S3-BYQ05

ACTIVACIÒN DEL FACTOR NUCLEAR k-B EN LAS ETAPAS INICIALES
DE LA HEPATOCARCINOGÉNESIS
R. García-Román, J.I. Pérez-Carreón, A. Márquez Quiñones, M. Salcido-Neyoy y S.
Villa Treviño
Departamento de Biología celular, Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados
del IPN (Cinvestav), Av. IPN No. 2508. Col. San Pedro Zacatenco, C.P. 07360,
México, DF. bky@cell.cinvestav.mx
RESUMEN
El Factor Nuclear-kB es un factor transcripcional inducible en la regulación de la expresión de
varios genes involucrados en procesos carcinogénicos. El uso de carcinógenos en modelos de
hepatocarcinogénesis, estimula la translocación de NF-kB al núcleo. Este proyecto muestra la formación
de lesiones preneoplasicas inducida por los carcinógenos DEN, 2-AAF y la Hepatectomía Parcial en el
modelo de Hepatocarcinogénesis en rata, así como la activación de NF-kB, y su disminución por
antioxidantes. Se observó una disminución del número de lesiones preneoplasicas en el grupo tratado con
S-adenosyl-L-metionina, así como menor grado de daño hepático causado por los carcinógenos. También
se observó un pico de mayor actividad de NF-kB a los 30 min post-HP y 24 hr después de la dosis con 2AAF. La estimulación con los carcinógenos mostró una degradación sostenida de los inhibidores de NFkB; IkB- e IkB-, coincidente con la persistente activación de NF-kB hasta los 25 días posteriores al
tratamiento con DEN. La sola Hepatectomía Parcial, induce rápida y transitoriamente la actividad de NFkB, con un pico máximo a los 30 min post-HP. Sin embargo sólo se observó la degradación de IkB- y
no hubo efecto alguno con IkB-, esto sugiere que el mecanismo de activación de NF-kB mediada por los
carcinógenos, modula la degradación de ambos IkB’s. IkB- ha sido asociado con una repuesta
persistende de NF-kB, ya que tiene una cinética de fosforilación más lenta que IkB-; infiriendo que la
degradación prolongada de IkB- por efecto de los carcinógenos, podría ser el principal mediador de la
persistente activación de NF-kB, en el modelo de Hepatocarcinogénesis.
1. INTRODUCCIÓN
El factor nuclear kappa-B (NF-kB) es un factor transcripcional que participa en la oncogénesis por medio
de sus proteínas reguladoras de la proliferación celular. Actualmente se conoce que la desregulación de
NF-B se ha encontrado en tumores de tipo hematopoiéticos y sólidos. NF-kB es un elemento
transcripcional que se activa por una gran variedad de estímulos, incluyendo estrés oxidativo el cual
origina su translocación hacia el núcleo. NF-B existe en forma inactiva en el citoplasma como un
dímero unido a una proteína inhibidora kB (IB) de las que se conocen las isoformas IkB-, IkB-, IkB, IkB-, (p105), (p100), y Bcl-3. Actualmente existen muchas evidencias que involucran directamente al
estrés oxidativo con patologías crónico-degenerativas y de inflamación, como artritis reumatoide,
hipertensión arterial, Alzheimer y carcinogénesis [1]. En años recientes, se ha vuelto evidente que
pequeños cambios en el ambiente redox, podrían alterar vías de señalización en procesos de proliferación
y sobrevivencia, actuando como moduladores de éstas funciones celulares. Uno de los principales medios
para disminuir o inhibir la activación de los factores de transcripción sensibles al ambiente redox, ha sido
a través del uso agentes antioxidantes. El antioxidante S-adenosil-L-metionina (SAM) ha demostrado
tener efectos protectores en enfermedades degenerativas y procesos de inflamación como artritis,
Alzheimer y carcinogénesis. Se comprobó que SAM inhibe la promoción de nódulos persistentes en un
modelo de hepatocarcinogénesis en rata Wistar, mediante la sensibilización a la apoptosis de células pre-
malignas y la disminución de la síntesis de DNA [2]. Por tal motivo, la participación de especies reactivas
(ROS/RNS) y de los agentes antioxidantes adquiere gran importancia en el tratamiento de enfermedades
relacionadas a la inflamación y la carcinogénesis. Sin lugar a dudas el conocimiento de los mecanismos
de acción de los antioxidantes sobre factores de transcripción que inducen la promoción de tumores,
como NF-kB, es de vital importancia para el desarrollo de agentes específicos dirigidos contra
mediadores de la señalización redox durante la transformación maligna. En resumen, aquí mostramos la
disminución de las lesiones preneoplasicas causadas por el efecto del tratamiento carcinogénico mediante
el uso de el antioxidante SAM, así como el perfil de activación de NF-kB en las etapas iniciales de la
hepatocarcinogénesis.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Tratamientos y grupos de animales. Para desarrollar este proyecto, grupos de ratas Fisher 344 fueron
sometidas al modelo del hepatocito resistente modificado [3] y adicionalmente se les administró el
antioxidante SAM. Además de un grupo de sólo regeneración hepática. Se utilizó un grupo de ratas sin
ningún tratamiento como control negativo como se muestra en el siguiente esquema:
Fig. 1 Representación esquemática
del tratamiento carcinogénico y de la
administración de SAM. DEN (200
mg/kg), 2-AAF (20 mg/kg) y SAM
(64 mol/kg). PH= Hepatectomía
parcial. S= tiempo de sacrificio. n=3
por tiempo de sacrificio.
Tinción de H&E. Cortes histológicos de 4 m de espesor de secciones de hígado embebidos en parafina
fueron deshidratados con etanol, para ser teñidos mediante la técnica de hematoxilina/eosina. Finalmente
se analizaron en un microscopio invertido de luz visible.
Histoquímica de GGT (análisis de lesiones preneoplasicas). Se utilizó como sustrato la g-glutamil-1,4metoxi-2-naftilamida (GMNA). Los cortes histológicos fueron fijados con etanol absoluto, y se incubaron
durante 20 minutos con una solución de GMNA 125 g/ml, 0.5 mg/ml de glicil-glicina y 0.5 mg/ml de
azul rápido en 100 mM de Tris base. Finalmente, los precipitados serán fijados con una solución de
sulfato cúprico 100 mM.
Inmunohistoquímica de GST-p. Secciones de cortes de hígados de 4 m de espesor embebidos en
parafina fueron desparafinados y rehidratados. Los tejidos se incubaron con el anticuerpo primario antiGST-p. Posteriormente se lavaron y se incubaran con el anticuerpo secundario biotinilado, seguido por el
complejo estreptavidina HRP. Los tejidos fueron revelados con el kit DAB-plus substrate y contrateñidos ligeramente con hematoxilina. Finalmente las lesiones preneoplasicas fueron cuantificadas en un
software analizador de imágenes.
Western-blotting. Para detectar la proteína nuclear Rel A/p65, así como sus inhibidores IkB- y , se
utilizaran fracciones nucleares y citosólicas.10 g de proteína de cada muestra fueron separadas en geles
de poliacrilamida por electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS/PAGE), en geles
de poliacrilamida al 10%. Las proteínas separadas fueron transferidas a membranas de PVDF e incubadas
con los respectivos anticuerpos anti-p65, anti-IkB- y anti-IkB-. Se detectaron las bandas mediante una
reacción de quimioluminiscencia con luminol y se revelaron en placas fotográficas. Las membranas se
normalizaron con la proteína nuclear lámina B y la citosólica acina-
3. RESULTADOS
SAM Disminuye el daño tisular provocado por el tratamiento carcinogénico. El análisis de las
tinciones con hematoxilina eosina revela que el tratamiento carcinogénico (TC) provoca patologías
similares a la hepatitis temprana tipo C y a la cirrosis aguda, observadas a los 30 minutos posteriores a la
hepatectomía parcial.
Fig. 2.
Efecto de SAM en la
disminución
del
daño
tisular
provocado por el TC. Tinciones de
H&E. CN. Control sin tratamiento, TC.
Tratamiento completo 30 minutos
después de PH, TC + SAM 30.
Tratamiento completo, más 1 dosis
intraperitoneal diaria de 64mmol/kg de
SAM. 1.Degeneracion balonoide, 2.
Inflamación periportal y generalizada,
3. Infiltrado inflamatorio severo. 4.
Reacción del ducto biliar.
En la Fig. 2 se observa una clara degeneración balonoide en la mayoría de las células del parénquima
hepático, y una severa reacción inflamatoria sistémica caracterizada por la presencia de linfocitos y
macrófagos. No hay evidencias de tejido necrótico, sin embargo existen regiones con hiperplasia focal
nodular, de alrededor de 30 o más células hepáticas. Conjuntamente se observa reacción del ducto biliar
caracterizada por la proliferación de células biliares que invaden el parénquima hepático. En esta etapa se
encuentran presentes todos los elementos del hígado normal pero en una concentración y distribución
anormal. El tratamiento con SAM, significativamente disminuyo el infiltrado inflamatorio generalizado,
sin embargo aún se observan linfocitos y macrófagos en la región periportal. No hay evidencia de
hiperplasia focal nodular, ni reacción del ducto biliar, aunque se pueden observar células con
degeneración balonoide. Explícitamente se puede asegurar que las lesiones tisulares producidas por el
tratamiento carcinogénico, son debidas al estrés oxidativo causado por los carcinógenos más la
hepatectomía parcial, y que el uso de antioxidantes como SAM ayuda a disminuir las lesiones hepáticas
tempranas.
SAM Disminuye la expresión de los marcadores tumorales GGT y GST-p producida por el
tratamiento carcinogénico. En un hígado normal la GGT se encuentra expresada en las células que
conforman los canalículos biliares [4]. En la Fig. 3, en el grupo CN se observa que la GGT solo es
positiva alrededor de los canalículos biliares y que los hepatocitos sin tratamiento son negativos a la
tinción. El tratamiento carcinogénico induce la expresión de nódulos pre-neoplásicos GGT+ a los 25 días
post-DEN. El efecto que se observó con la administración de SAM en ratas sometidas al TC, fue la
reducción de la cantidad de nódulos en un 41.4 %, y en área GGT + en un 73 %.
Fig. 3. Efecto de SAM en la expresión
de GGT provocada por el TC.
Histoquímicas de GGT en cortes de 5m
de espesor. CN. Control sin tratamiento,
TC. Tratamiento completo 25 d después
de DEN, TC + SAM 25. Tratamiento
completo
más
1
dosis
diaria
intraperitoneal de 64mmol/kg de SAM.
La enzima GST-p es altamente expresada en nódulos o focos precancerosos así como en carcinomas
hepatocelulares inducidos por carcinógenos.
Fig. 4. Efecto de SAM en la expresión de GST-p
provocada por el TC. Inmunohistoquímicas de
GST-p. CN. Control sin tratamiento, TC.
Tratamiento completo 25 d después de DEN, y 30
min post-PH. TC + SAM. Tratamiento completo
más 1 dosis diaria intraperitoneal de 64mmol/kg de
SAM, 25 días post-DEN y 30 min post-PH.
GST-p no esta presente en el hígado fetal y no incrementa en el hígado regenerante, por tal motivo su
expresión es sólo atribuida a procesos de transformación maligna [5]. En la Fig. 4 claramente se observa
en el hígado normal (CN) que no existe expresión de GST-p en hepatocitos ni en células hepáticas no
parenquimales.
Sin embargo en el grupo de TC, se observa la expresión de GST-p en los hepatocitos a los 30 min postPH y en nódulos pre-neoplásicos a los 25 días después del tratamiento con DEN y. La administración del
antioxidante SAM fue capaz de disminuir la expresión de GST-p en un 87.5 % en los hepatocitos a los 30
min post-PH, impidiendo la formación de nódulos GST-p positivos.
Los carcinógenos inducen la translocación persistente del Factor Nuclear k-B en la etapa inicial de
la hepatocarcinogénesis. NF-kB es un factor transcripcional que cuando esta activado se transloca hacia
el núcleo para modular la transcripción de genes necesarios para la respuesta proliferativa e inmune. El
TC indujo el incremento de Rel A/p65 en el núcleo desde los primeros 7 días posteriores al tratamiento
con DEN (Fig. 5), hasta los 15 días posteriores a la PH, con un pico de mayor nivel a los 30 min post-PH.
Fig. 5. Niveles nucleares de Rel A/p65
durante las etapas iniciales de la
hepatocarcinogenesis.
Panel
Western-blotting
representativo
experimentos
independientes
duplicado.
Panel
inferior.
superior:
de
3
por
Análisis
densitométrico de bandas de 65 kD, las
cuales fueron normalizadas con antilámina B. a) P value =0.05 vs CN, aa) P
value <0.05 vs CN.
Degradación diferencial de los inhibidores de NF-kB en la hepatocarcinogénesis en comparación a
la regeneración hepática. Una de las maneras de monitorear la activación de NF-kB es mediante la
degradación de sus inhibidores los IkB`s. La regeneración hepática es un proceso que permite al hígado
recobrar su tamaño normal después de que ha sido sometido a una hepatectomía parcial. En este proceso
se activan una gran cantidad de factores, entre ellos NF-kB. Con la finalidad de conocer las diferencias de
la activación de NF-kB durante le hepatocarcinogénesis con respecto a la regeneración hepática,
realizamos un análisis de la degradación de los inhibidores IkB- e IkB-, mediante ensayos de Westernblotting. En la Fig. 6 se observa que la degradación de IkB- se presenta tanto en las etapas iniciales de la
hepatocarcinogénesis como durante la regeneración hepática, con un nivel de mayor degradación a los 30
min post-PH coincidente con datos publicados anteriormente [6], sin embargo la degradación del
inhibidor IkB- exclusivamente se observó durante las etapas iniciales de la hepatocarcinogénesis y no
durante la regeneración hepática. La cinética de degradación de IkB- es más lenta que la de IkB-, ya
que el nivel más alto de degradación se observó hasta 1 hr post-PH, coincidente con datos publicados con
anterioridad [7]
Fig. 6. Degradación de los IkB’s en
las
etapas
iniciales
de
la
hepatocarcinogénesis con respecto a
la regeneración hepática. Panel
izquierdo. Western-blot representativo
de 3 experimentos independientes por
duplicado del nivel de degradación de
IkB- y su análisis estadístico. Panel
derecho. Western-blot representativo
de 3 experimentos independientes por
duplicado del nivel de degradación de
IkB- y su análisis estadístico. a) P
value =0.05 vs CN, aa) P value <0.05
vs CN, b,c,d) P value =0.05, dd,ee) P
value >0.05. n=3.
4. CONCLUSIÓN
En este trabajo se analizó la capacidad de la S-adenosyl-L-metionina para disminuir las lesiones
preneoplasicas generadas por el tratamiento carcinogénico, a través de los marcadores enzimáticos GGT y
GST-p. Se encontró una disminución significativa de ambos marcadores en el grupo tratado con el
antioxidante en comparación con el grupo de hepatocarcinogénesis. Este resultado nos indica que las
especies reactivas de oxígeno juegan un papel importante en el desarrollo de la carcinogénesis yq eu
probablemente este ambiente oxidado desencadene vías de señalización importantes que participen en
procesos de proliferación como NF-kB, el cual se incrementa de manera persistente en las etapas iniciales
de la hepatocarcinogénesis. Así también encontramos que existe una degradación diferencial de los IkB’s
durante las etapas iniciales de la hepatocarcinogénesis con respecto a la regeneración hepática, la cual
sólo presenta la degradación de IkB-a. Esto nos sugiere que probablemente la activación persistente de
NF-kB sea debida a la degradación de ambos inhibidores, pero principalmente a la degradación de IkB-.
5. BIBLIOGRAFÍA
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