Identificación y caracterización funcional de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en Rhizobium leguminosarum bv. viciae II Reunión Microambiente “La Cristalera”, Miraflores de la Sierra Recuperación ambiental Laura Rubio-Sanz, Rosabel Prieto, Jose Manuel Palacios, Belén Brito. 1 Sistema de oxidación de hidrógeno en Rhizobiaceae Transportador de Ni para síntesis de la hidrogenasa Análisis homeostasis Ni en R.Leguminosarum UPM791 2 Objetivos Caracterización de la resistencia a altas concentraciones a níquel y cobalto en cepas de Rhizobium leguminosarum Identificación de sistemas génicos implicados en la resistencia a níquel en Rhizobium leguminosarum. Estudio del papel de estos mecanismos de resistencia a níquel en los estados simbióticos y rizosférico de Rhizobium leguminosarum. 3 Caracterización de la resistencia a altas concentraciones a níquel en cepas de Rhizobium leguminosarum aisladas de suelos ultramáficos y contaminados CEPA FENOTIPO Hup ORIGEN UPM1131 + Ultramáfico (Italia) UPM1132 + Ultramáfico (Italia) UPM1133 + Ultramáfico (Italia) UPM1134 + Ultramáfico (Italia) UPM1135 + Contaminado (Alemania) UPM1136 - Ultramáfico (Italia) UPM1137 - Ultramáfico (Italia) UPM1138 - Ultramáfico (Italia) UPM1139 - Ultramáfico (Italia) UPM1140 - Contaminado (Alemania) UPM1141 - Contaminado (Alemania) UPM1142 - Contaminado (Alemania) 4 Caracterización de los niveles de resistencia a Ni y Co Cepas UPM1137 UPM1136 Concentración Inhibitoria Mínima (mM) Diámetro de inhibición (mm)* NiCl2 CoCl2 NiCl2 CoCl2 UPM1131 1 0.5 20 20 UPM1132 2 0.75 18 26 UPM1133 2 0.75 16 18 UPM1134 2 0.75 18 16 UPM1135 1.5 0.5 16 22 UPM1136 1 0.25 26 26 UPM1137 2.5 1 11 13 UPM1138 1 0.25 22 26 UPM1139 2 0.75 14 24 UPM1140 1.5 0.5 17 18 UPM1141 1 0.75 22 20 UPM1142 1 1 22 15 3841 1.5 0.75 20 20 5 *NiCl2 200 mM; CoCl2 100 mM Mecanismos moleculares implicados en la resistencia a Ni Obtención de una colección de mutantes sensibles a Ni mediante mutagénesis aleatoria con mTn5 • 4313 transconjugantes • 16 mutantes sensibles NiCl2 TY TY + 1,5 mM NiCl2 6 Código mutante Ortologo en R.leg bv. viciae 3841 Proteina (aa) Función deducida (Nombre gen) UPM1137 - - 13 RL2862 403 Diámetro de inhibición (mm) Fenotipo Nod Fenotipo Fix % NT 13 + + 4.05 13 16 - - 1.41 proteina ribosoma 30s S1 (rpsA) 16 20 + - 1.60 258 Adenilato /guanilato ciclasa 16 16 + + 3.72 RL2322 213 Proteína hipotética 18 22 + + 4.10 2.2.50. RL1351 323 Sistema de salida de cationes (rcnA) 13 30 + + 4.13 3.4.66. RL4539 253 Proteína C exportadora grupo hemo (ccmC) 20 16 + - 2.14 3.5.61. RL2906 330 Dihidroxiacetona quinasa (dhaK) 17 16 + + 4.09 3.7.64. RL3560 252 Metionina aminopeptidasa (map) 14 16 + + 3.94 4.2.39. pRL90287 303 Proteína reguladora transcripcional familia AraC 15 16 + - 1.85 4.6.32. RL4188 230 Proteína secretada 22 21 + + 3.86 4.7.19. RL2793 363 Componente unión ATP. Transportador ABC 14 16 + + 4.45 4.7.37. RL4297 293 foldase/peptidil-prolil cistrans isomerasa 12 18 + + 3.88 5.2.17. RL0615 161 Arsenato reductasa 16 16 + + 3.97 5.4.51. RL1589 211 Proteína de membrana ropB 19 20 + + 4.45 6.4.26. pRL110071 276 Proteína hipotética conservada 16 24 + + 3.68 7.1.12. SMa0403 462 Proteína hipotética 16 16 + + 4.10 NiCl2 (200 mM) CoCl2 (100 mM) Cepa parental 11 318 Proteína hipotética conservada exportadora RL0106 567 2.2.42. RL2953 2.2.48. 7 Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum Sistema de salida de Ni y Co en E.coli. Cadena arriba rcnR que codifica un represor que controla la expresión de rcnA. R.leguminosarum 3841 R.leguminosarum UPM791 SPF25 Diheme cytochrome C Acetyl transferase Glutathion S-transferase rcnR rcnA Exported -lactamase Glucose dehydrogenase Generación de un mutante rcnRA en SPF25 8 Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum Niveles de resistencia a Ni y Co A 0,9 0,8 Concentración inhibitoria mínima (mM) Genotipo NiCl2 CoCl2 ZnCl2 CuSO4 SPF25 wt 1 0,75 2 2 ΔrcnRA rcn- 0,75 0,3 2 2 0,7 DO600 Cepa No metal added 1,0 0,6 SPF25 0,5 UPM1137 wt 2,5 1 ND ND 0,4 2250 rcn- 1,5 0,4 ND ND 0,3 rcnRA 0,2 0,1 0,0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Time (hours) B 500 M NiCl2 0,8 C 0,8 0,7 0,7 0,6 0,5 DO600 DO600 0,6 0,4 0,3 0,5 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 200 M CoCl2 0,9 0,0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Time (hours) 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Time (hours) 9 Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum Interacción con planta Nitrógeno total en planta Guisante Lenteja 0 Ni Co Control 0 Ni Co Control SPF25 4.15 3.83 3.93 1.14 2.66 2.51 2.54 1.17 rcnRA 3.98 3.93 3.83 1.14 2.66 2.66 2.59 1.17 Actividad hidrogenasa en bacteroides Bacteroides guisante 1400 Hydrogenase activity Hydrogenase activity 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 Bacteroides lenteja 1200 SPF25 1000 rcnRA 800 600 400 200 1000 0 0 No Metal NiCl2 CoCl2 No Metal NiCl2 CoCl2 10 Expresión génica del operón rcnRA en R. leguminosarum SPF25 / Δ15 Análisis de la expresión génica del operón rcnRA en R. leguminosarum SPF25. prcnRA lacZ prcnR prcnA Diheme cytochrome C Acetyl transferase rcnR rcnA Glutathion S-transferase rcnR::lacZ R Glucose dehydrogenase rcnA::lacZ R A Tc Exported -lactamase Tc rcnRA::lacZ A Tc 11 Expresión génica del operón rcnRA en R. leguminosarum SPF25 prcnRA1 -galactosidase activity A B prcnR 6000 12000 5000 10000 4000 8000 3000 6000 2000 4000 1000 2000 0 prcnA 0 0 100 200 M NiCl2 300 400 500 0 10 20 30 40 50 M CoCl2 12 Conclusiones La cepa UPM1137, aislada de suelos ultramáficos de Italia, es capaz de resistir elevadas concentraciones de níquel y cobalto en el medio. Mediante mutagénesis aleatoria de la cepa UPM1137 se han identificado 16 mutantes afectados en la resistencia a níquel. Siete de los mutantes se encuentran también afectados en la resistencia a cobalto. El sistema RcnRA es un sistema de salida de níquel-cobalto en R. leguminosarum bv. viciae y está implicado en la resistencia a ambos metales. Los genes rcnRA están organizados como un operón que se transcribe desde un promotor localizado cadena arriba del gen rcnR. La expresión de los genes rcnRA es inducible por níquel y cobalto. 13