seminario 7

Bioquímica II. 2007
SEMINARIO 7 : METABOLISMO DEL NITRÓGENO
Temario
Metabolismo de compuestos nitrogenados. Ciclo del nitrógeno en la naturaleza. Fijación biológica, libre y simbiótica,
asimilación de nitrato. Mecanismos involucrados, productos que se obtienen, controles y regulación. Incorporación
del amonio en biomoléculas. Destinos metabólicos del grupo amino. Excreción del nitrógeno, ciclo de la urea.
Caminos metabólicos de los aminoácidos. Aminoácidos esenciales. Biosíntesis y degradación, regulación.
Transaminación y su utilización como marcadores clínicos. Aminoácidos esenciales y defectos metabólicos. Otros
derivados aminoacídicos: el glutation, síntesis y rol biológico. Inhibidores.
Nucleótidos, síntesis de novo y por rescate. Controles y regulación. Ejemplos de defectos metabólicos (“gota”).
Utilización de inhibidores en la quimioterapia.
Inhibidores. Flavin-nucleótidos, nicotin-nucleótidos y CoA.
Objetivo: este módulo está dirigido a proveer información crítica sobre la diversidad de vías metabólicas para la
incorporación del nitrógeno en la biosfera; las particularidades de la incorporación de nitrógeno en los reinos animal
y vegetal y en sistemas eucariotas y procariotas. Se hará hincapié en el metabolismo nitrogenado en humanos y el
efecto de la deficiencia de algunas etapas de esas vías metabólicas. En el caso del metabolismo de bases
nitrogenadas se discutirán las características de vías de síntesis de novo y las conservativas de salvataje. Si bien el
N2 es abundante en la atmósfera es costosa su incorporación en compuestos asimilables por organismos vivos, en
este sentido como veremos, los organismos poseen mecanismos para conservarlo. Sin embargo, en muchos
organismos el amonio es tóxico y su exceso debe ser eliminado. El ciclo de la urea constituye un proceso por el cual
algunos organismos eliminan dicho exceso.
Clase I: ciclo del nitrógeno en la naturaleza. Distintos mecanismos de incorporación de nitrógeno a los seres
vivientes. Fijación biológica de nitrogeno: nitrogenasa, funcionamiento y distribución. Incorporación de nitrógeno en
microorganismos. Regulación de la glutamina sintetasa. Regulación en vegetales. Mecanismos de incorporación de
nitrógeno en animales y distribución en el organismo.. Esquema general de metabolismo de aminoácidos. Caminos
metabólicos de los aminoácidos. Aminoácidos esenciales y defectos metabólicos.
Clase II: Interconversión de metabolitos nitrogenados. Transaminación y su utilización como marcadores clínicos.
Toxicidad del amonio en SNC. Mecanismos de control de los niveles de amonio en circulación Excreción del
nitrógeno: estrategias empleadas por distintos organismos: amonotélicos, urotélicos y uricotélicos. Ciclo de la urea.
Otros derivados aminoacídicos: glutation, neurotrasmisores, poliaminas, NO. Síntesis y rol biológico. Metabolismo
de bases nitrogenadas y nucleótidos. Rutas de síntesis de novo y por rescate. Controles y regulación. Blancos
terapéuticos: inmunosupresores y quimioterápeuticos. Ejemplos de defectos metabólicos (“gota”).
Preguntas guia
Clase I
1- Ciclo del nitrógeno
Describa el ciclo del nitrógeno en la naturaleza. Mencione ejemplos de organismos que cumplan los distintos
procesos de transformación del nitrógeno entre sus diferentes estados.
Incorporación de nitrógeno en distintos organismos. Reacciones de incorporación de nitrógeno a compuestos
orgánicos. Rol de la glutamina sintetasa y de la nitrogenasa
2- Fijación de nitrógeno.
Realice un análisis comparativo del costo energético y las condiciones de reacción necesarios para reducir el N2
atmosférico mediante el proceso de Haber y la fijación biológica a través de la nitrogenasa. Cuáles son las
condiciones fisicoquímicas del medio en las que este proceso ocurre?
Como funcionan los sistemas simbióticos de fijación de nitrógeno? Cuál de los simbiontes sintetiza la nitrogenasa?
Cuál es localización celular de la nitrogenasa? Qué mecanismo se utiliza para disminuir la presión de oxígeno?. Bajo
qué forma el N2 que ha sido reducido es transportado y utilizado por la planta?
3-Visión global del metabolismo de los aminoácidos
Realice un diagrama donde se muestre el flujo del carbono hacia los distintos aminoácidos desde sus precursores
biosintéticos. Prepare un diagrama análogo donde se muestre el flujo de nitrógeno desde amonio hasta los 20
aminoácidos (Asuma que el organismo contiene una glutamato deshidrogenasa dependiente de NADPH y que se
desarrolla en un medio con exceso de iones amonio. Recuerde tambien, que algunos nitrogenos son eliminados
durante la biosíntesis de aminoácidos).
Compare las “familias de aminoácidos” para los procesos de oxidación y biosíntesis.
Cuál es la localización celular de las rutas de oxidación y biosíntesis de aminoácidos en animales y plantas?.
Qué significa que un aminoácido es cetogénico o glucogénico? Si se inyecta a una rata un aminoácido cetogénico
marcado radiactivamente en el esqueleto carbonado, al cabo de un tiempo, el glucógeno hepático poseerá marca?
Bajo qué circunstancias los animales utilizan los aminoácidos como fuente de energía?
La primera etapa en el catabolismo de los aminoácidos es “separar” el grupo amino del resto del esqueleto
carbonado. Qué tipo de enzima se utiliza?. En el caso de los aminoácidos incorporados por la dieta, en qué organo
se realiza esa reacción?.
El herbicida Round up (glifosato) se utiliza en agricultura para inhibir el crecimiento de malezas mediante la
inhibición de la síntesis de aminoácidos aromáticos. Sin embargo las liebres y animales de pastoreo no resultan
afectadas. Podría explicar por qué?
Clase II
1- ¿Cual es la función del ciclo de la urea en los mamíferos? Desarrolle con fórmulas químicas los distintos pasos
del ciclo de la urea mencionando la localización intracelular de las distintas etapas. Formule la ecuación global del
mismo.
c) A diferencia de los mamíferos, las aves eliminan el nitrógeno de su organismo en la forma de ácido úrico. Que
ventaja le confiere esta forma de eliminación?
d) Si se alimenta un ave con ácidos grasos marcados con 14C, aparecería marca en el ácido úrico?
2- Compare el rendimiento neto en ATP (moles de ATP por mol de sustrato) para la oxidación completa de lactato
versus alanina incluyendo el costo de la excresión del N como urea.
3- Si bien el glutatión no es el resultado de un producto génico qué información se requiere para su síntesis? y cuál
sería el efecto de una deficiencia en la síntesis en el caso de células expuestas a una alta concentración de
peróxidos/ superóxidos (stress oxidativo).
4- En la biosíntesis de purinas y pirimidinas NO se sintetizan las bases libres y luego se unen a la ribosa. Sin
embargo como vió en la pregunta anterior si a la célula se la provee de la base libre SI se incorpora al nucleótido.
Cómo explica esto?. Qué enzima está involucrada en este proceso?
5- La biosíntesis de novo de dTTP es más compleja que la de los otros dNTPs.
a. Cuáles son las particularidades de esta vía?
b. Algunos inhibidores de esta vía han sido usados como drogas anticancerosas. ¿Podría predecir si un inhibidor de
la timidin quinasa podría funcionar efectivamente en una terapia anticancer? ¿Podría lo mismo ser verdad para un
inhibidor de la deoxicitidin quinasa?
c. El alopurinol administrado conjuntamente con la 6-mercapto purina, bajo ciertas condiciones, potencia la
efectividad como droga anticancerígena de la última. ¿Podría el sitio de acción conocido para el alopurinol, explicar
esto?
Problemas:
Clase I
1- Considere el metabolismo de una célula eucariota:
a) Escriba la reacción catalizada por la glutamina sintetasa. Indique cuál es la función de esta reacción en el
metabolismo.
b) La regulación de esta enzima ha sido ampliamente estudiada en algunos organismos. Se sabe que:
i) Es modulada alostéricamente por 8 compuestos: carbamil-P; glucosamina-6-P; Trp; Ala; Glu; His; CTP y AMP.
Todos ellos ejercen una modulación del mismo signo. A su juicio ¿serán moduladores positivos o negativos?. El
efecto de cada uno de ellos sobre la actividad de la enzima ¿será total o parcial? (en otras palabras, habrá
cooperatividad en el efecto de los ocho moduladores?). Justifique su respuesta.
ii) Es modulada covalentemente por adenililación de una Tyr específica. Esquematice el mecanismo de regulación.
En base a ese esquema ¿cuál supone es la forma activa de la enzima, la forma glutamino-sintetasa o la forma
glutamino-sintetasa (12 AMP)? Explique porqué arriba a esa conclusión.
2- Los picaflores tienen una de las frecuencias cardíacas más elevadas del reino animal, manteniendo casi
exclusivamente un metabolismo aeróbico para la producción de energía. La alimentación principal de los picaflores
consiste en néctar, que es rico en sacarosa pero pobre en nitrógeno. Se supone que obtienen el nitrógeno necesario
para vivir de la ingestión de insectos. Para calcular los requerimientos mínimos de nitrógeno que necesita la especie
Sephanoides sephanoides, se sometieron distintos ejemplares a la dieta que se detalla en la tabla, siendo los
hidratos de carbono aportados en forma de sacarosa y el nitrógeno como aminoácidos, siendo el agua ofrecida ad
libitum.
Tabla I: composición de la dieta y sobrevida
Figura 1: Evolución del peso de los animales
De acuerdo a la evolución de la masa corporal observada en los distintos grupos, cuales son los requerimientos
mínimos de nitrógeno necesarios en esta especie? Cual es la explicación del descenso de peso observado con la
dieta N0?
Por qué si el animal no se encuentra en etapa de desarrollo, debe mantener una ingesta mínima de nitrógeno
diaria?
3- El siguiente es el esquema de la ruta de biosíntesis de dos aminoácidos (K y G) en E. coli:
Se obtuvieron distintos tipos de mutantes de E. coli que presentan auxotrofía, simple o doble, para K y G. Los
mutantes clase 1, acumulan en su medio de cultivo metabolitos que permiten el crecimiento en medios mínimos de
los mutantes de clase 2. Los mutantes de clase 3 acumulan metabolitos que permiten el crecimiento, en las mismas
condiciones, a mutantes de clase 4. Considerando que los mutantes de clase 2 presentan una deficiencia en la
enzima E3 mientras que los mutantes de clase 4 son
auxótrofos para K, solamente, indique:
a). i) ¿Qué enzima es deficiente en los mutantes de clase 1 y 3?
ii) ¿Que productos se acumulan en dichos mutantes?
iii) ¿Cómo explica el hecho, que una mutación única provoque auxotrofía para dos aminoácidos?
b) Indique:
i) La fórmula química de J y F y la reacción química en la que ambos se transforman en el producto final, si K y G
son, respectivamente, Isoleucina y Valina, y E5 es una transaminasa.
ii) El mecanismo de dicha actividad enzimática y el cofactor asociado.
c) i) Que tipo de regulación debería tener esta ruta biosintética.
ii) Como podría la célula seguir sintetizando K cuando está en presencia de un exceso de G, únicamente.
d) dibuje el resto de la ruta biosintética de los aminoácidos Isoleucina y Valina e identifique a los precursores A, B y
C.
Clase 2:
1- Un bebé de seis meses de edad exhibió síntomas de pronunciada hiperamonemia que incluía vómitos, fiebre,
irritabilidad y episodios de llantos intercalados con períodos de letargo. El infante tenía bajos niveles de uremia,
transaminas sérica elevada e hiperaminoacidemiaaminoaciduria generalizada.
Los niveles de citrulina, ácido argininosuccínico y arginina fueron relativamente bajos tanto en sangre como en
orina. Los ensayos enzimáticos de tejido hepático establecieron que el nivel de carbamilfosfato sintetasa
mitocondrial (CPS) era aproximadamente un 20% de lo normal; esta enzima era activa sólo en presencia de
concentraciones relativamente altas de N-acetilglutamato. Los niveles de los demás enzimas del ciclo de la urea
eran relativamente normales.
El bebé fue tratado con un suplemento conteniendo arginina, piridoxina y análogos a-ceto de aminoácidos
esenciales. Como parte de la terapia se restringió la ingesta de proteínas.
a) ¿Por qué fueron altos los niveles de amonio en este niño?
b) Explique porque bebés con deficiencia de CPS normalmente muestran niveles bajos de citrulina,
argininosuccinato, arginina y urea.
c) ¿Por qué se recomienda la administración de arginina suplementaria?
d) ¿Por qué son administrados los análogos a-ceto de aminoácidos esenciales y piridoxina?
e) ¿Por qué se restringió la dieta de proteínas?
f) Cómo esperaría que se comportasen los niveles séricos de glutamato, glutamina y alanina en la sangre y orina de
este infante?
2- E.coli puede crecer en un medio conteniendo amonio como única fuente nitrógeno y también lo puede hacer en
un medio conteniendo un aminoácido cualquiera como fuente de nitrógeno. En este caso el crecimiento es más
lento, comparado con la incubación en presencia de amonio, porque es necesario que primeramente se degrade
dicho aminoácido para generar amonio intracelular.
a) Cuáles son las rutas seguidas en este último caso? Cuales son las dos reacciones secuenciales que permiten
la liberación de amonio a partir de cualquier aminoácido en bacterias?
b) Algunos experimentos parecerían sugerir la existencia de rutas alternativas, además de las mencionadas en el
inciso anterior, para producir amonio intracelular a partir de ciertos aminoácidos. Con el objeto de estudiar una
nueva ruta degradativa para el aspartato, se crecieron dos cepas de E. coli en un medio conteniendo aspartato
como fuente de nitrógeno y glucosa como fuente de carbono. Las cepas empleadas fueron: E. coli salvaje argG+ y
un auxótrofo de E. coli argG_ , el cual carece de la enzima que sintetiza argininosuccinato. Durante el crecimiento
exponencial ambos cultivos se centrífugan y se resuspenden en el mismo medio pero conteniendo 15N aspartato
en lugar de aspartato frío. A tiempos cortos luego del pulso de 15N aspartato se analizan los metabolitos marcados
mediante NMR , cromatografía en fase reversa y espectrometría de masa.
Los gráficos siguientes muestran la variación de las concentraciones de los principales metabolitos marcados con
15N a lo largo del tiempo para E. coli argG- y E. coli salvaje, argG+.
E. coli argGaspartato
glutamato
glutamato
N]
aspartato
citrulina
arginina
amonio
tiempo
[metabolitos marcados con
[metabolitos marcados con
15
15
N]
E. coli salvaje (argG+)
citrulina
arginina
amonio
tiempo
Porqué se emplearon auxótrofos argG- en este experimento. Justifique su respuesta mediante las ecuaciones,
enzimas y las fórmulas correspondientes.
Interprete en la forma más completa posible los datos mostrados en ambas figuras. Explique además si los
mismos demuestran la existencia de una nueva ruta degradativa para el aspartato. ¿Qué paso metabólico no
descripto hasta el momento integraría la nueva ruta? Proponga la correspondiente reacción. Ud debe tener en
cuenta en su análisis que para la arginina la única ruta catabólica que se conocía en E. Coli es:
3- Teniendo en cuenta la biosíntesis de novo de las purinas y los ciclos alternativos que se requieren para regenerar
los cosustratos utilizados:
a) Escriba con fórmulas la primer reacción de la síntesis de novo de los nucleótidos purínicos
b) Escriba con fórmulas, enzimas, cosustratos y cofactores, las etapas de síntesis de ATP y GTP a partir de
IMP
c) Indique el balance energético de ambas ramas
d) Sugiera un sistema de regulación para estas rutas metabólicas
4- No todos los miembros del orden Carnívoro son carnívoros. Algunos son omnívoros, y unos pocos, como los
pandas gigantes (Ailuropoda melanoleuca) son exclusivamente herbívoros. Cuando se estudia el metabolismo de
los carnívoros se encuentra un número importante de adaptaciones a la dieta. En el caso del incremento del
consumo de plantas una de las modificaciones más comunes es el direccionamiento a distintas organelas de la
enzima alanina-glioxilato amino transferasa, que es mitocondrial en carnivoros, peroxisomal en herbivoros y tanto
mitocondrial como peroxisomal en omnivoros..
a- Escriba la reacción catalizada por esta enzima.
b- Discuta el rol de esta enzima en el metabolismo de aminoacidos