USO DE HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA ACELERAR EL PROCESO DE GENERACIÓN DE VARIEDADES DE SOYA RESISTENTES A MOSQUITA BLANCA Resumen ejecutivo Este proyecto tuvo como fin contribuir a la resolución de este problema utilizando herramientas de biotecnología, como son los marcadores moleculares, para generar nuevas variedades con resistencia genética a ese insecto. Lo anterior, con dos propósitos: aumentar los rendimientos por unidad de superficie y recuperar la superficie de siembra de esta leguminosa. Este proyecto constó de tres etapas: a) identificación de marcadores moleculares asociados a la resistencia a mosquita blanca o a otros factores de estrés; b) identificación de progenitores donadores de los genes de resistencia, y c) obtención de poblaciones segregantes. Para la búsqueda y diseño de iniciadores la metodología consistió en: búsqueda en la literatura mundial tanto en libros, revistas científicas y de divulgación, publicaciones electrónicas, etc. además de consultar la base de datos mundiales de secuencias de genes reportados en el NCBI, con el objetivo de lograr la identificación de genes y marcadores genéticos relacionados con la resistencia a mosquita blanca en soya o especies relacionadas. Una vez concluida esta búsqueda se pasó al diseño de los iniciadores que permitieran identificar, seguir y eventualmente aislar los genes relacionados con la resistencia a estrés biótico. Se utilizó el programa OligoAnalyzer de idtDNA para el diseño de los oligos y el Reverse Complement de Bioinformatics para obtener complementos inversos. Los parámetros que se tomaron en cuenta, para el diseño fueron los siguientes: tamaño de oligonucleótidos iniciadores: 22-30 pb; tamaño del producto de amplificación: 250-1200 pb; Tm (melting point): 35-65ºC; %CG: 40-60; apareamiento en orquilla (hairpin): 4 máx.; autoapareamiento (self-dimer y hetero-dimer): 4 máx. Para el inicio de este proyecto se contó con 41 genotipos provenientes de los programas de mejoramiento de soya del INIFAP de Sonora, Culiacán y Tamaulipas. Con el propósito de obtener plántulas sanas para la obtención del ADN de calidad y concentración necesaria, primero se procedió con la siembra de las diferentes variedades de soya en invernadero con el siguiente procedimiento: a) las semillas fueron pretratadas previamente con etanol al 70% por 5 minutos y con hipoclorito al 0.6% durante 15 minutos y fueron enjuagadas con agua estéril; b) se sumergieron en solución de Ridomil a una concentración de 100 ppm durante 5 minutos; c) se sembraron 50 semillas de cada genotipo en condiciones estériles. Una vez germinadas las plantas libres de patógenos fueron trasplantadas a charolas con substrato estéril para obtener plántulas sanas; d) se trasplantó la plántula después de una semana de sembrada a macetas previamente lavadas y esterilizadas; e) se esperó entre dos y tres semanas para realizar la colecta de tejido vegetal y realizar la extracción del ADN. El aislamiento del ADN fue hecho de acuerdo al protocolo de extracción de CTAB modificado por Porebski et al., (1997). El ADN se cuantificó con la ayuda de un fluorómetro y se complementó con una cuantificación visual; la metodología fue la siguiente: se coloca en un gel de agarosa al 0.8 % cada uno de los ADN extraídos mezclados con un buffer de carga (Orange G 6%), junto con 100 ng de ADN del fago λ que funciona como referencia para la cuantificación. Este gel es corrido en una cámara de electroforesis a 86 volts por 1.5 hrs. Transcurrido este tiempo se captura la imagen del gel y se analizan los resultados por densitometría utilizando el programa “1D Image Análisis” versión 3.0 de Kodak. Con base en los datos obtenidos en la cuantificación, se uniformizan las concentraciones de todos los ADN a una concentración conocida. Para comprobar la calidad y concentración después de la extracción de ADN genómico se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa. Se seleccionaron como posibles marcadores y candidatos a ser clonados y secuenciados, los oligonucleótidos que de manera consistente amplificaron fragmentos únicos con diferentes patrones de movilidad electroforética. La selección de los progenitores se basó en los patrones electroforéticos obtenidos de los productos de amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos a genes de tolerancia a insectos, mosquita blanca y productividad. Se seleccionaron aquellos que presentaban la mayor cantidad de fragmentos esperados y estos presentaban un nivel de polimorfismo lo suficientemente informativo. La obtención de poblaciones segregantes se consiguió por medio de cruzas entre los materiales molecularmente sobresalientes en cuanto a la presencia de genes de resistencia. Se realizaron las cruzas reciprocas con el fin de poder evaluar si existía algún efecto materno. Demanda o problemática que atiende Mediante el uso de herramientas biotecnológicas, generar nuevas variedades de soya genéticamente resistentes a la mosquita blanca. Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología generada Identificación de marcadores moleculares asociados a la resistencia a mosquita blanca o a otros factores de estrés. Marcadores moleculares para selección asistida. Identificación de progenitores donadores de los genes de resistencia. Poblaciones segregantes con genes de resistencia piramidados, donde la probabilidad de obtener una nueva variedad de soya resistente a mosquita blanca es muy alta, probabilidad que se ve aumentada con el uso de los marcadores moleculares obtenidos para llevar a cabo una eficiente selección asistida. Impactos Los genotipos clasificados como tolerantes a mosquita blanca fueron: PI201422, Esperanza, PI-171443 y H98-1075; fueron los que presentaron un mayor número de fragmentos amplificados con los iniciadores diseñados para buscar secuencias relacionadas con la resistencia a mosquita blanca y otros estreses bióticos. Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada Este es un avance científico; no se puede estimar costos. Ámbito de aplicación Comunidad científica nacional. Información adicional o comentario La soya es originaria de china y es una leguminosa cuyo atributo más importante es que puede ser un componente destacado en la dieta desde el punto de vista funciona. Es la única legumbre que tiene los nueve aminoácidos esenciales en la proporción correcta para la salud humana. Por lo tanto, la proteína de soya está calificada como una proteína completa de alta calidad. El principal problema entomológico de este cultivo en México es la mosquita blanca (Bemisia argentifolii), debido a que la soya es uno de sus hospederos preferidos, lo cual es un factor limitante y determinante en la reducción de la superficie de siembra de esta leguminosa, ya que pasó de casi 250 mil ha en 1989 a 30 mil has actualmente; esto explica en parte la baja del rendimiento que en el mismo periodo pasó de poco mas de 2.0 ton /ha a menos de1.2 ton/ha. Clave del proyecto: SAGARPA 2005-C01-12235 Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: soya; fitomejoramiento Investigador: doctor MARIO M. GONZÁLEZ CHAVIRA Institución: Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.