Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Manual del Laboratorio de Farmacología Semestre 2008-1 Q. Hermelinda de la Cruz Durán Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 1 Experimentación con Animales de Laboratorio Objetivo El alumno se familiarizará con los métodos empleados para la sujeción e identificación de los animales utilizados en la práctica de laboratorio. Introducción El bienestar de los animales utilizados en investigación es un tema de interés y en muchos países se han desarrollado leyes y regulaciones que aseguran ese bienestar. Se han buscado alternativas para sustituir el uso de animales de laboratorio, como por ejemplo simulación con computadoras, modelos in-vitro, cultivos de órganos y tejidos, y las modernas técnicas biotecnológicas. Sin embargo existen todavía limitantes de estas alternativas para algunos temas, sobre todo en lo que se refiere a farmacología. Por lo que en algunos casos es indispensable la utilización de animales, especialmente el de tipo roedor. Deben considerarse entonces algunas medidas para su mantenimiento en lugares apropiados (bioterios); en donde recibirán alimentación y cuidados especiales de acuerdo a las características propias de la especie a que pertenecen, como son: alimentación, jaulas de contención, control de enfermedades, reproducción, condiciones ambientales, etc. Notas: 1. Se suspenderá en forma definitiva de las sesiones de laboratorio al alumno que se sorprenda molestando a los animales (bajo ninguna circunstancia se deberá hacer sufrir al animal, el maestro responsable deberá indicar la manera en que ha de ser sacrificado, en caso necesario, así como su manejo durante la experimentación). 2. En caso de mordedura la persona deberá acudir inmediatamente al CUMAI para recibir inmunización contra tétanos, así como recibir atención preventiva, aplica lo mismo para excoriaciones hechas por material que ha estado en contacto con los animales. El animal agresor deberá ser puesto en observación durante un período no menor de 10 días, el incidente debe ser reportado tanto al instructor como al responsable del bioterio. Procedimiento 1. Se hará un recorrido por las instalaciones en forma ordenada para identificar las diferentes salas existentes. 2. El instructor mostrará la forma correcta en que se sujeta a cada animal de acuerdo a su especie (conejo, ratón, rata y perro). 3. Anote todas sus observaciones. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Resultados 1. Elabore un informe escrito de las actividades realizadas durante el recorrido así como de los siguientes datos: a. Forma de sujetar a cada animal. b. En caso de requerirse la administración de una sustancia, cual es el procedimiento mas adecuado en cada caso (sujeción y administración)? c. Las características de la cama que utilizan cada uno de ellos. d. El tipo de alimentación (incluida agua y alimento sólido). e. Las condiciones ambientales óptimas que deben existir en un bioterio. f. Las diferentes formas de identificación que existen (marcaje). 2. Elabore sus conclusiones. Cuestionario Complementario 1. Cual es la dosis de pentobarbital utilizada por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón, rata, perro y conejo? 2. Cual es el volumen máximo de una solución farmacológica que puede administrarse a las especies mencionadas en la pregunta numero uno, por vía IV, IM, IP, SC y Oral? Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Enero 30 de 2007 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 2 Variabilidad Biológica Objetivo El alumno diferenciará los diferentes aspectos que pueden variar el efecto de un fármaco y aplicarlos en los regimenes de dosificación. Introducción Los valores de las magnitudes biológicas no son constantes: varían en un mismo individuo y entre los individuos. Este fenómeno, se conoce como variabilidad biológica. Esta variabilidad se divide en variabilidad fisiológica, causada por las fluctuaciones metabólicas y otros procesos fisiológicos, variabilidad patológica, causada por las enfermedades, y variabilidad iatrogénica, causada principalmente por los tratamientos farmacológicos. Es importante subrayar que la variabilidad biológica es un fenómeno absolutamente independiente de la variabilidad debida a los procedimientos de medida, conocida como variabilidad metrológica. Las variaciones iatrogénicas están causadas, estrictamente, por medicamentos o actos terapéuticos o diagnósticos. Sin embargo, no son los medicamentos los únicos xenobióticos que pueden provocar la variación del valor de alguna magnitud biológica; los xenobióticos de uso más generalizado en nuestra sociedad — cafeína, nicotina y etanol— y las drogas de abuso también pueden hacerlo. Así pues, la biología y la práctica clínica indican que no hay dos sujetos iguales, la farmacología demuestra que la misma dosis de fármaco provoca una intensidad de respuesta diferente en diferentes pacientes. Esta diversidad, en parte a la farmacocinética (diferente absorción, metabolismo y excreción del fármaco) y a la farmacodinámia (interacción fármaco-receptor), por causas del tipo genético, ambientales o del curso clínico de las enfermedades (agudas, crónicas, etc.), hace que la medición de los fenómenos biológicos varíe a causa de estos factores ingobernables o accidentales. Los valores obtenidos serán diferentes, sin embargo cada valor se aproxima mas o menos a un valor medio, por lo que puede decirse que ese conjunto de valores se distribuye en torno a la media (X). Cuando mayor sea el número total de medidas, el valor de la media se acercara al valor verdadero del fenómeno de referencia y la distribución de esas medidas será simétrica porque las variaciones positivas o negativas se equilibran mutuamente. El valor verdadero lo es teóricamente en un conjunto infinitamente grande o universo, pero ante la imposibilidad de obtener ese conjunto o universo, podemos obtener un valor cercano al verdadero si estudiamos una parte de tal universo, o sea efectuar un número finito de medidas, experimentos u observaciones, que constituyen lo que se llama una "muestra" colección de ensayo o tanteo. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Procedimiento 1. Nombrar dos voluntarios por equipo, siguiendo los criterios de inclusión establecidos. 2. Determinar la temperatura corporal basal de cada individuo. 3. Administrar una dosis de aspirina de 500mg a cada uno y determinar la temperatura en los siguientes intervalos de tiempo: 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 60 minutos postadministración. 4. Concentrar en una tabla los resultados de cada equipo. 5. Con los datos de todo el grupo determinar las variables: media (X) y desviación estándar (σ) a cada intervalo de tiempo. 6. Hacer una gráfica con los resultados, con un margen de ± una desviación estándar. Resultados 1. Anota tus observaciones durante el experimento. 2. Elabora tus conclusiones con base en los resultados obtenidos y los plasmados en la gráfica. Cuestionario Complementario 1. Que es la desviación estándar. 2. Cuales son los factores más comunes que interfieren en la respuesta de un fármaco. 3. Como puede interferir la variabilidad biológica en un régimen terapéutico. Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Agosto 21 de 2006 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 3 Vías de Administración Objetivo El alumno será capaz de observar la influencia de las diferentes vías de administración, utilizando animales de laboratorio y una solución que permitirá apreciar la llegada de los compuestos administrados a diferentes órganos y tejidos. Introducción Existen diversos medios por los que el medicamento puede introducirse en el organismo. Es posible que un mismo medicamento esté preparado para utilizar más de una vía, del mismo modo que existen fármacos diseñados para acceder al organismo por un único camino. Existen varias vías de administración para los medicamentos como la oral, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, inhalación, instilación ocular, rectal, vaginal o parenteral (subcutánea, intramuscular, intravenosa). Cada medicamento está preparado para ser administrado por vía determinada y que ejerza su acción de la forma más conveniente. Para cada vía de administración existen diferentes formas farmacéuticas. Por ejemplo, para la vía oral se preparan cápsulas, comprimidos, comprimidos recubiertos, comprimidos efervescentes, comprimidos masticables, suspensiones, soluciones, jarabes, elixires, etc. La elección depende de diversas variables. Algunas son: el tipo de medicamento, es decir, sus particularidades. La absorción del mismo: en qué lugar del organismo (estómago, duodeno, piel, etc.) conviene que se produzca y a qué velocidad. El propio paciente; hay que tener en cuenta los condicionantes fisiológicos (como el estado de su aparato digestivo, necesidad de una acción más o menos rápida, etc.) y condicionantes psicológicos (es frecuente que a los niños les entre mejor un jarabe que una grageas). Procedimiento 1. Pesar las ratas y calcular para cada una el volumen de anestésico a administrar de acuerdo al peso del animal y a una dosis ponderada de 15mg/100gr de peso. 2. Anestesiar las ratas administrando el volumen total de anestésico por vía intraperitoneal (IP), dejar reposar 10 minutos. 3. Administrar azul de metileno al 0.01%, utilizar una rata para cada vía de administración de acuerdo a la siguiente tabla: Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Vía de Administración Intravenosa (IV) Intramuscular (IM) Intraperitoneal (IP) Subcutánea (SC) Oral (PO) Volumen a Administrar (ml) 0.5 1-2 5-10 5-10 1-2 4. Dejar reposar 20 minutos y hacer la disección de cavidad abdominal. 5. Llevar a cabo una exploración física interna y por observación buscar azul de metileno en órganos y tejidos. 6. Anotar tus datos en la tabla de resultados. Cuestionario Complementario 1. Cuales son las principales vías de administración de fármacos? 2. Explique ventajas y desventajas en la terapéutica con fármacos en las siguientes vías de administración: oral, sublingual, rectal, inhalación, subcutánea, intravenosa, intratecal y tópica. 3. Define administración parenteral y menciona todos los tipos que conozcas. 4. Mencione dos fármacos que se apliquen por cada vía de administración. Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Agosto 21 de 2006 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 4 Fármacos Antihistamínicos Objetivo A través de la aplicación dérmica de histamina el alumno observará y medirá el efecto de fármacos antihistamínicos. Introducción Los antihistamínicos han sido usados durante los últimos 50 años y se han convertido en unos de los medicamentos de mayor prescripción en México. La denominación actual es “antagonistas de los receptores de la histamina”, su acción consiste en evitar el efecto de la histamina en los diferentes tejidos del cuerpo. La histamina o b-aminoetilimidazol fue aislada por vez primera en 1907 por Windaus y Vogt; en 1910, Daley y Laidlow estudiaron su efecto biológico y descubrieron que estimulaban a diversos músculos lisos. En 1940, se desarrolló el primer antihistamínico antagonista H1 para uso en el humano: fenobenzamina con buenos resultados. En 1944 se comercializa el maleato de pirilamina; en 1946, la difenhidramina y tripelenamina y, en 1949, la clorfeniramina. Todos estos antihistamínicos H1 han sido denominados de “primera generación, clásicos o sedantes” por ser los primeros. En los últimos 15 años se han sintetizado antihistamínicos con alto potencial inhibitorio; a éstos se les denomina antihistamínicos H1 de “segunda generación”. Con el advenimiento de nuevas técnicas de investigación se fueron descubriendo nuevos receptores de la histamina: el receptor H1 en 1966, el receptor H2 en 1972, el receptor H3 en 1983 y el receptor H4 en 2000. Cuando la histamina es liberada de mastocitos, basófilos, neuronas histaminérgicas u otras células, se debe unir a cierto receptor de histamina: H1, H2, H3 o H4. Los antihistamínicos H1 de primera y segunda generación antagonizan al receptor H1, utilizandose en la clínica contra rinitis, urticaria, lagrimeo, o como antialérgicos. Los antagonistas del receptor H2 se utilizan en la clínica para reducir la secreción de ácido gástrico en el tratamiento del paciente con enfermedad ácido péptica. Hasta el momento no existen antagonistas del receptor H3 y H4 para uso clínico; sin embargo, dentro del campo de estudio de estos receptores se ha descubierto que participan, respectivamente, en la regulación de la neurotransmisión y en procesos inflamatorios. Material Balanza granataria Lancetas estériles Gotero Regla Matraz volumétrico de 10cc Histamina Agua estéril Alcohol Algodón Medicamentos antihistamínicos Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Soluciones Histamina al 10% Procedimiento 1. Formación de equipos de trabajo. 2. Preparación de soluciones. Pesar exactamente 1 gr de histamina. Disolver en 3cc de agua estéril. En Matraz volumétrico llevar a un volumen de 10cc con agua estéril. 3. Administración de medicamentos antihistamínicos. Nombrar un voluntario por equipo y administrarle el medicamento antihistamínico que señale el instructor. Nombrar un equipo para que el voluntario sea el “individuo control”. Administrar cada medicamento de acuerdo a la dosis usual del antihistamínico que se trate. 4. Administración de histamina. Después de transcurrida 1 hora de administrado el medicamentos antihistamínico, asear con una torunda alcoholada el antebrazo del voluntario. Colocar una gotita de histamina al 10% sobre la piel, evitar que esta se derrame. Sobre la gota de histamina, pinchar con una lanceta estéril. Tomar lecturas del diámetro del halo de reacción a la histamina (inflamación y/o enrojecimiento) a los 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos post aplicación de la histamina. 5. Con el individuo control proceder igual que en 4; pero sin haber tomado algún fármaco antihistamínico. 6. Elaborar una tabla con los resultados de todo el grupo. 7. Elabora tus conclusiones. Cuestionario Complementario 1. Menciona los tipos de receptores histamínicos?, con que efectos están comúnmente relacionados en nuestro cuerpo? 2. Que efecto(s) tiene la histamina en nuestro cuerpo? 3. Cual es la fórmula desarrollada de la histamina? 4. Que tipo de enlaces químicos puede formar con su receptor biológico? 5. Menciona los fármacos antihistamínicos que se utilizan con fines terapéuticos? 6. Menciona al menos un medicamento para cada fármaco de los mencionados en la pregunta anterior. Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Enero 30 de 2007 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 5 Distribución de Fármacos Objetivo Por medio del análisis cualitativo y cuantitativo determinar la distribución de un fármaco en los diferentes compartimentos del organismo. Introducción La distribución es un proceso farmacocinética en el que tiene lugar el transporte del fármaco desde su lugar de absorción hasta el órgano donde va a ejercer su efecto. No obstante, es importante considerar que una vez absorbido el fármaco es distribuido no solo hasta el sitio donde va a actuar, si no que al mismo tiempo llega a otros órganos en donde va a ser eliminado, metabolizado o acumulado. La mayoría de los fármacos se unen a proteínas plasmáticas para circular en el organismo. La albúmina es la principal de estas proteínas acarreadoras; tiene dos sitios de unión para fármacos, uno para fármacos de carácter ácido, y otro para fármacos de carácter básico. Los esteroides corticales y algunos otros fármacos de carácter básico se unen también a las alfa-1-globulinas. La unión de los fármacos a las proteínas depende esencialmente de la afinidad que tengan los fármacos, y constituye una cifra estable para cada fármaco. Esta unión es reversible, encontrándose siempre un determinado porcentaje libre y cuando éste se elimina del plasma una nueva cantidad de fármaco se desprende de su unión a proteínas y toma su lugar, de tal modo que las fracciones libre y unida a proteínas permanecen constantes. Ocasionalmente, cuando se sobrepase la capacidad de fijación de la albúmina, aumenta la fracción libre. Solamente el fármaco libre es activo, puesto que es el único capaz de atravesar barreras y difundir a los tejidos. Una vez que el fármaco se encuentra en plasma, la concentración que alcanza en los diferentes tejidos depende esencialmente de dos factores: el flujo sanguíneo regional, y la salida del fármaco del interior vascular. La unión del fármaco a las proteínas y la salida del fármaco del interior vascular condicionan un parámetro que conocemos con el nombre de volumen de distribución (Vd). Se define como Vd el volumen de agua corporal en el que el fármaco se encuentra realmente disuelto. Pero este parámetro de “Vd real” no es fácilmente medible, por lo que recurrimos al “Vd aparente” que corresponde a: Vd = DOSIS Cp Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Decimos que este volumen de distribución es aparente por que no refleja con exactitud donde se encuentra el fármaco. Por ejemplo, Si la Cp es muy baja el Vd será muy alto, indicándonos que esta acumulado en algún tejido; por el contrario, si el fármaco esta muy unido a proteínas la Cp será alta y el Vd será bajo. A pesar de ello nos sirve para conocer la distribución corporal de un fármaco: Vd Vd Vd 3 Litros 12 Litros 40 Litros ------------------------------------------------------------- Fármaco en plasma Fármaco en plasma + intersticio Fármaco en plasma + intersticio + células Material y Equipo Espectrofotómetro UV-VIS Balanza analítica Balanza granataria Balanza para roedores Mesa de cirugía para roedores Equipo de disección completo Jaula metabólica Centrífuga Agitador Vortex Portaobjetos (6) Jeringa de 1cc (2) Tubo de ensaye 16x100 con tapón de rosca (10) Tubo de ensaye 16x125 con tapón de rosca (10) Matraz volumétrico de 500 cc (1) Matraz volumétrico de 100 cc (1) Matraz volumétrico de 25 cc (8) Matraz volumétrico de 10 cc (5) Pipeta volumétrica 0.5 cc (1) Pipeta volumétrica 1 cc (3) Pipeta volumétrica 2 cc (1) Pipeta volumétrica 3 cc (1) Pipeta volumétrica 5 cc (1) Pipeta graduada 20 cc (1) Pipeta graduada de 10 cc (2) Pipeta graduada 5 cc (1) Pipeta graduada 1 cc (1) Soluciones y Reactivos Pentobarbital sódico Ácido tricloroacético (TCA) Nitrito de Sodio Sulfacetamida Cloroformo Hidróxido de sodio Alfa-naftiletilendiamina Sulfamato de amonio Ácido clorhídrico Sulfacetamida 4 mg/cc (10cc) Hidróxido de sodio 0.1 N ( 60cc) Ácido tricloroacético 15% (25cc) Ácido clorhídrico 4 N (10 cc) Nitrito de sodio 0.1% (10cc) Sulfamato de amonio 0.5% (10cc) Alfa-naftiletilendiamina 0.1% (10cc) Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Procedimiento Sesión 1 (primera parte) 1. Se administra a la rata sulfacetamida en dosis de 10 mg/Kg de peso. 2. Se coloca el animal en una jaula metabólica por espacio de 30 minutos. 3. Si no se ha colectado orina en este intervalo de tiempo, induzca al animal presionándole levemente la parte inferior del abdomen. 4. Anestesie al animal y prepárelo en la mesa de cirugía. Abra la cavidad abdominal (en este momento puede obtener orina por insición directa en la vejiga, si no se logro anteriormente). 5. Abra además la cavidad toráxico y craneana. Obtenga 1cc de sangre por punción directa al corazón del animal. 6. Obtenga también muestras de 0.5-1.0 gr de los siguientes órganos: hígado, riñón, intestino, corazón, cerebro y músculo de la región glútea. 7. Coloque las muestras obtenidas en un portaobjetos y péselo, después de esto proceda a desmenuzarlas con la ayuda de una navaja de bisturí y transfiéralas a un tubo de ensaye que contenga 10cc de NaOH 0.1 N, lave el portaobjetos y péselo de nuevo por diferencia conocerá el peso de la muestra. 8. Procese cada una de las muestras de acuerdo al procedimiento indicado. Procesamiento de las muestras: Sangre: Lleve 1cc de sangre a un tubo que contenga 9cc de agua y agite en vortex. Tome 1cc de esta dilución y transfiérala a otro tubo, adicione 12cc de agua y agite de nuevo. Agregue 4cc de ATC al 15% y agite por 1 minuto. Centrifugue a 3,000 rpm por 3 min. Del sobrenadante tome una muestra de 5cc y pásela a un tubo limpio. Etiquetar el tubo especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar en congelación para la segunda parte de esta práctica. Orina: Tome 100 mcl de orina y agregue a un tubo que contenga 1.9cc de agua. Agite y tome 1cc de esta orina diluida y transfiérala a otro tubo conteniendo 11cc de agua. Adicione 4cc de TCA al 15% agite y centrifugue a 3,000 rpm por 3 minutos. Del sobrenadante tome una muestra de 5cc y pásela a un tubo limpio. Etiquetar el tubo especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar en congelación para la segunda parte de esta práctica. Tejidos y Órganos: En el tubo que contiene la muestra y la solución de NaOH deberá agitarse en vortex por 1 minuto en 3 ocasiones, en un período de 10 minutos. Después se dejará reposar por 15 minutos. Se toman 2cc del sobrenadante y se adicionan 2cc de TCA al 15%, agitar por 30 seg. Adicionar 6cc de agua y agitar de nuevo. Centrifugar por 5 minutos a 3,000 rpm. Tomar del sobrenadante una muestra de 5cc y pasar a un tubo limpio. Etiquetar el tubo especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar en congelación para la segunda parte de esta práctica. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Sesión 2 (segunda parte) Para iniciar con esta sesión, permita que las muestras se descongelen a temperatura ambiente, o en baño de agua a temperatura ambiente. Cuantificación de Sulfacetamida por la técnica analítica de Bratton-Marshal 1. A 5cc del sobrenadante se le adicionan 1cc de HCl 4N, 1cc de Nitrito de sodio al 01% y se agita en vortex por 5 minutos. 2. Posteriormente agregar 1cc de Sulfamato de amonio al 0.5% y agite de nuevo por 3 minutos, manualmente de manera vigorosa. 3. Por ultimo adicione 1cc de alfa-naftiletilendiamina al 0.1%, agite y repose en la oscuridad por 10 minutos. 4. Lea la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm. 5. Hacer exactamente este mismo procedimiento a un blanco que consiste en 5cc de agua, que se trata a la par con las muestras.. Curva patrón de sulfacetamida: Solución patron de Sulfacetamida (100 mcg/cc): Pesar en balanza analítica 50mg de Sulfacetamida, colocarla en un matraz volumetrico de 500cc. Llevar al aforo con agua. Soluciones estándar de Sulfacetamida: Tomar la alícuota necesaria de la solución patrón de sulfacetamida y preparar 25 cc de cada una de las concentraciones descritas a continuación: 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 16 mcg/cc. Tomar 5 ml de cada una de las soluciones estándar de sulfacetamida y colocar en un tubo de ensaye y proceder de acuerdo a la técnica de Bratton-Marshal. Hacer este procedimiento por duplicado para cada una de las concentraciones. Incluir un blanco con 5cc de agua. Resultados Con los resultados de la curva estándar calcular el promedio, desviación estándar y el coeficiente de variación de las absorbancias obtenidas para cada concentración. Elaborar una gráfica de concentración de sulfacetamida (mcg/ml) vs Absorbancia promedio; calcular por mínimos cuadrados el coeficiente de correlación. Con la gráfica obtenida hacer interpolaciones con los valores de absorbancias de las muestras y calcular las concentraciones de sulfacetamida en sangre, orina y en los diferentes órganos y tejidos. Reporte sus resultados en una tabla donde se especifiquen los valores de absorbancia y concentraciones obtenidas, y la gráfica correspondiente. Elabora tus conclusiones. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Cuestionario Complementario 1. Que propiedades deberá tener un fármaco para poder encontrarse en el eritrocito? 2. Cual es el componente proteico más importante en la distribución de fármacos. 3. La distribución será un proceso reversible? Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Enero 30 de 2007 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 6 Estimulación en Inhibición del Metabolismo Farmacológico Objetivo Estudiar la influencia de la inducción del metabolismo por medio de daño hepático y la estimulación del metabolismo por medio de la administración crónica de un fármaco utilizando animales de laboratorio. Introducción El metabolismo es uno de los principales mecanismos por medio del cual la acción de un fármaco se puede concluir. La mayoría de los fármacos pasan por un proceso metabólico, que los convierte en productos más polares (metabolitos). Esto es de suma importancia en el manejo global de un fármaco, ya que al pasar por esta biotransformación no solo se diminuye su actividad biológica, si no que lo hace más susceptible a ser excretado. La intensidad y duración de la acción de un fármaco es determinada por el grado de biotransformación que sufre y la velocidad con que sea eliminado del cuerpo. Este grado de transformación o metabolismo puede ser afectado por varios factores como edad, sexo, raza, dieta, aspectos genéticos, exposición a sustancias químicas, etc. A través de estudio cinéticos esta demostrado que una sustancia puede ser capaz de modificar el patrón metabólico de otra. Ejemplos de ello son el Ketoconazol (antimicótico) que es capaz de inhibir el metabolismo de Diacepam (anticonvulsivo), pudiendo presentarse síntomas de intoxicación por elevación de niveles plasmáticos de Diacepam. Mientras que por otro lado Fenobarbital es capaz de inducir el metabolismo de muchos otros fármacos disminuyendo su concentración, lo que podría hacer que se presenten niveles subterapéuticos. Material y Equipo Balanza para roedores Jeringa 1cc Pentobarbital sódico Tetracloruro de carbono Algodón Jaula para ratones Ratones Procedimiento 1. Cada equipo tendrá 5 ratones pesados y marcados perfectamente. 2. Los alumnos se dividirán en tres equipos, el equipo numero 1 trabajará con ratones sin pretratamiento (control); el equipo numero 2 trabajara con ratones inducidos; y el equipo numero 3, con ratones inhibidos. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo 3. A cada ratón se le administra pentobarbital a una razón de 50 mg/Kg de peso. 4. Determinar el tiempo de inicio del sueño y duración del mismo. El tiempo de inicio de sueño se determina por la perdida del reflejo de enderezamiento. Esto se logra cuando al voltear al animal éste no regresa instantáneamente sobre sus patas. Pretratamiento Los ratones se tratarán por 5 días previos al experimento, como a continuación se describe: o Inducción enzimática.- cada ratón recibe pentobarbital a una razón de 10 mg/Kg de peso, por vía intraperitoneal diariamente. o Inhibición enzimática.- los ratones se introducen en un frasco que contiene algodón impregnado de tetracloruro de carbono, hasta que el animal muestre algún signo de incoordinación. Sáquelo inmediatamente para que pueda recuperarse. Tenga cuidado al utilizar el tetracloruro de carbono; el algodón no debe contener líquido en exceso y la exposición no debe ser prolongada, pues puede matar al animal o sedarlo por completo, lo cual no es recomendable. Esto se repite diariamente. Resultados 1. Construya una tabla con los resultados de los tres grupos anotando los tiempos de perdida del reflejo de enderezamiento (PRE) y duración del efecto o tiempo de sueño. 2. Calcule los tiempos promedio de cada grupo. 3. Elabore una gráfica de barras y compare los tiempos promedio de inducción (I) y duración (D), obtenidos para cada grupo. 4. De acuerdo a los resultados y la gráfica obtenidos que puede concluir acerca del experimento? Cuestionario Complementario 1. Continuará por siempre la inducción enzimática aún cuando se suspenda la administración del fármaco que la ocasiona? 2. Defina los términos de inducción e inhibición farmacoinducida. 3. De por lo menos tres ejemplos de otros fármacos que sufran este mismo fenómeno. Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Enero 30 de 2007 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 7 Determinación de Dosis Efectiva al 50 (DE50) y Dosis Letal al 50 (DL50) Objetivo El alumno se familiarizara con la metodología experimental y los cálculos necesarios para obtener la Dosis Efectiva al 50 y Dosis Letal al 50 de un compuesto exógeno. Introducción Una manera importante de conocer y caracterizar el efecto de un fármaco es la determinación de su curva dosis-respuesta. En este caso, en la ordenada o eje de las “Y” o eje vertical se especifica la intensidad del efecto farmacológico hasta su máxima expresión, relacionándola con la dosis o el logaritmo de la dosis en el eje de las “X” o abscisa o eje horizontal. En General el incremento de la dosis produce un aumento paralelo en la intensidad de la respuesta, hasta un determinado limite que es el efecto máximo. En Farmacología la respuesta aumenta hasta ese punto máximo, después del cual el incremento de la dosis no va acompañado de un incremento de los efectos farmacológicos. El efecto máximo determina ante el aumento de la dosis, el plateau o la meseta de la curva. En caso de aumentar la dosis después del plateau pueden aparecer efectos tóxicos o la muerte sin aumentar la intensidad de los efectos farmacológicos. La toxicidad de un fármaco puede medirse con el conocimiento de la dosis letal 50 (DL50), que es la dosis capaz de provocar la muerte del 50% de los animales de laboratorio. La dosis efectiva 50 (DE50) es por otra parte la dosis que produce los efectos deseados o terapéuticos en el 50% de los pacientes. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo El tratamiento logístico para la transformación lineal de la curva, propuesto por Berkon (1934) consiste en aplicar logaritmos a las dosis utilizadas y en la transformación de la respuesta en Logit de la siguiente manera: L = ln (p/q) Donde: p = probabilidad de acierto. q = probabilidad de error. Entonces, graficando L vs ln D, obtenemos la ecuación de la recta L = ln D + b; donde m = pendiente y b = intercepto al eje de las “Y”. Y si queremos encontrar ln D50, despejando: ln D50 = -b/m D50 = e –b/m Procedimiento 1. Cada equipo de trabajo utilizará un grupo de 5 ratones. A los cuales se les administrará una misma dosis. 2. Marcar y pesar cada uno de los ratones. 3. Administrar el volumen de anestésico que le corresponda a cada ratón de acuerdo a su peso y a la dosis que le toca probar al equipo de trabajo. 4. Las dosis a probar durante el experimento son: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 120, y 160 mg/Kg de peso. 5. Determinar el número de animales muertos y vivos. 6. Después de media hora sacrificar los ratones que hallan quedado vivos con una dosis de pentobarbital a una razón de 200 mg/Kg de peso. 7. Proceder con los ratones muertos de acuerdo a las buenas prácticas de disposición de RPBI. Resultados 1. Ordena los resultados de tu experimento de acuerdo a la siguiente tabla: Dosis (mg/Kg) Log D No. Ratones Dormidos Muertos Porcentaje Ratones Dormidos Muertos p Dormidos q Muertos Dormidos ln(p/q) Muertos Dormidos Muertos 10 20 30 40 50 60 80 120 160 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo 2. 3. 4. 5. 6. Elabora una gráfica con tus resultados; con los valores de %Efecto vs Log D. Elabora una gráfica con los valores de L vs ln D. Determina por el método gráfico la DE50 y DL50. Calcula por el método Logit los valores de DE50 y DL50. Elabora tus conclusiones con respecto al experimento. Cuestionario Complementario 1. Cual es la DE50 y DL50 de pentobarbital sódico rata y ratón, reportados en la literatura. 2. Como podemos medir la potencia de un fármaco?, explica tu respuesta. 3. Define los conceptos de: a. Intervalo terapéutico (IT). b. Dosis Toxica 50 (DT50) c. Índice de seguridad (IS) Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Octubre 30 de 2006 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Práctica No. 8 Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos Objetivo A través de la cuantificación de ácido acetil salicílico en orina el alumno determinará la influencia del pH urinario en la excreción de fármacos. Introducción El riñón es el órgano de excreción de principios activos y de metabolitos. Pera esto, ejecuta tres funciones: filtración glomerular, secreción tubular y reabsorción tubular. Filtración glomerular: el paso del fármaco del plasma al filtrado glomerular se efectúa a través de la pared del glomérulo por filtración debido a un gradiente de presión. Solamente pueden atravesar esta membrana las moléculas que poseen un tamaño lo suficientemente reducido: las macromoléculas, como la albúmina, las globulinas y otras proteínas plasmáticas no pueden atravesarla, ni mucho menos el fármaco que se encuentre unido a ellas. La velocidad de filtración es función del flujo sanguíneo renal, por lo que en casos de insuficiencia cardiaca se producirá un descenso de la excreción renal de los fármacos. Se trata de un proceso pasivo que no requiere gasto de energía. Secreción tubular: proceso que sigue un mecanismo de transporte activo, que se efectúa en el túbulo proximal, por el que algunos fármacos presentes en la sangre pasan a la luz tubular. Se trata de un proceso saturable, existiendo, por lo tanto, mecanismo de competencia por un mismo sistema de transporte activo. Reabsorción tubular: proceso por el que el fármaco que a llegado a la luz tubular, ya sea por filtración glomerular o por secreción tubular, es reabsorbido a nivel tubular y pasa de nuevo a la sangre. Este proceso se efectúa por difusión pasiva, por lo que influyen notablemente la liposolubilidad, el grado de ionización y el peso molecular del fármaco a reabsorber. Conviene recordar que el pH de la orina puede modificar el grado de ionización de numerosos fármacos y, por tanto, su mayor o menor facilidad para poder ser reabsorbidos y pasar a la sangre o, de forma alternativa, ser excretados en la orina. A la vista de todo lo anterior, se puede afirmar que la velocidad de excreción renal de un fármaco es igual a la velocidad de filtración más la secreción, menos la velocidad de reabsorción. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Procedimiento A) El grupo se dividirá en tres equipos. Equipo No.1. Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario alcalino. Equipo N0.2: Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario ácido. Equipo No.3: Estudiará la excreción de aspirina en un pH normal. Cada equipo nombrará un voluntario, quien se tomará una dosis de 1 gr de Aspirina vía oral, y procederá de acuerdo al protocolo experimental que a continuación se muestra. B) Criterios de inclusión y/o exclusión. 1. Jóvenes sanos de 18 a 28 años de edad. 2. Sexo masculino o femenino. 3. No padecer ningún tipo de enfermedad crónica. 4. Al momento del experimento no estar enfermos. 5. No consumir, al menos una semana antes y durante el experimento, algún fármaco terapéutico, social o de abuso. 6. No consumir bebidas alcohólicas al menos 3 días antes y durante el experimento. 7. Respetar el protocolo experimental, mismo que se le dará a leer y entenderá antes de iniciar el estudio. 8. Firmar carta de consentimiento informado, antes de iniciar el estudio. Protocolo experimental: 1. El día del experimento cada voluntario vaciará completamente la vejiga a las 5:00 am. Llevar a cabo la micción en un vaso de precipitados. Tomar el pH de la orina, anotar el valor en la hoja correspondiente y desechar la orina. 2. Tomar una tableta de Aspirina de 1g con 200 ml de agua natural. Anotar en la hoja correspondiente la hora exacta de la toma del medicamento. 3. A las 6:00 am Tomar la siguiente solución: Equipo No.1 (orina alcalina): tomar 40 mEq (4 g) de bicarbonato de sodio (NaHCO3), posteriormente tomar 12 mEq (1 g), cada 4 horas (a las 10:00 am y 2:00 pm). Equipo No.2 (orina acida): tomar 4 g de ácido ascórbico, posteriormente tomar 2 g, cada 4 horas (a las 10:00 am y 2:00 pm). Equipo No.3 (control): tomar 200 ml de agua natural. 4. Asegurarse de tomar 200 ml de agua cada hora, las primeras 6 horas postadministración. Después de las 6 horas consumir agua al gusto. 5. Durante el experimento no consumir ninguna otra clase de líquidos (bebidas carbonatadas, agua de frutas, agua con saborizantes, etc.). 6. Colectar la orina durante 10 horas (ultima orina colectada a las 3:00 pm) postadministración del fármaco. Durante este periodo orinar cada vez que el cuerpo lo requiera. Asegurarse de cada vez de vaciar completamente la vejiga. Depositar la orina en un vaso de precipitado y medir el volumen total en una probeta graduada. Tomar el pH de la orina. Guardar una alícuota de 200 ml y desechar el resto. Anotar volumen de orina, pH urinario y la hora de micción en la hoja correspondiente. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo 7. A las (8:00 am consumir un desayuno, el cual consistirá de 2 sándwiches; elaborados con una rebanada de jamón y una de queso, una rodaja de tomate y, lechuga y mayonesa al gusto. Además, una manzana de tamaño mediano. 8. A las 13:00 consumir una comida al gusto. Incluir una bebida de té helado, máximo de 300 ml. Cuantificación de salicilatos en orina Material 1 matraz volumétrico de 100 ml 1 matraz volumétrico de 50 ml 1 matraz volumétrico de 25 ml 3 pipetas volumétricas de 1 ml 1 pipeta graduada de 5 ml 12 tubos de ensaye de 13x120 mm Equipo Balanza analítica Espectrofotómetro UV-visible Centrífuga Agitador vortex Reactivos Salicilato de sodio Nitrato férrico nonahidratado Cloruro mercúrico Ácido clorhídrico 1N Soluciones Reactivo para desarrollar color: Pesar con exactitud y por separado 4 g de nitrato férrico nonahidratado y 4 g de cloruro mercúrico, colocarlos en un matraz volumétrico de 100 ml. Adicionar un poco de agua destilada para disolver, añadir 12 ml de una solución 1 N de ácido clorhídrico y diluir hasta el aforo con agua destilada. Solución patrón de referencia de salicilato de sodio a concentración de 100 mcg/ml: Pesar con exactitud 50 mg de salicilato de sodio y depositarlos en un matraz volumétrico de 50 ml, disolver totalmente en 20 ml de orina libre de medicamentos (diluida 1:1 con agua) y llevar hasta el aforo con la misma orina. De esta solución tomar con exactitud una alícuota de 2.5 ml y depositar en un matraz volumétrico de 25 ml, llevar al aforo con agua. Desarrollo del método analítico para cuantificar salicilatos en orina. En un tubo de ensaye colocar 1 ml de muestra de orina y adicionar 5 ml del reactivo para desarrollar color, agitar la muestra en vortex durante 1 min y centrifugar durante 5 min a 2500 rpm para obtener una solución transparente; decantar la solución a un nuevo tubo de ensaye y determinar absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo un blanco de agua preparado a las mismas condiciones que la muestra. De igual manera proceder con 5 ml de la solución patrón de referencia de salicilato de sodio a 100 mcg/ml. Resultados 1. Calcular la concentración de salicilato en las muestras de orina, utilizando la siguiente ecuación: (Concentración solución de referencia)(Absorbancia de la muestra) Concentración de la muestra = (Absorbancia solución patrón de referencia) 2. Calcula la cantidad total de salicilato en cada una de las muestras de orina. 3. Determinar la cantidad total de salicilato eliminado durante el periodo completo de muestreo. 4. Compara los resultados de los tres equipos de trabajo y elabora tus conclusiones. Cuestionario Complementario 1. Que otro compuesto se puede utilizar para acidificar la orina? 2. Menciona tres fármacos básicos y tres ácidos con los cuales se favorezca su excreción acidificando o alcalinizando la orina, respectivamente? Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán Fecha: Noviembre 08 de 2006 Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos Hoja de Registro Fecha: Nombre del Voluntario: Edad: Peso: Orina: Acida ( ) Alcalina ( ) pH Urinario Basal: Hora de toma del medicamento: Numero Muestra Hora pH Orina Sexo: M( ) F( ) Control ( ) Volumen Excretado Observaciones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Comentarios: Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería Químico Farmacobiólogo Carta de Consentimiento Informado Lugar y Fecha: __________________________________________________________________. Por medio de la presente acepto participar en el estudio de: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________, correspondiente a la practica No. 7 del manual de laboratorio de farmacología. El objetivo del estudio es: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________. Se me a explicado que mi participación consistirá en: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________. Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios derivados de mi participación en el estudio, que son los siguientes: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________. El investigador(es) se ha(n) comprometido a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que le plantee acerca de los procedimientos que se me llevaran a cabo, los riegos, beneficios o cualquier otro asunto relacionado con el experimento. Entiendo que conservo el derecho de retirarme del estudio en cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte mi perfil como estudiante del Laboratorio de Farmacología. Nombre y Firma del Voluntario: _____________________________________________________. Nombre y Firma del Investigador: ___________________________________________________. Testigos: ___________________________________ y __________________________________. Manual del Laboratorio de Farmacología Q. Hermelinda de la Cruz Durán Enero 2007