Efecto del pH y temperatura sobre la actividad enzimática

LABORATORIO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA III
PRÁCTICA No. 3
EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN
En los sistemas biológicos existen los catalizadores que termodinámicamente funcionan de
forma parecida a los catalizadores químicos, es decir reduciendo la energía de activación
de la reacción. De otra manera, con la participación de las enzimas se puede llevar a cabo,
reacciones químicas que, sin su presencia, podrían ser muy prolongadas o imposibles. Los
catalizadores biológicos y los químicos tienen características fisicoquímicas muy diferentes,
que pueden ser parametrizadas siguiendo los cambios de pH o temperatura La temperatura
afecta a las reacciones químicas; sin embargo, debido a la naturaleza proteica, la
desnaturalización térmica hará que disminuya su concentración efectiva proteica y por lo
tanto también su velocidad de reacción. La velocidad de muchas reacciones enzimáticas
se duplica aproximadamente por cada 10 °C de aumento de temperatura (Q10=2). Sin
embargo el coeficiente de temperatura Q10 varía de una enzima a otra, debido a la energía
de activación (Ea) catalizada, es decir de la altura de la barrera de energía para pasar al
estado de transición.
OBJETIVO
Que el alumno evalúe el efecto del pH y temperatura en la actividad enzimática
20
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
2
MATERIALES
Tubos con tapa de rosca (pequeños)
Gradilla para tubos
Probeta de 100 mL
Vasos de precipitados de 100 mL
Micropipeta de 100-1000L
Micropipeta de 10-100L
Piceta con agua destilada
Vortex
Baño María con temperatura controlada
Palangana
Termómetro 0-100ºC
Espectrofotómetro
Celdas de acrilico (profesor)
Pipeta Pasteur
Papel Seda
Puntas para Micropipeta (profesor)
REACTIVOS
2,6-dimetoxifenol (2,6-DMP) (profesor)
Reactivo de Bradford (profesor)
Fosfato Monobasico de Potasio
Fosfato Dibasico de potasio
Glicina
HCl
Acido Cítrico
Citrato de Sodio
Acido Acético
Acetato de Sodio
ALUMNOS
Tijeras
Franela
Maskintape y Plumón con tinta Indeleble
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES (traer cálculos de la soluciones)
(UN ALUMNO DE CADA EQUIPO SE PRESENTARA AL LABORATORIO PREVIO A LA PRACTICA)
1. Preparar 50mL de soluciones amortiguadoras de glicina-HCl pH 2.0, citratos pH 3.0 y 4.0,
acetatos pH 5.0, fosfatos 50 mL pH 6.0 y pH 7.0, Tris-HCl pH 8.0, a una concentración de
50mM.
2. Solución de Sustrato Enzimático:2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) 0.5 mM, 250 mL en H2O
destilada.
3. Solución de enzima: 50 mL de Solución de enzima lacasa MtL en amortiguador de
fosfatos 0.5mM a pH 6.0.
LABORATORIO DE INGENIERIA BIOQUIMICA III
PROCEDIMIENTO
Ensayo enzimático para pH (EQUIPOS PARES)
A. Disponer 7 tubos de ensaye y su duplicado (14 tubos totales) de la forma siguiente: No
adicione la solución de enzima hasta que prepare todas las diluciones.
Tubo
pH
Amort. (µL)
2,6 DMP(µL)
1
2
400
500
2
3
400
500
3
4
400
500
4
5
400
500
5
6
400
500
6
7
400
500
7
8
400
500
B. Prepare un Blanco de calibración con 500µL de H2O y 500 µL de 2,6-DMP.
C. Encender y elegir la opción de cinética en el espectrofotómetro con la siguientes
condiciones: 469 nm, tiempo de retardo = 0 minutos, intervalos de 25 segundos, tiempo
total 5 minutos.
D. Una vez preparados todos los tubos, ajustar el blanco espectrofotométrico y adicionar al
tubo con amortiguador pH 2 (tubo 1), la cantidad correspondiente de 100 µL de solución
de enzima, agitar rápidamente, depositar esta en una celda de acrílico y tomar las
lecturas de la absorbancia vs tiempo, cada 25 segundos hasta que se cumplan los 5
minutos. Efectuar el mismo proceso para demás tubos adicionando 100 µL de solución de
enzima hasta el momento en que se determine la actividad.
Ensayo enzimático para temperatura (EQUIPOS NONES)
E. Disponer 9 tubos de ensaye y su duplicado (18 tubos totales) de la forma siguiente:
Tubo
T (ºC)
Amort pH 6.0 (µL)
µL 2,6-DMP
1
25
800
100
2
30
800
100
3
40
800
100
4
50
800
100
5
55
800
100
6
60
800
100
7
70
800
100
8
75
800
100
9
80
800
100
F. Prepare un Blanco de calibración con 900µL de amortiguador respectivo y 100µL de 2,6DMP.
G. Incube a la temperatura correspondiente los siguientes tubos: el tubo con enzima, un
tubo con 2 mL de 2,6DMP, y el tubo blanco a cada temperatura, durante 2 minutos
exactos.
H. Una vez acondicionados los tubos a la temperatura indicada, ajustar el blanco
espectofotométrico y adicionar al tubo que contiene la enzima, 1.5 mL de 2,6-DMP,
agitar rápidamente y tomar las lecturas de la absorbancia vs tiempo, cada 25 segundos
hasta completar 5 minutos. Efectuar el mismo proceso para demás tubos, ajustando con
el blanco respectivo a la temperatura correspondiente.
PRÁCTICA No. 3 EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
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Ensayo de Proteina (Bradford)
En otros tubos efectuar 3 diluciones para los extractos de hongo hasta obtener un volumen
final de 800L de extracto. Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200L de
Reactivo de Bradford, agitar y reposar los tubos durante 10 minutos y tomar la lectura de la
absorbancia de cada tubo en la longitud de onda de 595 nm, previamente ajustando el
espectrofotómetro con un blanco de amortiguador de fosfatos tratado en la misma forma
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
a) Reportar una tabla y un gráfico de las curvas de progreso en unidades internacionales
específicas vs tiempo (min).
b) Reportar la gráfica de actividad óptima que obtuvo (UIE vs pH) y el pH óptimo
correspondiente y comparar el resultado obtenido experimentalmente con el
investigado en literatura.
c) Reportar la gráfica de actividad óptima que obtuvo (UIE vs T) y la T óptima
correspondiente y comparar el resultado obtenido experimentalmente con el
investigado en literatura.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué diferencia existe entre la actividad y la estabilidad de una enzima?
2. ¿Qué influencia tiene a nivel molecular el pH y la fuerza iónica del medio sobre las
enzimas, su actividad y en la conformación del sitio activo?
3. ¿Qué parámetros calcularía para establecer las diferencias correspondientes al efecto
de la temperatura sobre la actividad y que modelo aplicaría?
4. ¿Qué es el Q10 y que significado tiene?
5. ¿ A que temperatura se encuentra la actividad óptima de la lacasa y a cual se
desnaturaliza?
6. Si efectuáramos la determinación de Bradford a temperatura alta ¿Porque se detecta
proteína soluble a altas temperaturas pero la actividad enzimática disminuye?
BIBLIOGRAFÍA
1) Aiba S., Humphrey A. E. y Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, Second Edition.
Academic Press Inc. London.
2) Segel C. (1976) Enzyme Kinetics. Edition, John Wile & Sons. NY, USA.
3) Wang D. I., Cooney C. L., Demain A. L., Dunnill P., Humphrey A. E. and Lilly M. D. (1979)
Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley & Sons. NY. USA.
4) Chung Lo S., Sze Ho Y., Buswell J. A. (2001) Effect of phenolic monomers on the production
of laccases by the edible mushroom Pleurotus sajor-caju, and partial characterization of a
major laccase component. Mycologia: 93 (3): 413–421.
PRÁCTICA No. 3 EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA