Espectroscopía Luminiscente:

ESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE:
Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y
fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las moléculas de
analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra
información para el análisis cualitativo y cuantitativo.
Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes
moleculares.
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue
mediante la absorción de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los
dos fenómenos con el término más general de fotoluminiscencia.
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas
responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espín del electrón.
Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta cesando la
luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).
Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un cambio
en el espín del electrón, que hace que la radiación se mantenga durante un tiempo
fácilmente detectable, después de haber acabado la irradiación – a menudo varios
segundos después o más. En la mayoría de los casos, la emisión fotoluminiscente,
tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que
la radiación utilizada para su excitación.
Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad,
con límites de detección que suelen ser de uno a tres órdenes de magnitud inferiores a
los encontrados en la espectroscopia de absorción. Los límites de detección
características son del orden de partes por billón.
Debido a su alta sensibilidad, los métodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir
serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.
Por esta razón las medidas luminiscentes se suelen combinar con las extraordinarias
técnicas de cromatografía y electroforesis.
En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de absorción
en los analitos cuantitativos debido a que el número de especies que absorben
radiación ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan
fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del espectro.
Teoría de la Fluorescencia y de la Fosforescencia
La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos, tanto sencillos
como complejos.
El tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atómicos
diluidos. Por ejemplo:
Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado
3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de 5 896 a 5 890 Å.
Después de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo
radiación de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.
Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin
cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia
de resonancia.
Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia
Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una revisión del
spín del electrón y de los estados excitados singulete / triplete.
Espín del electrón
El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos
electrones con los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no
haya más de dos electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los estados
de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines están apareados.
Debido al apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas no presentan un
campo magnético neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no son
atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un
momento magnético y, consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un
campo magnético; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnéticos
Estados excitados singulete/triplete
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones están
apareados se llama singulete y cuando la molécula se expone a un campo magnético
no se produce un desdoblamiento de niveles de energía. Por otro lado, el estado
fundamental para un radical libre, es un estado doblete, porque el electrón impar
puede tomar dos orientaciones en un campo magnético, lo que comunica ligeras
diferencias de energía al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía
superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el
espín del electrón promocionado continua apareado con el electrón del estado
fundamental; sin embargo, en el estado triplete los espiones de los dos electrones se
han desapareado y, por tanto, están paralelos. Estos estados pueden representarse
como sigue, donde las flechas representan la dirección del espín.
Velocidades de absorción y de emisión
La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, el proceso requiere
del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisión fluorescente, tiene lugar a una
velocidad significativamente más lenta. El tiempo de vida del estado excitado se
relaciona
inversamente
con
la
absortividad
molar
del
pico
de
absorción
correspondiente al proceso de excitación. Por tanto, para absortividades molares
comprendidas entre 103 y 105, los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a
10-7 s. Para sistemas débilmente absorbentes, donde la probabilidad del proceso de
transición es más pequeña, los tiempos de vida pueden ser tan largos como de 10-6 a
10-5 s. Como se ha señalado, la velocidad promedio de una transición triplete a
singulete es menor que la correspondiente transición singulete a singulete. Por ello, la
emisión fosforescente requiere tiempos comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores.
Procesos de desactivación
Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una
combinación de varias etapas mecanísticas. Como muestran las flechas verticales
rectas de la Figura, dos de estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, conllevan la
emisión de un fotón de radiación. Las otras etapas de desactivación, indicadas por
flechas onduladas, son procesos no radiantes. El camino más propicio hacia el estado
fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si
la desactivación por fluorescencia es más rápida que los procesos no radiantes, se
observa tal emisión.
Por otro lado, si la desactivación no radiante tiene una constante de velocidad más
favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa
La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas
que incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad
de los procesos de relajación desactivación no radiantes se ralenticen hasta el punto
en el que la reacción de emisión puede competir cinéticamente con ellos. La
información referente a los procesos de emisión es suficientemente completa para
permitir un cálculo cuantitativo de estas velocidades. Sin embargo, la comprensión de
los otros caminos de desactivación es, en el mejor de los casos, rudimentaria; para
estos procesos, sólo se pueden realizar afirmaciones o especulaciones cualitativas
sobre las velocidades y los mecanismos.
Fosforescencia
La desactivación del estado electrónico excitado también puede incluir la
fosforescencia. Después del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la
desactivación posterior puede tener lugar por conversión interna o externa o por
fosforescencia.
Una transición triplete  singulete es mucho menos probable que una conversión
singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio de un estado triplete
excitado respecto a la emisión oscila entre 10-4 y 10 s o más. Por tanto, la emisión
causada por una transición de este tipo puede persistir durante algún tiempo después
que la irradiación se haya interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con la fosforescencia
que este tipo de emisión se observa normalmente sólo a bajas temperaturas, en
medios altamente viscosos o por moléculas que están adsorbidas sobre superficies
sólidas.
Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que una
sustancia sea o no luminiscente; estos factores también determinan la intensidad de
emisión cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.
Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia de fosforescencia es
simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia
respecto al número total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente
fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas
condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies químicas que no presentan una
fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
Tipos de transiciones en fluorescencia
Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorción
de radiación ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que tal radiación es
suficientemente energética como para producir la desactivación de los estados
excitados por predisociación o disociación. Por ejemplo, una radiación de 200 nm
corresponde a aproximadamente 140 kcal/mol; la mayoría de las moléculas tienen al
menos algún enlace que se puede romper con energías de esta magnitud.
Como consecuencia, rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones * ,
en cambio, este tipo de emisión está asociada a los procesos menos energéticos *
 y * n.
Fluorescencia y estructura
La fluorescencia más intensa y la más útiles la que presentan los compuestos que
contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones  * de baja energía. Los
compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o
estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también pueden presentar
fluorescencia, pero el número de estos compuestos es pequeño comparado con el
número de sistemas aromáticos.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en
disolución, la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con
su grado de condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el
tiofeno y el pirrol,
no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con éstas
normalmente sí la presentan. En los heterociclos con nitrógeno, se cree que la
transición electrónica de más baja energía implica a un sistema n * que
rápidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
Sin embargo, la condensación de anillos bencénicos para dar núcleos heterocíclicos,
da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorción. En estas
estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es más corto, así, se observa
fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.
Efectos de la temperatura y del disolvente
La eficacia cuántica de fluorescencia disminuye en la mayoría de las moléculas al
aumentar la temperatura, ya que al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la
temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivación por conversión
externa. Una disminución en la viscosidad del disolvente también aumenta la
probabilidad de la conversión externa y conduce al mismo resultado.
La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia de disolventes que
contienen átomos pesados o de solutos con dichos átomos en su estructura; como por
ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo. El efecto es similar al
observado cuando se introducen, por sustitución, átomos pesados en compuestos
fluorescentes; las interacciones espín-orbital desembocan en un aumento en la
velocidad de formación del triplete y en la correspondiente disminución de la
fluorescencia.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a los
disolventes compuestos que contienen átomos pesados
Efecto del oxígeno disuelto
La presencia de oxígeno disuelto suele reducirla intensidad de fluorescencia de una
disolución. Este efecto puede ser el resultado de una oxidación de las especies
fluorescentes inducida fotoquímicamente.
Sin embargo, con más frecuencia la amortiguación (quenehing) tiene lugar como
consecuencia de las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular, que
favorecen el cruce entre sistemas y la conversión de las moléculas excitadas al estado
triplete. Otras especies paramagnéticas también tienden a amortiguar la fluorescencia.
Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia
La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz
de excitación absorbido por el sistema. Esto es,
F = K'(Po- P)
Donde Po es la potencia del haz que incide sobre la disolución y P es su potencia
después de atravesar una longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia
cuántica del proceso de fluorescencia.
Con el objeto de relacionar F con la concentración de la especie fluorescente, se
escribe la ley de Beer de la forma
INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA
FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia
son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros
ultravioleta/visible. La siguiente gráfica muestra una configuración característica de
estos componentes en los fluorómetros y los espectrofluorímetros. Casi todos los
instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz tal como se muestra, para
compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.
Filtro o
Monocromador
Radiación dispersada
de excitación
Muestra
Fuente
Filtro o
Atenuador
del haz
Monocromador
Fotomultiplicador
de referencia
Fotomultiplicador
de la muestra
de emisión
Amplificador
diferencial
Dispositivo de lectura
El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de
excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia pero excluye o
limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente.
La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más
conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros
ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas
aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La
radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo
filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida.
El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a
aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se reduce
en un factor de 100 o más. Las señales procedentes del fotomultiplicador de la
muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se
visualiza en un medidor o en un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son
de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores ópticos o eléctricos. Los
instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor analógico o un sistema de
adquisición de datos digital seguido de tratamiento de los datos para obtener la
relación entre la intensidad de la emisión fluorescente y la intensidad de la fuente de
radiación.
Espectrometría de luminiscencia molecular
Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros
Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren sólo en
detalles de los que componen los fotómetros y los espectrofotómetros; sólo es
necesario considerar estas diferencias.
Fuentes
En la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensa que las lámparas
de wolframio o hidrógeno utilizadas en las medidas de absorción.
De hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es
directamente proporcional a la potencia de la fuente Po
Lámparas.
La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de
mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida. Esta fuente emite
líneas útiles para producir la excitación previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546,
578, 691 y 773 nm. Las líneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia
o absorción adecuados. Ya que, en la mayoría de los compuestos fluorescentes, la
fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes de onda, al menos una de las
líneas del mercurio suele resultar adecuada.
Láseres.
Desde los comienzos de los años setenta, se utilizan también diversos tipos de láseres
como fuentes de excitación para medidas de fotoluminiscencia.
Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como
sistema de bombeo, un láser de nitrógeno pulsante o un láser de Nd:YAG.
La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas)
como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las
fuentes de láser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1)
cuando las muestras son muy pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y
en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2)
en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales
hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza
colimada de los haces de láseres vital: o (3) cuando se requiere una radiación de
excitación altamente monocromática para minimizar los efecto de las interferencias
fluorescentes.
Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los
fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la
radiación fluorescente resultante, mayoría de los espectrofluorímetros están equipados
con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.
Detectores
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se
necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los
detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar
en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relación señal/ruido. También
se utiliza, a veces, la refrigeración de los detectores para mejorar la relación
señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros, los detectores
de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el
registro rápido de los espectros de excitación y de emisión y particularmente son útiles
en cromatografía y en electroforesis
Cubetas y compartimentos para las cubetas
Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como
rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño
del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación dispersada que
llega hasta el detector. Con este propósito, a menudo se introducen deflectores en el
compartimento incluso más importante que en las medidas de absorbancia, es evitar
dejar las huellas dactilares en las cubetas y, a que la grasa de la piel con frecuencia
fluórese.
Diseños de instrumentos
Fluorómetros
Los fluorómetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de
llevar a cabo análisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha señalado para
seleccionar las longitudes de onda de la radiación de excitación y de emisión se
utilizan filtros de interferencia y de absorción. Generalmente, los fluorómetros son
compactos, robustos y fáciles de usar.
La Figura muestra un esquema de un fluorómetro de filtros característico que consta
de una lámpara de mercurio para la excitación de la fluorescencia y un par de tubos
fotomultiplicadores como detectores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de
ella en un haz de referencia y en un haz de muestra. El haz de referencia se atenúa
mediante el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma
que la intensidad de fluorescencia. Ambos haces pasan a través del filtro primario y a
continuación el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de
referencia.
El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la
emisión de fluorescencia. La radiación emitida pasa a través de un segundo filtro que
posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Las señales de
salidas eléctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analógico, para
obtener la relación entre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve
como parámetro analítico.
Espectrofluorímetros
Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluorímetros capaces de obtener
los espectros de excitación y los de emisión. En la Figura se muestra el diseño óptico
de uno de ellos, que utiliza dos monocromadores de red. La radiación que procede del
primer monocromador se divide en dos, una parte se dirige hacia el fotomultiplicador
de referencia y la otra hacia la muestra. La radiación fluorescente resultante, después
de ser dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo
fotomultiplicador.
Un instrumento como el que se muestra en la Figura suministra perfectamente
espectros satisfactorios para el análisis cuantitativo. Sin embargo, los espectros de
emisión obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos,
ya que la señal de salida depende no sólo de la intensidad de fluorescencia sino
también de las características de la lámpara, del detector y de los monocromadores.
Todas estas características instrumentales varían con la longitud de onda y difieren de
un instrumento a otro. Se han desarrollado varios métodos para obtener el espectro
corregido, que es el verdadero espectro de fluorescencia, libre de efectos
instrumentales; muchos de los instrumentos comerciales modernos y más sofisticados
están preparados para obtener directamente los espectros corregidos.
FosforÍmetros
Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseños
similares a los fluorómetros y a los espectrofluorímetros antes considerados, sólo
difieren en que requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo
que irradia alternativamente la muestra y, después de un retraso en el tiempo
adecuado, mide la intensidad de fosforescencia. El retraso en el tiempo es necesario
para diferenciar la emisión fosforescente de larga vida de la emisión fluorescente de
corta vida que podrían originarse en la misma muestra. Se utilizan dispositivos
mecánicos y electrónicos y muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen
accesorios para medidas de fosforescencia. Un ejemplo de un tipo de dispositivo
mecánico se muestra en la Figura.
APLICACIONES Y MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES
Es inherente a los métodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a
intervalos de concentración más bajos que las medidas espectrofotométricas de
absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles de las que
puedan disponer los científicos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el
parámetro relacionado con la concentración en fluorimetría y en fosforimetría F se
puede medir independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una
medida de absorbancia requiere la evaluación de Po y de P, ya que la absorbancia,
que es proporcional a la concentración, depende de la relación entre estas dos
cantidades. La sensibilidad de un método fluorimétrico puede mejorarse aumentando
Po o mediante la amplificación adicional de la señal de fluorescencia. Por el contrario,
en espectrofotometría, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P y,
por ello, no afecta a la A. Por tanto, los métodos fluorimétricos tienen, generalmente,
sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitud superiores a los
correspondientes de absorción. Por otro lado, la precisión y la exactitud de los
métodos fotoluminiscentes son habitualmente
más pobres que las de los
procedimientos espectrofotométricos en un factor entre, quizás, dos y cinco.
Generalmente,
los
métodos
fosforescentes
son
menos
precisos
que
sus
correspondientes métodos fluorescentes.
Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas
Los métodos inorgánicos fluorimétricos son de dos tipos. Los métodos directos que
conllevan la formación de un quelato fluorescente y la medida de su emisión. Un
segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la
acción amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.
La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.
Reactivos fluorimétricos
Los reactivos fluorimétricos de más éxito en el análisis de cationes son los que
presentan estructuras aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que
permitan la formación de quelatos con el ion metálico. A continuación se muestran
Determinación fluorimétrica de especies orgánicas
El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y
bioquímicas es impresionante.
Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los métodos para la determinación de
más de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de compuestos orgánicos,
enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y
vitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones más importantes de la fluorimetría se
encuentran en el campo del análisis de productos alimentarios, farmacéuticos,
muestras clínicas y productos naturales. La sensibilidad y la selectividad del método
hacen que sea una herramienta particularmente valiosa en estos campos.
Métodos fosforimétricos
Los métodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser complementarios, ya que los
compuestos fuertemente fluorescentes presentan una débil fosforescencia y viceversa.
Por ejemplo, entre los hidrocarburos aromáticos con anillos condensados, aquellos
que contienen átomos pesados como halógeno s o azufre, con frecuencia presentan
una fuerte fosforescencia; por otro lado, los mismos compuestos sin la presencia del
átomo pesado tienden a presentar fluorescencia en lugar de fosforescencia.
La fosforimetría se ha utilizado para determinar una gran variedad de especies
orgánicas y bioquímicas que incluyen sustancias como ácidos nucleicos, aminoácidos,
pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petróleo y pesticidas. Sin embargo, el
método no ha alcanzado el uso tan difundido de la fluorimetría, quizás debido a la
necesidad de bajas temperaturas y a la, generalmente, peor precisión de las medidas
fosforescentes. Por otro lado, es atractiva la mayor selectividad potencial de los
procedimientos de fosforescencia. La razón de estas diferencias de comportamiento
se debe a que la fosforescencia eficaz necesita el cruce entre sistemas rápido para
poblar el estado triplete excitado, que, vuelve a reducir la concentración de moléculas
en el singulete excitado y, por tanto, aumenta la intensidad de fosforescencia.
BIBLIOGRAFÍA
-
Principio de Análisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN
Quinta Edición. Mc Graw Hill.
-
Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.