pH óptimo de proteasa obtenida del cardo (Cynara cardunculus L

pH óptimo de proteasa obtenida del cardo (Cynara cardunculus L.) aplicable
en la tecnología quesera.
Optimun pH for protease obtained from cardo (Cynara cardunculus L.)
applicable in the cheese technology.
Hernández González María1, Hernández Centeno Francisco1, Tonche Luna
Luis Armando1, Iliná Anna2, Rebolloso Padilla Oscar Noé1, Ruelas Chacón Xóchitl1
Resumen
La presente investigación está dirigida hacia la resolución de la
problemática que representa el desabasto de animales a partir de los cuales se
obtienen enzimas coagulantes aplicables en la obtención del queso. En las flores
del Cardo (C. cardunculus L.) se ha encontrado una alternativa viable hacia la
generación de un sucedáneo del cuajo animal por desarrollar su actividad
proteolítica en condiciones equivalentes a la de la renina del cuajo. De las flores
de esta planta se obtuvo un complejo enzimático cuya caracterización dilucidó una
afinidad aceptable por el sustrato, ajustándose al comportamiento michaeliano, al
igual que la renina. Los rendimientos en la práctica, fueron similares para ambas
enzimas (10%).
Palabras clave: Cardo, enzimas, coagulante, rennet, queso.
Abstract
This research is oriented to solve the problematic shown with the lack of
animals which may be used as a source of coagulant enzymes. Cardo (C.
cardunculus L.) flowers usage is being presented as a good alternative to have an
animal rennet substitute, since its proteolitic activity is developed in similar
conditions to the animal rennet. An enzymatic complex was obtained form cardo
flowers which characterization showed an acceptable affinity for the substrate,
having a michaelian behavior as rennet. Analyzing the practical area both
processes offered similar yields (10%).
Key words: Cardo, enzyme, coagulant, rennet, cheese.
Introducción
El descubrimiento de la elaboración del queso, según varias fuentes, ocurrió
como un mero hecho fortuito, cuya fecha es incierta aunque muy antigua. “El
hombre ha venido utilizando desde hace siglos coagulantes tanto de origen
vegetal como animal [...]. Sin embargo, los primeros queseros no empleaban más
coagulante que el cuajo extraído del estómago de los mamíferos”. (Scott, 1991). El
conocimiento empírico así obtenido se ha heredado a través del tiempo; pero ha
sido hasta tiempos recientes que se ha dilucidado la naturaleza de dicho proceso,
lo cual ha favorecido la obtención, mediante diversas fuentes, de agentes
coagulantes que actúan sobre las principales proteínas de la leche: las caseínas.
320
___________________________________________________
1
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, 2 Universidad Autónoma de Coahuila
Durante mucho tiempo ha sido empleado el cuajo animal, pero a últimas
fechas se ha visto afectada la disponibilidad del mismo debido a la escasez de
animales a partir de los cuales se obtiene. Buscando una solución a esa
problemática, se ha echado mano de la biotecnología y la bioingeniería con cuyas
herramientas se ha logrado obtener enzimas de origen microbiano y fúngico
idénticas a las producidas en los estómagos de los mamíferos.
Como muchas enzimas coagulantes, la proteasa del Cardo (C. cardunculus
L) inicia la coagulación de la leche por fractura del enlace Phe105-Met106 de la
Como la conformación de las proteínas depende, en
parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la
más adecuada para la actividad catalítica (González, 2005). El coagulante
obtenido de las flores de cardo (C. cardunculus L) ha sido usado de forma
empírica en algunas regiones del bajío Mexicano, sin que se hayan establecido
condiciones óptimas de uso de este coagulante vegetal (Hernández, 2004).
El objetivo del presente es obtener, caracterizar y determinar la actividad de
la proteasa de las flores del cardo (C. cardunculus L) en función al pH, para el
establecimiento de condiciones óptimas en la tecnología quesera.
Metodología experimental
El material biológico se recolectó de manera manual, y se separaron las
diversas partes de la planta a estudiar: raíz, tallo, hojas y flores. La recolección se
llevó a cabo en las inmediaciones del “rancho Celaya”, del del poblado de
“Obrajuelo”, Guanajuato.
Por ser el cardo (C. cardunculus L.) una planta de ciclo anual, las muestras
de flores, tallo y hojas se obtuvieron en cantidad suficiente para el desarrollo del
estudio. Todas las muestras se recolectaron frescas y se conservaron a –15° C., a
excepción de las flores, a temperatura ambiente y protegidas de la luz solar, para
su posterior procesamiento y análisis.
El conocimiento empírico muestra que la parte de la planta con actividad
proteolítica es la flor; sin embargo, para corroborar dicha afirmación, se realizaron
ensayos con las diferentes partes de la planta a fin de comprobar esta hipótesis.
A fin de conocer las condiciones de pH en las que se analizaría cada parte
de la planta, se procedió a realizar dichas determinaciones, mediante el uso de un
potenciómetro digita. Lo anterior para extraer el material bajo condiciones nativas,
y evitar que las alteraciones del mismo afectaran el proceso.
Las muestras se congelaron y descongelaron para romper las paredes
celulares de cada parte de la planta. Se maceraron 5 gramos cada muestra por
separado con 50 ml de solución búfer de fosfatos 0.1M al pH correspondiente,
preparada según especificaciones de Lynch, et al. (1987).
Una vez solubilizada en el búfer de fosfatos, las muestras se centrifugaron a
3, 500 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. Las condiciones anteriormente
descritas no son las óptimas, se recurrió a ellas por falta de equipo adecuado; se
321
recomienda trabajar en centrifuga refrigerada a 16,000 g durante 30 minutos, a 4º
C (NILO, 1997).
Con el objetivo de conocer la actividad proteolítica de cada una de las
partes de la planta, en un vidrio de reloj se colocó 1 ml de leche a 40° C y 1 ml de
extracto crudo resuspendido en búfer de fosfatos 0.1 M. Se realizó la observación
visual de la presencia o ausencia de coagulación en un tiempo de hasta 40
minutos. Con esta prueba se descartaron los extractos de hojas, tallo y raíz, por
presentar nula actividad proteolítica observable, y se conservó el extracto de las
flores, donde si se apreció actividad, por lo que se eligieron para la continuación
del estudio.
Se realizó una purificación parcial del extracto proteico de flores de cardo
(C. cardunculus L) por medio de precipitación con solución de sulfato de amonio
en 5 concentraciones (8.33%, 16.66%, 33.33%, 50%, 66.66% y 83.33%) utilizando
la misma metodología que para la obtención de los extractos crudos de las
distintas partes de la planta en estudio. Posteriormente se sometió a diálisis,
mediante membrana con tamaño de poro de 12 KDa por 36 horas, para eliminar el
exceso de sales y partículas extrañas menores a ese peso, y posteriormente se
realizó una segunda purificación por cromatografía de intercambio catiónico. Por
otro lado se realizó una determinación de la concentración de proteína en cada
uno de los dializados mediante el método Bradford. La evaluación cinética se
realizó en espectrofotómetro UV a 280 nm, según la metodología descrita por
Dujovich y Esquivel (1995) y la caracterización se realizó basándose en el arreglo
gráfico de Lineweaver-Burk para la ecuación de Michaelis-Menten.
La evaluación de la actividad y del pH óptimo se realizaron con seguimiento
cinético, utilizando la metodología descrita por los autores antes mencionados,
sólo que para este caso se utilizó la fracción dializada, y el pH se vario (5.0, 5.4,
5.7, 6.0, 6.3, 6.6).
En la evaluación práctica también se utilizó la fracción dializada, es decir,
parcialmente purificada, para tal efecto se siguió la actividad de la enzima en la
práctica utilizando como referencia la fuerza de cuajo.
En este ensayo se colocaron 100 l del extracto enzimático diluidos en 1 ml de
búfer frió al pH problema, se agitó y se agregó a 10 ml. de leche fresca a 40ºC.,
tomándose el tiempo de coagulación para cada una de las fracciones y
posteriormente se sustituyeron estos tiempos en la ecuación de fuerza de cuajo
(Veisseyre, 1972), que se muestra abajo, y se graficaron para observar el
comportamiento del extracto a diferente valor de pH, los cuales fueron analizados
estadísticamente con una prueba de diferencias entre medias.
Donde:
F: fuerza del cuajo.
t: tiempo (seg.).
C: los ml de leche utilizados.
2400: los segundos equivalentes a 40
minutos. y discusiones
Resultados
F = C X 2400
t
La precipitación de la proteína con solución saturada de sulfato de amonio
se utilizó bajo el argumento de los estudios realizados por Silva (2003), los cuales
322
demostraron que las fracciones precipitadas con sulfato de amonio tenían un
índice de actividad coagulante mayor que con otras substancias como la acetona,
por lo tanto, los resultados demostraron que la precipitación barata con el sulfato
de amonio se puede utilizar con éxito como método de la purificación en la
producción de este coagulante en forma estandardizada, ya que además
proporciona ventajas, como son: la fácil eliminación de la sal (por Diálisis) y el que
permiten el fraccionamiento selectivo de las proteínas en la muestra.
La decisión de elegir la flor para continuar con todo el estudio, una vez
determinado que es la que presenta una mayor actividad coagulante, se basó en
los resultados estadísticos de la prueba t de Student (p<0.05) para la
diferenciación de medias y el ANOVA. Estadística y gráficamente la flor es la que
presenta mayor actividad, siendo las fracciones precipitadas al 66.66% y 83.33%
con sulfato de amonio las mas altas existiendo diferencias significativas entre
ambas, a diferencia del tallo y hoja, donde todas las fracciones son
estadísticamente iguales y cuyos valores van muy por debajo de los obtenidos a
partir de la flor. Lo anterior se expresa en la figura 1.
0,4
0,35
0,3
Vo.LS Means
Flor
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
Tallo
Hoja
0
8,33
16,66
33,33
50
66,66
83,33
Fracción
Figura 1: Actividad de las diferentes partes de la planta flor, tallo y hoja a pH 6.3.
En cuanto a la caracterización, la proteasa de la flor de cardo, esta presentó
un comportamiento michaeliano, coincidiendo con los resultados obtenidos por
Faro (1991), al igual que la renina del cuajo animal, con parámetros cinéticos
Vmax= 1.68x10-2 UABS/min y Km=2.16x10-3 mM/ml (Fig. 2).
0,16
ABSORBANCIA
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tiempo (min.)
Fig.2. Cinética de formación de caseinomacropéptido en reacción enzimática sobre solución
de caseína al 2% a pH 6.3
En las cinéticas de actividad (en base a V0) para determinación del pH
óptimo de esta proteasa, las fracciones precipitadas en concentraciones de sulfato
323
.
VoLS Means
de amonio al 16.66 y 66.66% presentaron un pH óptimo de 6.6 y 6.3
respectivamente, lo que sugiere la existencia de un complejo enzimático, más que
de una sola enzima, pero la mejor fracción para usarse en leche fresca es la de
66.66%, por desarrollar mayor actividad a pH 6.3 y tener los mayores rendimientos
(Fig. 3), pues a pH 6.6 no existe diferencia significativa (p<0.05) entre la actividad
desarrollada por las fracciones precipitadas al 66.66 y 83.33%. La fracción de
16.66%, que presentó buena actividad cinética a pH 6.6, no tiene utilidad práctica
por su bajo rendimiento, y porque no mostró actividad en la evaluación práctica
(Fig. 3).
0,4
0,35
0,3
6,3
0,25
6,6
0,2
5,4
6
5,7
0,15
0,1
0,05
5
0
8,33
16,66
33,33
50
66,66
83,33
FRACCIÓN
Fig. 3. Cinéticas de actividad (V0), a diferente pH, de las fracciones del extracto de flor de
Cardo.
En cuanto a la evaluación del extracto dializado en la práctica, los valores
de fuerza de cuajo, de acuerdo al análisis estadístico que se aplicó con la prueba
t de Student (p<0.05) para la diferenciación de medias y el ANOVA, se demostró
que el mejor tratamiento fue el pH 5.0, siguiéndole el pH 6.3 y 6.6 que
estadísticamente son iguales. Esto muestra claramente la acción que realiza la
enzima al ser aplicada a la leche. Lo anterior se puede apreciar con más claridad
en la figura 4.
Fuera de cuajo
1200
1000
8,33%
800
16,66%
33,33%
600
50,00%
400
66,66%
200
83,33%
0
4,9
5,1
5,3
5,5
5,7
5,9
6,1
6,3
6,5
6,7
pH evaluado
Fig. 2. Fuerza de cuajo de fracciones de extracto variando el pH.
En el caso del pH 5.0, que estadísticamente fue el mejor, se interpreta
como un comportamiento de sinergia entre la acción de la enzima y el nivel de
324
ácido presente. Esto también permitió comprobar lo que expone Macedo (1994) en
cuanto a la inespecificidad de la enzima.
Por último, se evaluó al extracto parcialmente purificado en tecnología
quesera práctica, elaborando queso fresco molido y queso asadero, se obtuvieron
rendimientos muy similares a los obtenidos con cuajo fúngico comercial. Sin
embargo, el queso fresco presentó desarrollo de sabor amargo a lo largo de dos
semanas de conservación, lo que no ocurrió con el queso asadero por la
temperatura a la que fue sometido. Esto debido a la liberación de aminoácidos y
polipéptidos en el producto por la inespecificidad del grupo de enzimas.
Conclusiones
La proteasa del cardo (C. cardunculus L.) se ajusta al comportamiento
michaeliano. La evaluación cinética de las fracciones, variando pH, demuestra la
presencia de un complejo enzimático, más que la actividad de una sola enzima. El
valor de Km obtenido es menor a la unidad, con lo que se concluye que la enzima
tiene afinidad aceptable por el sustrato.
Para el establecimiento de condiciones tecnológicas prácticas, la evaluación
de fracciones demuestra como mejores a las de 66.66 y 83.33% con las mayores
actividades a pH 6.3 y 6.6, correspondientes al de la leche fresca, por lo que se
recomienda usar esas fracciones combinadas en la tecnología quesera.
Por la acción inespecífica de la proteasa del cardo (C. cardunculus L.), se
recomienda su uso en quesos de pasta fresca a consumirse en un periodo de
tiempo corto (1 a 2 semanas), debidamente conservados; o bien, en quesos de
pasta cocida e hilada, cuya conservación se prolonga por la acción que tiene la
temperatura del proceso sobre la enzima. No se recomienda su uso en quesos
que deban someterse a un proceso de maduración, por muy corto que sea, pues
la liberación de péptidos les proporciona sabor amargo y defectos en la textura.
Literatura citada
Duckjovich, A.; esquivel, G. 1995. Extracción, purificación y caracterización de la proteasa del
trompillo (Solanum elaeagnifulium) y su posible aplicación en la industria alimentaria. Tesis
de maestría en biotecnología de enzimas. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad
Autónoma de Coahuila. Saltillo, Coahuila, México.
Faro, C. J. (1991). Purificação e caracterização Físico-Química da protease de Cynara cardunculus
L. Coimbra, ed. aut., p. 163. http://www.uc.pt/sdp/teses/,
González
M.,
J.M.
(2005).
Bioquímica
y
Biología
Molecular.
http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ2-2.htm#ph.
Hernández C., F; Hernández G., M. (2004). Obtención y Caracterización de proteasas con
aplicación en la industria quesera a partir del cardo. (Cynara cardunculus L.) Tesis de
Licenciatura. U.A.A.A.N, Buenavista, Saltillo, Coahuila, México.
Lynch, M. J.; Raphael, S. S.; et al. 1987. Métodos de laboratorio, Vol. 2, 2ª edición. Ed. Nueva
Editorial Interamericana., México, D. F.
Macedo, Maria Isabel Queiroz de.1994. Especificidade caseinolítica da protease de Cynara
cardunculus L. Coimbra, ed. aut. Disponible en: http://www.ci.uc.pt/sdp/teses/ el 24/09/03;
23:20 hrs.
Nilo, Rivas R. 1997. Purificación parcial y caracterización cinética de la polifenoloxidasa del
Cambur manzano (Musa [AAB] cy “manzano”). Facultad de Agronomía. Universidad
Central de Venezuela. Macaray (Arogua).
Scott, R. 1991. Fabricación de Queso. Ed. Acribia, S.A., Zaragoza, España.
325
Veisseyre, Roger. 1972. Lactología técnica; recogida, tratamiento y transformación de la leche en
países templados y calientes. 2ª. Edición del francés (traducción). Ed. Acribia, S. A., Zaragoza,
España.
326