detectar la feniltiocarbamida (PTC). Hay individuos que detectan un sabor
amargo y otras que no notan nada. Introducir primero en la boca el papel control, ensalivar, y
sacar de la boca. Introducir a continuación el papel impregnado en PTC y ensalivar.
11
Una vez realizada la observación, proceder de la siguiente manera:
1. Tomar los datos del fenotipo propio
2. Anotar todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos.
3. Tomar los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tíos) como sea posible.
4. Anotar los datos de cada persona en una hoja de datos diferente.
5. Confeccionar el árbol genealógico indicando el fenotipo de cada persona para, al
menos, dos de los caracteres analizados.
6. Determinar si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados.
7. En base al tipo de herencia, nombrar los alelos adjudicados a cada carácter en la hoja
de datos, usando una letra distinta para cada carácter, en mayúsculas/minúsculas para
dominante/recesivo.
8. Por último, indicar cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para cada
carácter.
Como ejemplo de árbol genealógico se seguirá un esquema como el que se indica a
continuación:
I
1
2
3
4
II
1
2
3
4
5
6
1
2
7
8
4
5
9
III
3
En la genealogía se indica el orden de las generaciones con número romano. La primera
generación (I) corresponde a la primera persona de la que se posean datos, por ejemplo la de los
abuelos del alumno; la segunda (II) correspondería a la de los padres y tíos, y la tercera (III), a la
generación del alumno.
Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con círculos, y por rombos los
individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se unen por una línea horizontal.
Los descendientes se disponen bajo una línea horizontal desde la que parte una línea vertical por
individuo, excepto en el caso de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican
por líneas convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se
indican rellenando el símbolo.
12
HOJA DE DATOS 1
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 2
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 3
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
13
HOJA DE DATOS 4
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 5
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 6
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
14
HOJA DE DATOS 7
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 8
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 9
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
15
HOJA DE DATOS 10
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 11
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 12
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lóbulo de la oreja
..... separado ..... unido
Fenotipo
Dedo autoestopista
..... presente..... ausente
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
Longitud del índice
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meñique
..... curvado
..... recto
Pigmentación del iris .... presente
..... ausente
Hoyuelos faciales
.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente
..... ausente
Dedo gordo del pie
..... corto
Detección PTC:
…. SI
..... largo
.… NO
_____________________________________________________________________________
16
ARBOLES GENEALOGICOS
17
PRACTICA 4
ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGÉNICA
Recuento de las líneas de las huellas dactilares
Objetivo y material
1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias.
2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfología.
3.- Determinar el recuento total de líneas (TRC) de un juego completo de huellas.
4.- Construír un histograma de la distribución de frecuencias con los datos obtenidos del grupo
de prácticas.
5.- Discutir las características de la herencia poligénica y el por qué de su difícil análisis.
Introducción
La herencia poligénica no se puede analizar empleando pedigríes ni estudiando los
cromosomas (de no ser que se estudie una aberración cromosómica en concreto). Un rasgo
poligénico es el fenotipo resultante de la acción de dos o más genes. Estos tienen unas
características comunes:
1.- los rasgos se cuantifican midiéndose,
2.-los rasgos son controlados por 2 o más genes resultando en un efecto aditivo,
3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos múltiples,
4.- los fenotipos de los rasgos poligénicos y multifactoriales varían de expresión
por efecto de los factores ambientales.
Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el peso, la
inteligencia, el color de la piel, etc.
Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos poligénicos no es fácil. El ejemplo que a
continuación te proponemos estudiar explorará cómo los rasgos de la herencia de las huellas
dactilares son modelos de herencia poligénicas. Recogeréis las huellas dactilares vuestras y
prepararéis un perfil de las mismas.
En 1890, Francis Galton sugirió que las huellas dactilares serían una buena manera de
identificación para humanos. Durante los últimos años de hecho, tanto los dibujos de las huellas
dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las palmas de las manos y pies han sido de
gran interés para numerosos estudios especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la
huella del recién nacido para el diagnóstico precoz de anormalidades cromosómicas.
La herencia de las huellas dactilares, al igual que los demás caracteres de herencia
poligénica, también se ve influída por factores ambientales aunque, debido a la precocidad y
rapidez del desarrollo de éstas, el fenotipo no cambiará tras el nacimiento. Las huellas dactilares
se pueden detectar a partir de la 6ª semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo
hacia la semana 12-13. Posteriormente regresarán hasta adquirir la morfología final que ya no se
verá alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.
18
ARCOS
LAZOS
ESPIRALES
Clasificación de las huellas
Los patrones de los dibujos de las huellas se pueden clasificas en tres grupos
principalmente: arcos, lazos y espirales. El arco es el patrón más simple y menos frecuente. En
las huellas donde aparecen lazos, las líneas aparecen en tres direcciones, encontrándose en un
punto intermedio (el trirradio) con ángulos de unos 120 grados. En el centro del punto de
encuentro se forma un triángulo. Los lazos pueden denominarse radiales o cubitales,
dependiendo de hacia dónde estén inclinados; por ejemplo, un dedo meñique presentará un lazo
radial si su trirradio se abre hacia el pulgar de su misma mano. Un lazo cubital será aquel que del
pulgar se abra hacia el meñique de la misma mano. El patrón espiral presenta dos trirradios
(formándose dos triángulos). Las frecuencias de estros tres patrones en la población son de 5,0%
para el arco, 5,4% para el lazo radial, 63,5% para el lazo cubital, y 26,1% para el espiral.
Estudio de las huellas dactilares: recuento de las líneas
El objetivo de este estudio será el estudio del total de las líneas de la huella (en inglés:
total ridge count o TRC). Holt en 1968 determinó que para varones la media es de 145 y para
mujeres de 126.
Las líneas se han de contar desde el triradio al centro de la huella (ver la línea blanca de
las imágenes de las huellas de arriba), es decir, las huellas que presentan el patrón del arco tienen
un recuento de cero (no hay triradio). En los espirales el recuento ha de efectuarse desde cada
triradio al centro de la huella. Una vez contadas todas las líneas de todas las huella por persona se
sumarán para obtener el TRC. A continuación se examinará cómo el TRC apoya el modelo de
herencia poligénica.
Características de algunos síndromes comunes:
- Trisomía 21: dedos con lazos cubitales generalmente, lazos radiales en dedos 4 y 5.
- Trisomía 18: líneas poco desarrolladas, gran frecuencia de arcos (media de 7-8 con al menos
un arco). En los pulgares sin arcos, con lazos radiales, recuentos TRC bajos.
- Síndrome de Turner (45,X): alto recuento TRC sin aumento de espirales.
Relación entre la media de TRC y el número de cromosomas X e Y
45, X
46, XY
46, XX
47, XXY
165
145
126
114
47, XYY
48, XXYY
48, XYYY
49, XXXXX
103
88
83
17
19
Recogida de datos individuales
(pegar aquí la cinta adhesiva con las huellas en cada casilla)
pulgar derecho (I)
índice derecho (II)
corazón dcho (III)
anular derecho (VI)
meñique dcho(V)
pulgar izquierdo (I)
índice izquierdo (II)
corazón izdo (III)
anular izdo (IV)
meñique izdo (V)
mano derecha
patrón
obtenido:
recuento
parcial:
pulgar
índice
corazón
anular
meñique
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
recuento total = ____________
mano dcha _
mano izquierda
patrón
obtenido:
recuento
parcial:
pulgar
índice
corazón
anular
meñique
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
recuento total = ____________
_
mano izda
Recuento total dos manos:
TRC= ___________
20
Recogida de datos del grupo de prácticas
estudiante
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
sexo
V/M
TRC
% del total:
media del
TRC:
media TRC
mujeres:
media TRC
varones:
lazos*
espirales*
arcos*
______
______
______
________
________
________
(*) poner el número de dedos
21
Histograma de la distribución de frecuencias
10
nº alumnos
8
6
4
2
0
valores del TRC
Preguntas de la práctica:
1.- ¿Cuál es la media TRC para la clase? ¿Existen diferencias en las TRC medias
para los varones y mujeres?
2.- ¿Cuál puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta.
3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo.
4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma.
5.- De haber recogido datos de una población mucho mayor ¿crees que el gráfico
presentaría otro aspecto? Razona tu respuesta.
Respuestas:
22
PRACTICA 5
ESTUDIO DE POLIMORFISMOS
Análisis del grupo sanguíneo y de un VNTR
Objetivo y material
1.- Análisis de un polimorfismo fenotípico: determinación del grupo sanguíneo.
2.- Análisis de un polimorfismo silencioso de ADN tipo VNTR.
3.- Evaluar la utilidad de ambos para diversas aplicaciones médicas y legales.
En ambos casos, el material de partida será la sangre de los propios alumnos, y en su
caso, muestras de sangre de familiares de éstos, previamente recogidas.
Introducción
Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad genética de la especie. Se dice que
existe un polimorfismo en un determinado locus cuando hay más de un alelo presente en la
población con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo sólo puede presentar como
máximo dos alelos distintos para un locus, un estudio poblacional puede revelar la presencia de
múltiples alelos para ese locus, especialmente en ciertos loci que son altamente polimórficos.
Una pequeña proporción de los polimorfismos en el ADN dará lugar a diferencias a nivel
de los aminoácidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de proteínas. Pero la
mayoría de los polimorfismos en las secuencias de ADN ocurren en ADN no codificante, y no
tienen por tanto efecto fenotípico (se denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de
polimorfismos sean silenciosos es, por una parte, que la gran mayoría del genoma humano
consiste en ADN no codificante; y por otra, que este ADN está sometido a menores presiones
selectivas.
El análisis de polimorfismos en el ADN se aplica a estudios poblacionales y al estudio de
la evolución del genoma humano. Otra aplicación que ha cobrado gran importancia consiste en
detectar polimorfismos asociados a ciertas patologías, lo que permite en muchos casos localizar
el gen responsable, y permite también a veces realizar el diagnóstico de la enfermedad. Por
último, el estudio de polimorfismos tiene un creciente interés en el ámbito de la Medicina Legal;
el análisis genético de la diversidad humana permite resolver ciertos problemas judiciales,
utilizando la "huella del ADN" a modo de huellas dactilares. El análisis conjunto de varios
polimorfismos (tanto fenotípicos como silenciosos) permite identificar individuos con unos
márgenes de error despreciables. Por otra parte, la ventaja sobre otros sistemas de identificación,
como las huellas dactilares, es que se trata de caracteres genéticos que se heredan de manera
mendeliana. Esto permite su uso en pruebas de paternidad.
En esta práctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos maneras muy
distintas. En primer lugar se estudiará el polimorfismo del locus AB0 que determina el grupo
sanguíneo. Puesto que es éste un polimorfismo fenotípico, y además la penetrancia es del 100%,
el análisis se hará directamente sobre el producto génico. En segundo lugar estudiaremos un
polimorfismo de ADN silencioso. Para ello amplificaremos por PCR una región de ADN
genómico que incluye un VNTR. Finalmente analizaremos los datos obtenidos por todo el grupo.
23
Práctica 5a -Análisis de un polimorfismo fenotípico: el grupo sanguíneo AB0.
Objetivo y material
El objetivo de esta primera parte de la práctica es analizar un polimorfismo evidente
fenotípicamente, como es el de los grupos sanguíneos. Se pretende dar a conocer la base genética
de los grupos sanguíneos más importantes. Se determinarán los grupos sanguíneos de cada
alumno mediante la extracción de unas gotas de sangre por punción del cuarto dedo de una mano
con una lanceta estéril. La determinación del grupo sanguíneo se realizará mediante reacciones
de aglutinación con anticuerpos específicos. Estos datos se analizarán respecto a los fenotipos
parentales y se emplearán en estudios posteriores.
Introducción
La sangre de cada persona es tan característica que puede servir como medio de
identificación casi tan preciso como las huellas dactilares. Sólo los gemelos idénticos poseen
características sanguíneas iguales. Por otra parte, la herencia de los caracteres sanguíneos está tan
bien definida que puede seguirse con facilidad. Además, la expresión de estos caracteres, en
general, no está influída por el ambiente; por lo que puede decirse que su penetrancia es del
100%. Por todo ello, la fenotipación de individuos en base a la determinación de los grupos
sanguíneos es particularmente conveniente en los estudios genéticos en poblaciones humanas.
También existen importantes implicaciones en medicina, como: la práctica de las transfusiones
sanguíneas, la relativamente frecuente aparición de enfermedades hemolíticas en fetos y recién
nacidos, las aplicaciones médico-legales y su conexión con otros genes cuya repercusión más
inmediata puede estar en los transplantes de órganos.
Sistema AB0
El primer sistema descubierto, en 1900, fue el AB0, por ser la principal causa de la
incompatibilidad entre las sangres de distintos individuos en las transfusiones de sangre. Dicha
incompatibilidad se basa en una reacción de carácter inmunológico altamente específica,
consistente en la unión química de antígenos extraños contenidos en los eritrocitos del donante y
las aglutininas o anticuerpos específicos presentes en el plasma sanguíneo del receptor.
El grupo sanguíneo AB0 lo determina un locus situado en el extremo del brazo largo del
cromosoma 9. Constituye un caso de alelismo múltiple basado en la existencia de tres alelos:
IA que da lugar a la producción de antígenos A.
IB que da lugar a la producción de antígenos B.
i que determina no producción de antígenos.
A
Los alelos I e IB son codominantes, y el alelo i es recesivo frente a ambos. Estas
características determinan la existencia de cuatro fenotipos. El sistema AB0 puede resumirse en
el siguiente cuadro:
Fenotipos Genotipos Antígenos en los eritrocitos Anticuerpos en
suero
A
IAIA ó IAi
A
anti-B
B
IBIB ó IBi
B
anti-A
0
ii
AB
IAIB
ninguno
AyB
anti-A y anti-B
ninguno
24
Las personas que poseen en sus eritrocitos un tipo de antígeno carecen del anticuerpo
respectivo, pero este último está presente en el suero de las personas que carecen de dicho
antígeno. Por lo tanto, en una transfusión se producirá reacción de aglutinación antígenoanticuerpo o no según los casos, tal como se indica en el siguiente cuadro:
Origen del suero (receptor)
A
B
AB
0
A
-
+
-
+
B
+
-
-
+
AB
+
+
-
+
0
-
-
-
-
Origen de los eritrocitos (donante)
Sistema MN
En 1927 se descubrió el sistema MN, mediante experimentos con conejos. Los grupos
MN dependen de un par de alelos codominantes M y N, responsables de tres genotipos: MM,
MN y NN y sus respectivos fenotipos M, MN y N. Este sistema es de escasa importancia en la
transfusión sanguínea o en la incompatibilidad materno fetal. Su significación principal en la
genética médica deriva del hecho de que sus frecuencias relativas y su herencia codominante los
hacen especialmente útiles para resolver problemas de identificación, paternidad etc.
Sistema Rhesus
Un tercer sistema de antígenos de superficie de los eritrocitos es el sistema Rhesus
descubierto por Landsteiner, Wienes y Levine en 1940. En un primer análisis y para simplificar
se consideran dos grupos en este sistema:
- Rh+, individuos que poseen antígenos Rh.
- Rh-, indviduos que no poseen antígenos Rh.
Los anticuerpos anti-Rh no son anticuerpos ¨naturales¨, no existen normalmente en la
sangre, pero aparecen en individuos Rh- que han recibido antígenos Rh como consecuencia de
una transfusión de un donante Rh+ o después de un embarazo. La madre Rh- se sensibiliza por
los eritrocitos Rh+ del primer hijo, produciendo anticuerpos anti-Rh. El segundo embarazo de un
niño Rh+ produce un aumento masivo de anticuerpos, que pasan a través de la placenta y
aglutinan los glóbulos rojos del niño.
Este sistema reveló la explicación de una enfermedad hemolítica que se produce en el
recién nacido, la eritroblastosis fetal, además de las reacciones de aglutinación que ocurrían en
transfusiones de sangre entre personas del mismo tipo respecto al sistema AB0.
Las bases genéticas del sistema Rh son complejas, al estar constituido por un gran
número de antígenos eritrocitarios distintos. Este sistema está codificado por tres loci muy
próximos entre sí (C, D, E y sus recesivos respectivos c, d, y e) en el brazo corto del cromosoma
1. Cada uno de los alelos produce un antígeno y los anticuerpos correspondientes aparecen para
todos menos para el d.
25
El alelo D, es de un interés primordial al ser el responsable de la codificación del
antígeno D que es muy antigénico y provoca la sensibilización. Es por esto que para fines
prácticos las personas se consideran Rh+ si poseen el antígeno D y Rh- si carecen del antígeno D
según la siguiente tabla:
Genotipo
Antígeno
Rh
DD
D
+
Dd
D
+
dd
-
-
Posteriormente se han descrito otros grupos sanguíneos tales como los sistemas Kell,
Diego, Kidd, P de herencia autosómica y el Xg ligado al cromosoma X. Estos sistemas no son de
gran importancia en las reacciones de aglutinación postransfusión pero pueden ser utilizados
como marcadores genéticos útiles para la exclusión de posible paternidad, determinación del
grado de histocompatibilidad etc.
Protocolo
Sistema AB0
La determinación de grupos del sistema AB0 se efectúa enfrentando los hematíes
problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti A,B (grupo 0). La
aglutinación o no aglutinación de los hematíes ensayados frente a cada uno de los antisueros es
indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos en los mismos.
1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB.
2.- Con una lanceta estéril realizar una punción en el cuarto dedo de una mano.
3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequeña de la sangre a ensayar.
4.- Añadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado.
5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo.
6.- Mover la placa lentamente por rotación a temperatura ambiente. Examinar
macroscópicamente la aparición de aglutinación a los 2 minutos.
Sistema Rh (anti-D)
La presencia del antígeno D se determina enfrentando los hematíes problema, en un
medio proteico alto, con suero anti-D. La aglutinación o no aglutinación de los hematíes
ensayados es indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente antígeno en los mismos.
1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado.
2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST.
3.- Añadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamaño aproximado a la gota de suero en él
depositada.
4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una extensión de
unos 2 cm cuadrados.
5.- Colocar los portas sobre la lámpara visualizadora precalentada (45º).
6.- Mover la lámpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos, observando
macroscópicamente la aparición de cualquier signo de aglutinación .
26
Lectura
Reacción negativa: ausencia de aglutinación al cabo de los 2 minutos.
Reacción positiva: aglutinación visible a los dos minutos y ausencia de aglutinación con el
autocontrol. La reacción positiva indicará cuál es el antígeno presente en los eritrocitos (por ej. si
sale aglutinación en la casilla “A” el grupo sanguíneo será A).
Si los hematíes presentasen aglutinación en el Autocontrol, dar el resultado como no válido.
Preguntas:
1.- Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo ó genotipos posibles.
2.- ¿Por qué se tiene en cuenta el grupo sanguíneo de las series AB0 y Rh en las
transfusiones y no la serie MN?
3.- ¿Por qué el antígeno D define básicamente al grupo Rh?
4.- ¿Por qué el análisis de los grupos sanguíneos sólo sirve en algunos casos
para excluír la paternidad y no para asignarla?
5.- ¿En qué casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer
embarazo asumiendo incompatibilidad Rh?
Respuestas:
27
Práctica 5b - Análisis de un polimorfismo de ADN silencioso tipo VNTR.
Objetivo y material
En esta segunda parte de la práctica analizaremos las variaciones existentes entre los
individuos a nivel de un locus genómico no codificante, es decir, un polimorfismo silencioso.
Partiendo de sangre de los propios alumnos (y de muestras recogidas previamente de parientes de
éstos, en su caso), amplificaremos por PCR la región de ADN a estudiar y compararemos los
resultados de cada individuo. De este modo se espera observar la utilidad de este tipo de
polimorfismos tanto para la identificación de individuos como para estudiar su transmisión, bien
con fines médicos o legales.
Introducción
El análisis de polimorfismos en el ADN se ha convertido en una técnica de enorme
utilidad en Medicina, por lo que el número de polimorfismos silenciosos que se conocen en el
genoma humano no deja de crecer. Los polimorfismos se determinan en base a su detección
mediante técnicas de biología molecular, bien porque las variaciones en la secuencia de ADN
crean o destruyen dianas para enzimas de restricción (los llamados RFLPs), o porque implican un
cambio en la longitud de ADN (inserciones o deleciones).
De especial interés en nuestro caso es el ADN repetitivo en tándem, como el ADN
minisatélite y microsatélite, consistente en un número variable de copias en tándem de una corta
secuencia de ADN (VNTR, "variable number of tandem repeats"). Los individuos nos
diferenciamos por el número de repeticiones que presentamos en cada locus, número además que
transmitiremos a la descendencia de manera mendeliana.
El polimorfismo que analizaremos en esta práctica es el que se localiza en el locus
D1S80, en el extremo distal del cromosoma 1p. Este locus contiene un VNTR. La secuencia que
se repite en tándem tiene una longitud de 16 bp, y el número de repeticiones en cada alelo varía
entre 14 y 41. La región VNTR está flanqueada por secuencias de ADN muy conservadas, lo que
permite utilizar unos cebadores complementarios a dichas secuencias para realizar una reacción
de PCR que nos amplifique dicha región. El tamaño de la región amplificada dependerá del
número de repeticiones, de modo que cada alelo podrá distinguirse por su tamaño. Esto se
observará sometiendo el producto amplificado por PCR a una electroforesis en gel de agarosa y
tiñendo el ADN con bromuro de etidio.
Se han encontrado hasta la fecha 29 alelos distintos en este locus, lo que permite un poder
de discriminación de entre 0.95 y 0.98. Se trata pues de un polimorfismo que se incluye
habitualmente en los análisis con fines forenses. Sin embargo, para distinguir todos los alelos
(que se pueden diferenciar unos de otros en tan solo 16 bp de longitud) se requieren técnicas
sofisticadas de electroforesis. En la presente práctica realizaremos una electroforesis de menor
resolución, lo que no nos permitirá distinguir todos los alelos con exactitud, pero sí observar la
aparición de los dos alelos de cada individuo y la diversidad existente en la población.
El análisis se realizará sobre el ADN de los propios alumnos. El ADN será obtenido de
una mínima cantidad de sangre, para mostrar cómo pueden obtenerse muestras analizables a
partir de restos como una mancha de sangre en la escena de un crimen. A partir de esa muestra,
se seguirá un sencillo protocolo que básicamente rompe las células y utiliza una resina que
elimina todo lo que pudiera interferir con la amplificación posterior del ADN, que permanece en
el sobrenadante. A continuación, ese sobrenadante con el ADN se añade a una mezcla de
reacción con los elementos necesarios para amplificar por PCR la región genómica que queremos
estudiar. Esto pondrá de manifiesto la enorme fuerza de la técnica, que permite obtener
cantidades de ADN visibles en una electroforesis partiendo de pocos nanogramos de ADN total.
Al final de la práctica se analizarán los resultados conjuntos y se discutirán sus
aplicaciones.
28
Protocolo
Puesto que la técnica de PCR es muy sensible a la contaminación con cualquier otro
ADN, durante todo el proceso tendremos especial cuidado en tocar todo con pinzas o guantes y
no poner en contacto muestras distintas.
Día 1
a) obtención del ADN genómico total
1. - Utilizando un punzón estéril, pinchar el dedo anular hasta que sangre. Con una pipeta,
recoger cuidadosamente la sangre; con 5 l es suficiente, si sale más, mejor. Pasarla a un tubo
eppendorf.
2. - Añadir 1 ml de agua destilada. Mezclar bien, invirtiendo el tubo varias veces.
3. – Centrifugar 1 minuto en la microcentrífuga. Recoger el sobrenadante con una pipeta y
desechar. ATENCION: el precipitado apenas será visible. Hay que recoger con una pipeta de 1
ml aproximadamente 960 l del sobrenadante, sin tocar ni remover el fondo del tubo.
4. – Añadir 100 l de resina “InstaGene”. La resina estará en agitación constante y
cogeremos el volumen indicado utilizando una punta de boca ancha (azul). Mezclar.
5. – Incubar a 56ºC 15 minutos.
6. – Agitar el tubo en vortex a máxima potencia durante 10 segundos.
7. – Incubar en baño hirviendo durante 8 minutos.
8. - Repetir la agitación en vortex otros 10 segundos.
9. – Centrifugar 2 minutos.
10.- Recoger 20 l del sobrenandate con cuidado de no coger la resina, que queda al
fondo del tubo. Los pasaremos a otro tubo eppendorf de 0.2 ml en hielo que contiene 30 l de la
mezcla de PCR.
b) amplificación de la región de ADN que contiene el polimorfismo
1. - Tendremos en un tubo en hielo: 20 l del sobrenadante con el ADN, y 30 l de
mezcla de PCR. La mezcla de PCR contiene todo lo necesario para la amplificación de la región
concreta del genoma que queremos estudiar, excepto el enzima:
- cebadores específicos que se unirán a ambos lados de la región VNTR.
- tampón, magnesio y sal adecuados para que funcione la polimerasa.
- deoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), precursores del ADN de nueva síntesis.
2. - Añadir al tubo 0,5 l de la termopolimerasa, el enzima que llevará a cabo la síntesis
del ADN a partir de los cebadores y tomando como molde el ADN del alumno.
3. - Meter la muestra en el termociclador debidamente programado para realizar 29 ciclos
de desnaturalización del ADN (95ºC), renaturalización para que se unan los cebadores (65ºC), y
polimerización del nuevo ADN (72ºC).
Día 2
1. - Recoger los tubos con las muestras amplificadas.
2. - Preparar un gel de agarosa al 1.5% en tampón TBE con bromuro de etidio. NOTA: el
bromuro de etidio es un potente mutágeno. Manipular en todo momento con guantes.
3. - cargar en el gel 15-25 l de la muestra con 3-5 l de tampón de carga. Incluír en otros
pocillos del mismo gel los controles de tamaño adecuados.
4. - Realizar la electroforesis a 120V durante 90 minutos.
5. - Llevar el gel al transiluminador y obtener la imagen de los fragmentos de ADN.
6. - Analizar los datos obtenidos por todo el grupo.
29
Preguntas:
1. Analiza la imagen obtenida tras la electroforesis. ¿Qué refleja el distinto
tamaño de las bandas de ADN que se observan en cada muestra?
2. ¿Por qué se ven dos bandas? Si hay alguna muestra donde sólo se vea
una, explícalo.
3. En base a las diferencias observadas, comentar la utilidad de este
polimorfismo para la identificación de individuos, y sus aplicaciones médicas y
legales.
Respuestas:
30
PRACTICA 6
GENÉTICA DE POBLACIONES
Aplicación de la ley de Hardy-Weinberg en la genética de los
grupos sanguíneos (alelos múltiples)
Objetivo y material
1.- Calcular las frecuencias de los fenotipos de grupos sanguíneos obtenidos en la
práctica.
2.- Calcular las frecuencias alélicas y genotípicas basándose en la ley de Hardy-Weinberg.
3.- Determinar si la población está o no en equilibrio, y por qué.
El material utilizado serán los resultados obtenidos en la práctica 5(a).
Introducción
G.H. Hardy y W. Weinberg definieron los principios básicos de la herencia poligénica y
demostraron que en poblaciones en equilibrio las frecuencias (p y q) de los diferentes alelos de
un gen (A y a respectivamente) permanecen constantes generación tras generación, siempre y
cuando no se produzcan fenómenos de mutación, selección, deriva genética, migración o deriva
meiótica. En el caso de dos alelos (A y a) si p es igual a la frecuencia del alelo A, y q la
frecuencia del alelo a; entonces:
p+q=1
(o lo que es lo mismo en porcentajes: el % p + el % q = 100%)
En poblaciones donde la fecundación ocurre de forma aleatoria, las frecuencias para los
distintos genotipos serán:
(óvulo) p (A)
(óvulo) q (a)
(espermatozoide)
p (A)
p2 (AA)
qp (aA)
(espermatozoide)
q (a)
pq (Aa)
q2 (aa)
Es decir, que la distribución de los genotipos de la generación será:
p2 + q2 + 2pq = 1
Esta fórmula también se puede usar para calcular las frecuencias de los alelos A o a en la
población. En el caso de los grupos sanguíneos AB0 existen 3 alelos del locus de la isoaglutinina
(I). En este sistema A y B son codominantes, y ambos son dominantes respectos a 0. Este sistema
tiene seis combinaciones genotípicas posibles: AA, A0, BB, B0, AB, 00.
31
Los individuos homocigóticos AA y heterocigóticos A0 son fenotípicamente iguales, lo
mismo que los individuos BB y B0. Esto dará lugar a 4 combinaciones fenotípicas conocidas
como A, B, AB y 0. La Ley de Hardy-Weinberg también se puede emplear en este caso para los
tres alelos:
p (A) + q (B) + r (0) = 1
y las combinaciones genotípicas pueden calcularse por la siguiente ecuación:
p2 (AA) + q2 (BB) + 2pq (AB) + 2qr (B0) + 2pr (A0) + r2 (00) = 1
La ley de Hardy-Weinberg se cumplirá sólo en poblaciones que se encuentren en
equilibrio. Uno de los requisitos para que esto ocurra es que el tamaño de la población sea
suficientemente grande. Nosotros vamos a considerar al grupo de prácticas como una población,
y partiendo de los datos fenotípicos que hemos recogido para el grupo sanguíneo AB0,
calcularemos las frecuencias alélicas suponiendo equilibrio Hardy-Weinberg. Sin embargo, lo
más probable es que el grupo de prácticas no represente una población en equilibrio, dado su
limitado tamaño. Tras calcular las frecuencias alélicas, estimaremos las frecuencias genotípicas y
fenotípicas esperadas y cotejaremos esos datos con los obtenidos. Si no concuerdan, se puede
deducir que la población “grupo de prácticas” no está en equilibrio Hardy-Weinberg. Se
comparará esta situación con otros datos provenientes de poblaciones de mayor tamaño que sí
estén en equilibrio.
Recogida de datos del grupo de prácticas (fenotipos sanguíneos)
fenotipo
sanguíneo
antígenos
Anticuerpos
presentes en presentados
eritrocitos
en la sangre
genotipos
posibles
nº de
% del total del
estudiantes del grupo prácticas
tipo
frecuencia fenotípica
que representa
A
B
AB
O
32
Preguntas de la práctica:
1.- Calcular las frecuencias de los alelos A (p), B (q) y 0 (r) empleando la
Ley de Hardy-Weinberg.
2.- Calcular las frecuencias genotípicas y fenotípicas esperadas, y
compararlas con los datos obtenidos.
3.- Discutir si la población está o no en equilibrio H-W, y por qué.
Respuestas:
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