Departamento de Bioquímica Vegetal

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Departamento de Bioquímica Vegetal
y Biología Molecular
PROBLEMAS DE BIOQUÍMICA
GRUPOS C y D
Curso 2003-2004
FISICO-QUÍMICA DE PROTEÍNAS
1.
Queremos separar una mezcla de tres proteínas, A, B y C. Los puntos isoeléctricos, previamente determinados,
son pIA = 4.1, pIB =6.8 y pIC = 7.5 ¿Cual sería el procedimiento a seguir?
2.
Predecir el orden de elución de las siguientes proteínas cuando una mezcla de las mismas se pasa a través de una
columna de Sephadex G-200 (gel con un tamaño de poro que excluye todas las proteínas con un peso molecular
mayor o igual a 250.000): 1) citocromo c (PM = 13.000), 2) triptófano sintetasa (PM = 117.000), 3) hexoquinasa
(PM = 96.000), 4) ATP sulfurilasa (PM = 440.000), 5) glucosa oxidasa (PM = 154.000) y 6) xantina oxidasa
(PM = 300.000).
Sol.: 4 y 6 simultáneamente, y luego 5, 2, 3, 1
3.
Determinar el peso molecular de una proteína sabiendo que su volumen de elución en una columna de filtración
en gel es de 37 ml y el volumen vacío de la columna Vo = 20 ml. Los volúmenes de elución de patrones de PM
conocido son: citocromo c (PM = 13.370), 118 ml; ß-lactoglobulina (PM = 37.100), 58 ml y hemoglobina (PM =
64.500), 24 ml.
Sol.: PM = 50.100
4.
Se ha preparado una columna de Sephadex G-200 para determinar masas moleculares de proteínas. Se ha
calibrado con proteínas de masa molecular conocida y se han obtenido los volúmenes de elución (Ve) que figuran
en la tabla adjunta. El valor del volumen de exclusión o volumen vacío (V o) es de 80 ml. Determinar la masa
molecular de la seroalbúmina bovina si su volumen de elución relativo resultó ser V e/Vo = 2,09.
Proteína
Ribonucleasa
Mioglobina
Hemoglobina
Inmunoglobina
Fibrinógeno
Tiroglobulina
M (kDa)
12,64
16,9
64,5
150
339
670
Ve(ml)
232
220
170
136
104
80
Sol.: M = 69 kDa
5.
Una mezcla de hemoglobina (pI = 6,8) y de quimotripsinógeno (pI = 9,5) se sometió a electroforesis de zona.
¿En qué dirección habrán migrado estas proteínas al someterlas al campo eléctrico, a) a pH 6,8; b) a pH 8?.
Sol. a) Hb no se moverá; Qt hacia el cátodo; b) Hb hacia el ánodo; Qt hacia el cátodo.
6.
Tras un proceso de purificación, se ha obtenido una preparación de un enzima puro. Sometida a cromatografía de
exclusión molecular en columna de Sephadex G-100, el enzima eluyó a un Ve de 60 ml. El volumen vacío de la
columna era de 30 ml, y los volúmenes de elución de distintos patrones de masa molecular conocida fueron:
seroalbúmina (63 kDa), 37,5 ml; ovoalbúmina (43 kDa), 48,6 ml; quimotripsina (25 kDa), 59 ml; y mioglobina
(16 kDa), 69 ml. Calcular el peso molecular de la enzima.
Sol.: PM = 24.000
7.
Para determinar el pI de una proteína se le somete a isoelectroenfoque en gradiente de anfolinas entre pH 5 y 9.
La proteína se localizó en una banda a 8,5 cm del origen, siendo la longitud total del gel de 12 cm. Calcular el pI
de la proteína.
Sol: 6,17
8.
Queremos separar una mezcla de tres proteínas A, B y C, cuyos puntos isoeléctricos son pI A = 5,9, pIB = 3,4 y
pIC = 8,2. Diseñar un procedimiento cromatográfico y otro electroforético que permita su separación, precisando
especialmente las condiciones de pH. Predecir en cada caso el resultado esperable.
9.
Se ha purificado hasta homogeneidad una proteína que presenta actividad enzimática, y que en electroforesis en
presencia de SDS mostraba una movilidad relativa (Rf) de 0,45. En la misma electroforesis se pusieron los
siguientes patrones: fosforilasa a (PM 96.000), Rf = 0,2; seroalbúmina (PM 67.000), Rf = 0,36; alcohol
deshidrogenasa (PM 43.000), Rf = 0,56; e inhibidor de tripsina, (PM 20.000) Rf = 0,9.
Determinar el peso molecular de la proteína sabiendo que solo presenta una subunidad.
Sol.: PM = 55.000
10.
Al someter una proteína de 240 kDa a electroforesis en presencia de SDS, se observan 3 bandas de masa
molecular 40, 50 y 70 kDa. Se ha determinado la presencia de Fe en la enzima en una proporción de 3 moles de
Fe/mol de enzima. Proponer estructuras cuaternarias consistentes con los datos.
11.
Se ha purificado una proteína de hepatocitos de rata. Al someterla a electroforesis en presencia de SDS sólo se
obtuvo una banda de 40.000 Da. Un análisis de hidrolizado de la proteína indicaba la presencia de 3,98 µg de
FMN por mg de proteína.
Proponer una estructura cuaternaria compatible con los datos expuestos. Razonar la respuesta.
Datos: PM (FMN) = 478
Sol.: PM = 120.000; trímero con subunidades de 40.000, conteniendo 1 mol de FMN por mol de proteína
12.
Se ha conseguido purificar una proteína de la cápsida del temible virus WRI2. Cuando se somete una muestra de
dicha proteína a electroforesis en gel de acrilamida en presencia de SDS, se observa una única banda que migra a
la misma distancia que otra proteína patrón de PM 15.000. Por otra parte, al analizar el comportamiento de la
proteína en filtración en gel, se observa que eluye a un volumen comprendido entre los de dos proteínas patrón
de PM 25.000 y 35.000. Cada mg de proteína contiene 4,3 g de zinc (peso atómico 65,4). Proponer una
estructura cuaternaria compatible con los datos.
Sol.: dímero de 30 kDa, conteniendo 2 atg Zn/mol proteína
13.
El análisis de la fosforilasa de músculo por filtración en columna de Sephadex reveló un PM de 36.000. Al
realizar una electroforesis en gel de acrilamida con SDS apareció una única banda de PM 9.000. Un análisis de
una muestra hidrolizada de la proteína reveló la presencia de 18,6 g de piridoxal (PM = 167,2) por mg de
proteína. Proponer la posible estructura cuaternaria de esta proteína.
Sol.: Tetrámetro con subunidades de 9.000 Da, conteniendo 4 mol piridoxal/mol de fosforilasa
14.
Se ha purificado un enzima cuya estructura se desconoce y se desea investigar. Sometida a cromatografía de
exclusión molecular en columna de Sephadex G-100, la enzima eluyó a un Ve de 54 ml. El volumen vacío de la
columna era de 30 ml, y los volúmenes de elución de distintos patrones de masa molecular conocida fueron:
seroalbúmina (63 kDa), 37,5 ml; ovoalbúmina (43 kDa), 48,6 ml; quimotripsina (25 kDa), 59 ml; y mioglobina
(16 kDa), 69 ml. Por otra parte, sometida a electroforesis en presencia de SDS en condiciones desnaturalizantes,
la enzima migró como una única banda de Rf = 0,82, mientras que patrones de masa molecular conocida
presentaron los siguientes Rf: seroalbúmina (63 kDa), 0,29; ovoalbúmina (43 kDa), 0,45; inhibidor de tripsina
(20 kDa), 0,72; y citocromo c (12 kDa), 0,9. Determinar el peso molecular de la enzima y proponer la estructura
cuaternaria más probable.
Sol.: PM por filtración en gel, 31.600 ; PM por electroforesis desnaturalizante, 15.000.
Estructura cuaternaria más probable: dímero con subunidades de 15 kDa.
15.
Se ha purificado a homogeneidad una enzima hidrolasa de músculo de pollo. Mediante cromatografía de
exclusión molecular en Sephadex G-200, se le determinó una masa molecular de 164 kDa. Cuando la hidrolasa
se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS junto con patrones de peso molecular conocido se
observó la aparición de dos bandas, A y B, que teñidas con un colorante específico de proteínas presentaban
aproximadamente la misma intensidad de color. Las movilidades electroforéticas relativas fueron: Banda A,
Rf=0,37; Banda B, Rf=0,57; Seroalbúmina, PM 68.500, Rf=0,20; Quimotripsinógeno, PM 25.000, Rf=0,58;
Mioglobina, PM 16.900, Rf=0,74. Razonar cual sería la estructura cuaternaria más probable de la hidrolasa.