REACIÓN DE LA RED MEXICANA DE AEROBIOLOGÍA PARA LA

REACIÓN DE LA RED MEXICANA DE AEROBIOLOGÍA PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA FITOSANITARIA (REMAVEF).
INFORME DEL TRABAJO
RESULTADOS PRELIMINARES DE LAS MUESTRAS DEL AIRE ENVIADAS A LA UNAM EN
NOVIEMBRE DE 2011.
Dra. María del Carmen L. Calderón Ezquerro
M. en C. Erika Arroyo Vázquez
Biól. Hilda Adriana Guerrero Parra
En noviembre de 2011 el Comité de Sanidad Vegetal de Quintana Roo (CSVQR),
Chetumal envió al Laboratorio de Bioindicadores Molecualares de Contaminación
Ambiental (LBMCA), Centro de Ciencias de la Atmósfera, laminitas muestreadas en
diferentes zonas de monitoreo.
Compromisos adquiridos por cada institución participante
CSVQR:
1) Monitoreo semanal en cada localidad seleccionada
2) Revisión en el microscopio de las muestras colectadas cada semana, con el objetivo
de buscar la presencia de uredosporas impactadas en las cintas de las trampas Cazaesporas. En el momento que encontrarán la presencia de uredosporas sospechosas
de la roya anaranjada se enviarían de inmediato al LBMCA, UNAM, para la
corroboración mediante detección molecular de la presencia de P. kuhenii causante
de la roya anaranjada. Sin embargo, ninguna muestra fue enviada a la UNAM hasta
el mes de noviembre de 2011.
LBMCA-UNAM
1) Detección molecular de ADN de uredosporas sospechosas de P. kuhenii, enviadas
del campo por el CSVQR.
Hasta el mes de noviembre llegaron al LBMCA-UNAM, 147 muestras (portaobjetos con
cinta de celofán conteniendo las partículas colectadas del aire), con fecha de junio a
septiembre de 2011. Las muestras provenían de diversas localidades del Mpio Othón P.
Blanco: Juan Sarabia, Sac-Xan, Palmar, Ramonal, Allende, Sabinos, Álvaro Obregón, Pucté,
Cacao y José N. Rovirosa.
Protocolo a seguir para el trabajo de laboratorio:
Al momento se están revisando y procesando las 147 laminitas muestreadas en las
diferentes zonas de monitoreo.
Se ha realizado la estandarización de la técnica de detección de uredosporas causantes
de roya anaranjada mediante PCR en punto final, con las muestras colectadas del aire de
cultivos de caña de azúcar de Chetumal, Quintana Roo.
A continuación se presenta el método de detección molecular y resultados obtenidos de
algunas de las muestras del aire de zonas cañeras de Chetumal Quintana Roo
monitoreadas.
Proceso de las muestras obtenidas del aire de zonas cañeras de Chetumal Quintana Roo.
 Detección con la prueba de PCR en punto final:
Las cintas de las trampas Caza-esporas impactadas con las esporas de hongos
colectadas del aire fueron revisadas al microscopio en búsqueda de posibles uredosporas
de P. kuhenii. Aquellas cintas con uredoporas fueron removidas y cortadas en secciones
de 24 mm, representando periodos de 12 horas de exposición. Cada sección se corto por
la mitad de manera transversal y fue colocada dentro de tubos Eppendorf de 1.5 ml para
la extracción de ADN y su posterior análisis en PCR.
 Rompimiento de esporas y extracción del ADN
El método utilizado para la extracción del ADN de las esporas impactadas en la cinta
de celofán fue tomado de Lee y Taylor (1990) y Williams et al. (2001) y Calderón (2002a y
b).
La cinta fue cortada en piezas de 10 x 5 mm y colocada dentro de tubos Eppendorf
de 1.5 ml a los que se le agregaron 250 µl de Nonident P40 (Sigma) al 0.1% y 0.2 g de
perlas de vidrio lavadas con ácido clorhídrico y de 400 a 455 µm de diámetro (Jencons-PLS,
Leighton Buzzard, UK), para remover las partículas impactadas sobre la cinta de celofán
Melinex y romper la pared de las esporas.
Todos los tubos fueron agitados en el equipo FastPrep (Thermo Savant
Instruments, Holbrook, Nueva York, EUA). Se llevaron a cabo pruebas en el FastPrep
buscando la velocidad y el tiempo óptimo de agitación, con el fin de determinar las
condiciones más eficientes que permitieran obtener la mayor concentración de ADN.
A partir de 50 µl de la suspensión resultante se purificó el ADN siguiendo el
método de Lee y Taylor (1990) y modificado por Williams et al. (2001) por la adición de 20
µg de glicógeno (Roche Diagnostics Ltd. Lewis, RU) como un acarreador para el ADN
durante la precipitación con isopropanol, y posteriormente se centrifugo. El botón de
ADN fue resuspendido en 50 µl de agua estéril Milli-Q (Millipore) y 5 µl de dicha
suspensión fue utilizada en las pruebas de PCR. La suspensión fue almacenada a 4 °C
hasta su uso para PCR.
Detección del ADN de roya anaranjada utilizando oligonucleótidos específicos en
las pruebas de PCR.
Condiciones de PCR utilizadas:
La detección de ADN se llevó a cabo con olognucleótidos específicos de Puccinia kuehnii
utilizando la sonda PK1-F y Pk1-R que generan un producto de 527 pb (Glynn et al. 2010).
Las reacciones de PCR en punto final se realizaron en un termociclador marca
Mastercycler Eppendorf. La prueba de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 µl
conteniendo 2.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 0.5 µM de cada sonda Ppa1 y Ppa2 y 2.5
unidades de Taq DNA Polimerasa (Applied Biosystems) y su respectivo buffer. Las
condiciones del ciclo fueron 94 °C por 5 min, seguidos por 35 ciclos de temperatura de
desnaturalización de 94 °C por 30s, temperatura de apareamiento de 56°C por 30s,
temperatura de polimerización de 72°C por 30 s y una extensión final de 72 °C por 7 min.
Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 2% y el ADN teñido con
bromuro de etidio.
RESULTADOS DE LA PRIMERA PARTE DEL ESTUDIO
Detección de P. kuhenii en hojas de caña de azúcar infectadas.
Cabe hacer notar que en la primera parte de este estudio en donde se realizaron las
detecciones directamente de hojas de caña de azúcar la detección de ADN de P. kuhenii
fue positiva en todas las localidades evaluadas. Las muestras de hojas de caña de azúcar
que fueron enviadas por el Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Chetumal Quintana Roo a
Sanidad Vegetal de la Ciudad de México el 22 de marzo de 2011. Asimismo, dichas
muestras fueron enviadas para ser procesadas al Laboratorio de Bioindicadores
Moleculares de Contaminación Ambiental, UNAM, la última semana de marzo de 2011.
En la fig. 1 se muestra las bandas de ADN de Puccinia. kuehnii colectada de hojas de caña
de azúcar de parcelas ubicadas en el Municipio de Othón P. Blanco, Quintana Roo. La
detección molecular se realizó utilizando los oligos PK1F y Pk1R ( Glynn et al. 2010).
Figura 1. Bandas de ADN de Puccinia. kuehnii colectada de hojas de caña de azúcar de
parcelas ubicadas en el Municipio de Othón P. Blanco en marzo de 2011.
RESULTADOS DE LA SEGUNDA ETAPA DEL ESTUDIO: MONITOREO DE ROYA
ANARANJADA DEL AIRE DE CULTIVOS DE CAÑA DE AZÚCAR.
De las muestras procesadas se obtuvo lo siguiente:
En la figura 2 se muestra la detección de ADN de muestras colectadas del aire con la
trampa CE de julio y agosto de 2011, en diversas zonas del Municipio Othón P. Blanco en
Chetumal Quintana Roo. Las cintas fueron revisadas al microscopio y aquellas que
presentaron más de una uredospora fueron utilizadas para realizar la detección molecular
con PCR.
Figura 12. Detección Molecular de ADN de uredosporas de P. kuehnii colectadas
del aire de cultivos de caña de azúcar de diversas localidades de Chetumal,
Quintana Roo. 1) Marcador molecular 100 pb; 2) Testigo positvo; 3) Rovirosa
(Julio); 4) Rovirosa (Julio); 5) Cacao (Agosto); 6) Allende (Julio); 7) Testigo negativo.
Se observan solo dos bandas de ADN, una del testigo positivo (línea 2) y otra
correspondiente al ADN de P. kuehnii colectada del aire de la localidad de Cacao.
En la figura 3 se muestra la detección de ADN de muestras colectadas del aire con la trampa
CE de junio a septiembre de 2011, en diversas zonas del Municipio Othón P. Blanco en
Chetumal Quintana Roo. Las cintas fueron revisadas al microscopio y aquellas que
presentaron más de una uredospora fueron utilizadas para realizar la detección
molecular con PCR.
Figura 3. 1) Marcador molecular 100 pb 2) Testigo positivo 3) Cacao (Septiembre); 4)
Juan Sarabia (Julio); 5) Pucté (Septiembre); 6) Ramonal; (Junio) 7) Ramonal
(Septiembre); 8) Rovirosa (Agosto); 9) Ramonal (Agosto); 10) Palmar (Septiembre);
11) Testigo negativo.
Se observan además de la banda de ADN del testigo, dos bandas más,
correspondientes a la zona de Juan Sarabia (línea 4) y Palmar (línea 10). Cabe
mencionar que éstas correspondieron a las muestras del aire obtenidas en los meses
de julio y septiembre. Asimismo, cuando las cintas del aire fueron revisadas al
microscopio mostraron un número muy bajo de uredosporas (1-5), las cuales podían
corresponder a P. kuehnii o a otra roya similar.
CONSIDERACIONES
El método de detección mostró que es posible detectar las uredosporas de P. kuehnii
tanto en altas concentraciones, como las detectadas directamente de las hojas de
caña de azúcar, como las impactadas en las cintas colectadas del aire, aun en
concentraciones muy bajas. Es necesario procesar un mayor número de muestras a
través de todo el año y de manera continua, con el fin de determinar la presencia del
hongo en el ambiente (hojas y aire). Para lo anterior, se propone que el monitoreo de
la roya anaranjada en Chetumal Quintana Roo, se realice a lo largo de todo el ciclo
agrícola de la caña de azúcar de manera estandarizada es decir, que se lleve a cabo la
revisión al microscopio semanalmente de manera ordenada y que en el momento en
que se sospeche de la presencia de la roya anaranjada en las muestras, éstas sean
enviadas de manera inmediata al laboratorio para su confirmación molecular, ya que
la acumulación de muestras durante meses, antes de ser procesadas no permitirá
realizar el seguimiento y la vigilancia de manera adecuada y oportuna.
Además de la detección de ADN mediante PCR en punto final, se ha planteado realizar la
detección con PCR en Tiempo Real con el fin de conocer con mayor exactitud la
concentración real de esporas presentes en el aire de las zonas esta propuesta para
llevarse a cabo con las muestras que sean colectadas del aire de zonas cañeras de San Luis
Potosí.