TP 6 - Departamento de Biología Molecular

Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico Nro. 6: PROTEINAS
Objetivos:
 Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la
estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test
estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales.
 Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método
de Bradford
Introducción:
Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por aminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas
están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia
determinada, propia de cada proteína (estructura primaria).
Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza
anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones,
los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras
que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.
El trabajo práctico contará de dos partes:
1.- Reacciones de precipitación y reconocimientos de proteínas.
2.- Cuantificación proteínas según el método de Bradford.
1.- REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS.
Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de
carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos
grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente
(dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto,
interacción proteína-proteína, proteína-H2O, proteína-ión.
Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es
pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la
proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente
la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la
solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).
1
Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a
una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína- H2O porque le quita la
capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la
precipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual
para cualquier proteina, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y
purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.
Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran
solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de
agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las
proteínas.


Efecto del calor: el calentamiento de las proteínas en soluciones neutras produce
alteraciones en sus propiedades, tales como disminución de la solubilidad, pérdida de la
actividad específica, pérdida de sus características de cristalización. Conjunto de
alteraciones que se las conoce como desnaturalización.

Formación de sales:
Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de
metales pesados, por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína.
Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2.
Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la
adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA), perclórico, clorhídrico, los
cuales forman con las proteínas sales insolubles.
PARTE PRÁCTICA:
A) Reactivos:
Solución de TCA al 5% (v/v en H2O)
Solución saturada de (NH4)2SO4 (o la sal)
Solución de HgCl2 (1% p/v en H2O)
B) Técnica:
1.- En una serie de 8 tubos de ensayo, colocar 1.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual
volumen de H2O en los restantes.
2.- Efecto de sales: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar el
mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. Mezclar bien y colocar en baño
de hielo. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O. Cómo explica lo
ocurrido?
3.- Efecto del calor: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, calentar
CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. Observar y registrar el resultado. Luego
agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.
4.- Efecto de metales pesados: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O,
agregar gota a gota solución de HgCl2 1%. Observar y registrar el resultado. Luego
agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.
2
5.- Efecto de ácidos: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota
a gota solución de ácido TCA al 5%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5
ml de H2O y observar lo que ocurre.
2.- CUANTIFICACIÓN PROTEÍNAS SEGÚN EL MÉTODO DE BRADFORD.
La cuantificación de proteínas de manera exacta, confiable y reproducible es una de
las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioquímico. Esto se debe
a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de
proteínas presentes en la muestra analizada.
Se han desarrollado varios métodos espectroscópicos para la cuantificación de
proteínas. Todos ellos se mantienen vigentes, y se usan de acuerdo a la necesidad del
experimentador.
El más simple de estos métodos es la medición de la absorbancia intrínseca de una
proteína en solución en la región UV (280 nm). Esta técnica se basa en la absorción
intrínseca de los residuos aromáticos que forman parte de la proteína y por ello para
cada proteína se debe conocer su coeficiente de extinción molar () ya que éste varía de
acuerdo a la composición de aminoácidos. Aunque este método es muy exacto y muy
simple, solo puede ser empleado para proteínas puras de () conocido, en soluciones
libres de sustancias interferentes en la absorción en UV, y se debe disponer de cubetas
de cuarzo.
Además existen 2 métodos basados en la formación de complejos con cobre: i)
método de Lowry y ii) método de Ácido Bicinconínico. Ambos métodos se basan en la
reducción del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas. Esto los hace métodos bastante
precisos pero requieren de la preparación de varios reactivos que deben ser
cuidadosamente mezclados durante el ensayo, incubaciones muy precisas a
temperaturas elevadas, y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables.
Ambos ensayos además presentan interferencias con diversas sustancias que suelen
estar presentes en muestras biológicas como lípidos, buffers, agentes reductores y
detergentes. Esto conlleva a la preparación de numerosos blancos de reacción para
descartar dichas interferencias.
Por último, el método de Bradford es el más empleado para la determinación de
proteínas en una muestra compleja. Este ensayo se basa en el corrimiento del máximo
de absorción del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando
esta unido a proteínas. Bajo condiciones fuertemente ácidas, la forma estable del
colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. Mientras que al unirse a
proteínas la forma estable es la desprotonada, de color azul que absorbe a 595 nm. La
interacción proteína-colorante es estabilizada por interacciones iónicas y sobre todo por
interacciones hidrofóbicas. Por esto, la relación entre la aparición de color y
concentración de proteínas dependerá también de la composición aminoacídica de la
proteína en estudio. La desventaja que presenta es que la relación color/concentración
en lineal en un pequeño rango (1 – 25 g/mL).
Como se puede deducir, no existe un método ideal o de referencia, pero de los
métodos mencionados el más empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y
es el que se desarrollará en el TP.
3
A) Reactivos:
Solucion estándar de albúmina sérica bovina: Se utilizará una solución madre de
100 g/mL con la cual se realizará la curva de calibrado del método.

Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol, agregar
20 ml de Acido fosfórico y diluir a 200 ml con H2O. Filtrar y conservar a 4 C a
resguardo de la luz en frasco color caramelo.
B) Técnica:

Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales
indicadas en la tabla, y tendrá una solución problema a la cual determinar la
concentración a partir de la curva de calibrado construída.
1- Rotular 10 tubos eppendorf como B, T2, T4, T6, T8, T10, P1, P2, P3, P4. Los
datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente.
2- Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según se
indica en la tabla.
3- Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex.
4- Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente.
5- Leer absorbancia a 595 nm.
6- Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en
función de la concentración de los mismos.
7- Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la
curva elaborada anteriormente.
Tubo
B
T2 (2 g)
T4 (4 g)
T6 (6 g)
T8 (8 g)
T10 (10 g)
P1 (Problema)
P2 (Problema)
P3 (Problema)
P4 (Problema)
Standard BSA
0 L
20 L
40 L
60 L
80 L
100 L
0 L
0 L
0 L
0 L
H2O
100 L
80 L
60 L
40 L
20 L
0 L
90 L
90 L
90 L
90 L
Muestra
0 L
0 L
0 L
0 L
0 L
0 L
10 L
10 L
10 L
10 L
DO
DO corregida
4