Manual de Laboratorio de Bioquímica OC
Anuncio
Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Marinas Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Dr. Eduardo Durazo Beltrán Responsable de la elaboración del manual [Avalado, Validado] el [fecha] por Consejo Técnico Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Marinas Directorio Dr. Felipe Cuamea Velázquez Rector UABC Dr. Oscar Roberto López Bonilla Vicerrector, UABC Campus Ensenada Dr. Juan Guillermo Vaca Rodríguez Director FCM Dr. Víctor Antonio Zavala Hamz Subdirector, FCM Índice Introducción ............................................................................................................................................................ 1 Encuadre del Sistema de Prácticas ......................................................................................................................... 2 Introducción ........................................................................................................................................................ 2 Competencias a las que contribuye .................................................................................................................... 3 Niveles de Desempeño ..................................................................................................................................... 3 Ubicación dentro del mapa curricular................................................................................................................. 4 Programa del Sistema de Prácticas ..................................................................................................................... 5 1. 2. BIOMOLECULAS ............................................................................................................................................... 6 1.1. Espectrofotometría y ley de Beer-Lambert. ......................................................................................... 7 1.2. Determinación del contenido de proteína soluble............................................................................ 11 1.3. Determinación del punto isoeléctrico de una proteína. ................................................................... 15 1.4. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción. ..................................................................... 19 1.5. Determinación de parámetros de cinética enzimática. ..................................................................... 24 1.6. Determinación de carbohidratos totales. .......................................................................................... 29 1.7. Aislamiento y cuantificación de glucógeno. ....................................................................................... 33 1.8. Extracción y cuantificación de lípidos................................................................................................. 37 1.9. Determinación de fosfoglicéridos. ..................................................................................................... 41 1.10. Extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos. ................................................................. 47 METABOLISMO .............................................................................................................................................. 51 2.1. Oxidación biológica y transporte de electrones. ................................................................................ 52 2.2. Actividad oxidativa de la lactato deshidrogenasa ................................. Error! Bookmark not defined. 2.3. Capacidad metabólica celular y actividad de citocromo oxidasa ....................................................... 62 Anexos ................................................................................................................................................................... 67 Normas Generales de Seguridad e Higiene....................................................................................................... 67 Medidas Generales en Caso de Accidente ........................................................................................................ 69 Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Introducción Página 1 Introducción Este manual está estructurado como material didáctico de apoyo para actividades de laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Bioquímica, de la carrera de Oceanología de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California. El contenido del manual también podrá ser utilizado por estudiantes en carreras afines y en cursos de bioquímica general con las adecuaciones que cada actividad de aprendizaje requiera para coadyuvar en su formación disciplinaria. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Encuadre del Sistema de Prácticas Página 2 Encuadre del Sistema de Prácticas Introducción Se estima que el desarrollo de la asignatura de Bioquímica seria extraordinariamente árido y de difícil comprensión si no se acompañara de actividades complementarias de carácter práctico, las cuales permitan ilustrar y complementar conceptos o mecanismos moleculares complejos de la química de los seres vivos que se asocian a la estructura y a la dinámica del funcionamiento celular y de tejidos. Con frecuencia se tiene la concepción que el desarrollo de las prácticas de bioquímica conlleva un tiempo prolongado, métodos complejos y una diversidad de recursos materiales, por lo cual puede parecer complicado el adecuar las actividades del laboratorio con el tiempo curricular disponible, la habilidad y destreza de los estudiantes en la etapa que cursan la asignatura y los recursos disponibles de la unidad académica. De aquí que la serie de experiencias prácticas que se desarrollan se estima que coadyuvan en forma adecuada para alcanzar las competencias establecidas en el programa de la unidad de aprendizaje, lo cual deberá ser una premisa indispensable en el proceso de enseñanza-aprendizaje del estudiante, lo cual se reflejara en que este adquiera los conocimientos y habilidades en bioquímica requeridos para las etapas disciplinaria y terminal de su formación profesional. El manual de Bioquímica se ha preparado con prácticas dirigidas a mostrar algunas de propiedades de las biomoléculas y de la dinámica metabólica celular mediante procedimientos analíticos sencillos que no requieren de equipamientos complejos y de alto costo.. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Encuadre del Sistema de Prácticas Página 3 Competencias a las que contribuye Niveles de Desempeño Los conocimientos, unidos a las habilidades y a los valores, permiten que se construyan competencias. Para ello es necesario que el conocimiento se aplique de manera práctica en la construcción o desempeño de algo, por lo cual el alumno deberá estar capacitado al finalizar una etapa para desempeñar o producir lo establecido en su programa de estudio. El trabajo que se desarrolla en el Laboratorio de Bioquímica contribuye al desarrollo de las competencias del programa de la unidad de aprendizaje: Diferenciar la estructura y propiedades de las biomoléculas y sus funciones metabólicas, reconocer los principios de los cambios de energía en procesos biológicos y distinguir los fundamentos de la regulación de procesos metabólicos para diferenciar vías metabólicas centrales en organismos y ambientes acuáticos, mediante un trabajo individual y en equipo el cual promueva el desarrollo del pensamiento crítico y la asertividad en el estudiante. El nivel de desempeño del alumno estará asociado al desarrollo óptimo de actividades como: La realización de las prácticas en forma y tiempo, lo cual le requerirá de un amplio dominio de diferentes habilidades y conocimientos; la elaboración sistemática y estructurada de informes por práctica, mediante disciplina y laboriosidad, así como el uso eficiente de herramientas computacionales. El trabajo en el laboratorio deberá ser realizado en equipo, lo cual requiere de una participación armónica en el trabajo de conjunto. El pensamiento crítico deberá ser utilizado en forma óptima para realizar los diversos pasos de la actividad práctica. El reporte de la práctica se deberá de entregar de acuerdo a un formato elaboración preestablecido, de manera individual. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Encuadre del Sistema de Prácticas Página 4 Ubicación dentro del mapa curricular HC= Horas Clase; HL= Horas Laboratorio; HT= Horas Taller; HPC= Horas Practicas Campo; HE= Horas Ejercicios; CR=Créditos Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Encuadre del Sistema de Prácticas Página 5 Programa del Sistema de Prácticas Tema INTRODUCCIÓN Ámbito de desarrollo Práctica o prácticas programadas Revisión de reglas para el trabajo en el laboratorio. Descripción del protocolo para elaborar un reporte escrito de una práctica de laboratorio 1.1. Practica 1: Espectrofotometría y ley de Beer-Lambert. 1.2. Práctica 2: Determinación del contenido de proteína soluble. 1.3. Práctica 3: Determinación del punto isoeléctrico de una proteína. 1.4. Práctica 4: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Laboratorio 3 horas Semana 1 Laboratorio 3 horas Semana 2 3 horas Semana 3 3 horas Semana 4 3 horas Semana 5 Laboratorio Laboratorio Laboratorio 1.5. Práctica 5: Determinación de Laboratorio parámetros de cinética enzimática. 1.6. Práctica 6: Determinación de Laboratorio carbohidratos totales. 1.7. Práctica 7: Aislamiento y cuantificación Laboratorio de glucógeno. 1.8. Práctica 8: Extracción y cuantificación Laboratorio de lípidos. 1.9. Práctica 9: Determinación de Laboratorio fosfoglicéridos. 1.10. Práctica 10: Extracción y Laboratorio determinación de pigmentos algales. 1.11. Práctica 11: Oxidación biológica y Laboratorio transporte de electrones. UNIDAD II: 1.12. Práctica 12: Actividad oxidativa de la Laboratorio METABOLISMO lactato deshidrogenasa. 1.11. Práctica 13: Capacidad metabólica Laboratorio celular y actividad de citocromo-oxidasa. * Duración en horas para cada práctica, y semana del semestre en la que se realizará. UNIDAD I: BIOMOLÉCULAS Dr. Eduardo Durazo Beltrán Duración* 3 horas Semana 6 3 horas Semana 7 3 horas Semana 8 3 horas Semana 9 6 horas Semana 10 y 11 3 horas Semana 12 3 horas Semana 13 3 horas Semana 14 6 horas Semana 15 y 16 Facultad de Ciencias Marinas de la UABC 1. BIOMOLECULAS Mediante el uso de protocolos experimentales y técnicas analíticas estudiar características químicas y propiedades de las biomoléculas, lo cual permita analizar su relación con las funciones bioquímicas que desarrollan en la célula y en los seres vivos. Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.1. Página 7 Espectrofotometría y ley de Beer-Lambert. 1.1.1. Introducción. Los métodos ópticos de análisis pueden utilizares para determinar en forma precisa la concentración de sustancias disueltas, dentro de estos la espectrofotometría es una de las técnicas más comunes en análisis bioquímicos. Un espectrofotómetro mide cuanta luz absorbe una solución, dicha absorción se puede usar para medir la concentración de los solutos. La mayoría de los solutos absorben luz a una determinada longitud de onda, y entre más concentrado es el soluto mas es la luz que se absorbe. El fenómeno es de naturaleza exponencial y depende de la concentración del material absorbente de la luz, del espesor de la capa de solución interpuesta en el trayecto del haz luminoso y de la longitud de onda de la luz empleada en la determinación. Generalmente la longitud de onda de la luz y el espesor de la capa que atraviesa, se mantienen constantes y la intensidad de luz transmitida (I), se compara con la que transmite el solvente puro (Io). La ley que relaciona la cantidad de luz transmitida por una solución con la concentración del soluto que absorbe luz es la ley de Beer-Lambert la cual se expresa de la siguiente forma: A = log Io/I =- log T= b C Donde: A: Absorbencia, magnitud adimensional, Io: Intensidad de la luz incidente, I: Intensidad de la luz trasmitida, T: Transmitancia, I/Io, : Coeficiente de extinción molar, en M-1 cm-1, b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm, C: Concentración del soluto, en moles/litro (M). La ley de Beer-Lambert establece que la absorbencia es proporcional a la concentración de las especies absorbentes. Dicha ley se cumple en un intervalo definido de de absorbencia vs concentración, denominada curva de calibración. Para determinar la concentración desconocida de una solución se mide su absorbancia y luego se calcula la concentración correspondiente mediante el uso de la ecuación de la curva de calibración. Las desviaciones aparentes de esta ley en soluciones más concentradas Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 8 pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solución. Conforme una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto interactúan entre sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la gráfica de absorbencia en función de la concentración pierde su linealidad. Hay tres aplicaciones fundamentales de esta técnica en determinaciones bioquímicas: 1) Si se conoce el coeficiente de extinción molar de un compuesto a una longitud de onda específica, es factible el determinar la concentración de dicho compuesto mediante la medición de su absorbencia, como puede ser la cuantificación de bajas concentraciones de compuestos como nucleótidos (2-4 mg). 2) El curso de una reacción puede ser determinada mediante la medición o aparición de compuestos que absorban luz. El dinucleótido NADH absorbe fuertemente a 340 nm en tanto que su forma oxidada (NAD+) no presenta absorbencia a esta longitud de onda, lo cual permite dar seguimiento a su producción o gasto en una reacción. 3) Se pueden identificar ciertos compuestos mediante la determinación del espectro de absorción en que presentan en el intervalo visible o ultravioleta, como es el caso de pigmentos como las clorofilas. 1.1.2. Competencia. Evaluar la absorbencia de proteína en solución con base al fundamento de la ley de Beer-Lambert, para elaborar una curva de calibración precisa, con organización y disciplina. 1.1.3. Material. 1.1.3.1. Materiales. Tubos de ensayo, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado, termómetro, celdas para espectrofotómetro, gradilla, piseta. 1.1.3.2. Instrumental. Agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotómetro. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 9 1.1.3.3. Reactivos. Solución estándar de albumina (10 mg/mL), reactivo de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua destilada), solución problema. 1.1.4. Desarrollo. 1. Medir 1 mL de la solución de albúmina y colocar en un tubo de ensayo. 2. Adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y mezclar. 5. Medir la absorbencia en función de la longitud de onda entre 400 y 600 nm cada 20 nm. 6. Determinar la longitud de onda óptima para efectuar la cuantificación de la proteína a partir de los valores de absorbencia vs longitud de onda. 7. Elaborar una curva de calibración mediante cinco distintas concentraciones de albúmina, obtenidas por medio de diluciones sucesivas de la solución de estándar de albumina. Ajustar la absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga únicamente agua y solución de Biuret. 8. Medir la absorbencia de una solución de concentración desconocida. 1.1.5. Resultados a reportar. Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la regresión lineal de los valores de absorbencia vs. concentración de las soluciones de albúmina analizadas. Contenido de proteína soluble en solución de concentración desconocida. 1.1.6. Método de Evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del [NOMBRE DEL RESPONSABLE] Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 10 inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.1.7. Bibliografía. Holtzhauer, M., 2006. Basic Methods for the Biochemical Lab. 5th edition. Chapter 1: Quantitative Methods. Springer-Verlag, Berlin, p. 1-21. Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at practical classes for students of pharmacy: a student-centered approach. Biochemistry and Molecular Biology Education 28, 327-329. Prats, M., 1989. Tools in spectrophotometry and differential spectrophotometry. Biochemical Education 17(3), 151-153. Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed. Hélice, Madrid, pp. 70-84. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.2. Página 11 Determinación del contenido de proteína soluble. 1.2.1. Introducción. La cuantificación de proteínas es una de las determinaciones más comunes que se efectúan en estudios bioquímicos, es un paso importante para el manejo de muestras en las cuales se requiere el aislamiento y la caracterización de proteínas. El determinar el contenido proteico de una muestra es un requisito común previo al uso de métodos de separación, análisis cromatográficos, electroforesis, inmunoquímica, entre otros. Cuando se requiere determinar la concentración de proteínas de una muestra una de las primeras cuestiones a considerar es la selección de un método analítico adecuado. La elección entre los ensayos de proteínas disponibles por lo general se hace en base a considerar la compatibilidad del procedimiento con las muestras a evaluar. El objetivo es seleccionar un método que requiera menos manipulación o tratamiento previo de las muestras y evitar la presencia de sustancias que puedan interferir en la determinación. Todas las proteínas están conformadas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos los cuales se originan por la interacción entre los grupos amino terminal y el carboxilo contiguos. En general se presentan 20 aminoácidos formando parte de las proteínas. Una reacción del enlace peptídico de tripéptidos, polipéptidos y proteínas con iones de Cu+2 en un medio alcalino y en presencia de tartrato de sodio da como producto un complejo de quelación colorido el cual absorbe a 540 nm, mediante esta reacción denominada de biuret se pueden cuantificar péptidos y proteínas. El ion cúprico forma un complejo coordinado con los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de 4 enlaces peptídicos, la intensidad del color es proporcional al total de enlaces peptídicos que participan en la reacción. La reacción de biuret es la base de un método colorimétrico simple y rápido para determinar cuantitativamente el contenido de proteína soluble de una muestra. El método es aplicable para determinar proteína en el intervalo de 1 a 160 mg/mL. Compuestos como lípidos, hemoglobina, EDTA y sales de amonio pueden interferir en el desarrollo de la reacción. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 12 Complejo de biuret 1.2.2. Competencia. Analizar el contenido de proteína soluble en tejidos de un organismo acuático mediante un método espectrofotométrico, para contrastar la función tisular con el nivel de proteína, con disciplina y disposición. 1.2.3. Materiales y reactivos. 1.2.3.1. Materiales. Estuche de disección, tubos de ensaye, espátula, homogeneizador manual, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado, termómetro, celdas para espectrofotómetro, gradilla, piseta. 1.2.3.2. Instrumental. Centrifuga, agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotómetro. 1.2.3.3. Reactivos. Buffer salino (NaCl 0.15M, citrato de sodio 0.015M, pH 7), reactivo de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua destilada). Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 13 1.2.4. Metodología. 1. Realizar la disección del organismo de estudio, separar 2 tejidos y colocar cada muestra en un vaso de precipitado en hielo. 2. Cortar cada tejido en trozos pequeños y pesar en una proporción de 0.2 g por mL de buffer salino que se utilizará para su homogeneización. 3. Homogeneizar cada uno de los tejidos mediante el uso de un homogeneizador manual de tubo con embolo en un baño de hielo. 4. Centrifugar el homogenado a 3000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante. 5. Por duplicado, mezclar 0.2 mL del sobrenadante por tejido con 0.8 mL de agua destilada, adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y agitar. 6. Calentar la solución en baño de agua a 37 C por 10 minutos. 7. Enfriar la solución y leer la absorbencia a 540 nm. 8. Determinar el contenido de proteína soluble a partir de los valores de absorbencia y la ecuación de la curva de calibración de albumina elaborada en la práctica No 1. 1.2.5. Resultados a reportar. Nombre común y científico de los organismos analizados. Contenidos de proteína soluble en mg por g de tejido analizado. 1.2.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 14 1.2.7. Bibliografía. Krohn, R.I., 2001. The colorimetric detection and quantitation of total protein. Current Protocols in Food Analytical Chemistry B1.1.10-B1.1.13. Janairo, G., Sy, M.L., Yap, L., Llanos-Lazaro, N., Robles, J. 2011. Determination of the sensitivity range of Biuret test for undergraduate biochemistry experiments. e-Journal of Science & Technology 5, 77-83. Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed. Hélice, Madrid, pp. 156-157. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.3. Página 15 Determinación del punto isoeléctrico de una proteína. 1.3.1. Introducción. Aun cuando en la formación de la unión peptídica de los grupos carboxílicos y aminos de los aminoácidos no generan en enlace con carga, es común que queden libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptídicas, o en las cadenas laterales de los aminoácidos ácidos y básicos. La disociación de los grupos ionizables que están presentes en las proteínas, así como la de los grupos ionizables de los aminoácidos individuales, está determinada por el pH del medio en el cual se encuentra la proteína. A pH de 7.0 o en valores cercanos a este, los cuales son comunes en la mayoría de las células, los grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico se encuentran en sus formas básicas con carga negativa, mientras que los aminoácidos lisina y arginina están presentes en su formas ácidas con carga positiva. La contribución de los grupos sulfhidrilo de la cisteína, y fenólico de la tirosina es mínima; por ejemplo la tirosina presenta solo una disociación del 0.1% del grupo fenólico. La carga total de la proteína depende del pH de la solución y del número relativo de cada aminoácido en la molécula. Cuando el pH de la solución es tal que la carga de neta de la molécula proteica es cero, la cual se presenta cuando el número total de cargas positivas y negativas son iguales, se le denomina punto isoeléctrico o pH isoeléctrico de la proteína (pI). Los valores de pI de la mayoría de las proteínas son menores a 7, aunque se presentan valores desde 1.1 para la pepsina hasta 12 en protaminas. Una proteína ácida con pI bajo tendrá carga negativa a pH neutro, mientras que una proteína básica con un pI alto tendrá carga positiva a pH de 7. En general el punto isoeléctrico de una proteína es también el pH en el cual es menos soluble y más fácilmente precipita, esto se atribuye a que probable atracción entre grupos de carga opuesta de moléculas vecinas, ya que el número de cargas opuestas será el máximo en el punto isoeléctrico. La capacidad de variar la carga de una molécula proteica mediante el cambio del pH del medio en el cual se encuentra puede utilizarse para purificar y caracterizar proteínas mediante métodos como electroforesis o cromatografía de intercambio iónico. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 16 Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/ 1.3.2. Competencia. Evaluar el punto isoeléctrico de una proteína mediante variación del pH del medio en el cual esta disuelta, para relacionar este parámetro con las propiedades iónicas de la estructura, con compromiso y disciplina. 1.3.3. Materiales y reactivos. 1.3.3.1. Materiales. Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL, pipetero, vaso precipitado, gradilla, piseta. 1.3.3.2. Instrumental. Potenciómetro 1.3.3.3. Reactivos. Solución de caseína 5% en acetato de sodio 0.1N, ácido acético 0.01, 0.1 y 1N, solución buffer pH 4 y 7. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 17 1.3.4. Metodología. 1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla: REACTIVO (mL) TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Caseína 5% en acetato de sodio 0.1N Agua destilada 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4 CH3-COOH 0.01N 0.6 1.2 - - - - - - - CH3-COOH 0.1N - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 - CH3-COOH 1.0N - - - - - - - - 1.6 2) Agitar los tubos y observar la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla después de 15 y 30 minutos. 4) Tabular los resultados e indicar el grado de precipitación con los siguientes valores: 0 = ningún cambio. 1+ = turbidez. 2+ = notable turbidez. 3+ = precipitación. 4+ = marcada precipitación. 5+ = abundante precipitación. 5) Determinar el pH de cada tubo mediante el uso de un potenciómetro. 7) Elaborar una gráfica con el grado de precipitación en las ordenadas y el pH en las abscisas. El punto isoeléctrico aproximado corresponde al pH del tubo donde se presentó la máxima precipitación Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 18 1.3.5. Resultados a reportar. • pH experimental en cada tubo de reacción • pH teórico en cada tubo de reacción de acuerdo a la ecuación de HenderssonHasselbach. • Punto isoeléctrico de la proteína analizada. 1.3.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.3.7. Bibliografía. Ayala-Lopera, S.A., 2007. Manual de Laboratorio de Bioquímica. Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Escuela de Producción Pecuaria. Medellín, Colombia, pp. 11-12. Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica Médica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formación Básica Disciplinaria. Academia de Bioquímica Médica I. Propiedades de proteínas: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína. México, p. 18. Harris, D.C., 2007. Análisis Químico Cuantitativo. 6ª ed., Editorial Reverté, Barcelona, p. 217-219. Morris, J., G. 1975. Fisicoquímica para Biólogos. 2ª ed., Editorial Reverté, Barcelona, pp. 163-165. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.4. Página 19 Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción. 1.4.1. Introducción. La actividad enzimática es afectada por la temperatura del medio en el cual ocurre. Los puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Walls, que participan en la estabilización de las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas, son muy sensibles a incrementos en la temperatura, ya que aumenta el movimiento de las cadenas de aminoácidos y de los grupos laterales y, por lo tanto la fuerza y las colisiones entre las enzimas y la moléculas que las rodean. El aumento de las colisiones entre las moléculas de la enzima y el sustrato favorece, por el contacto, las reacciones que estas catalizan. Sin embargo a temperaturas muy elevadas, las colisiones son capaces de romper los puentes de hidrógeno y las fuerzas de van der Walls que son relativamente débiles, a medida que esto ocurre el rearreglo tridimensional de la enzima se modifica y se pierde su estructura funcional. Los cambios característicos que se producen con el incremento de temperatura en la actividad enzimática se muestran en siguiente la figura: Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 20 La temperatura en la cual la actividad catalítica es máxima se le denomina temperatura óptima. Por encima de esta temperatura se presenta la pérdida de actividad catalítica debida a desnaturalización térmica, lo cual da como resultado una disminución de la actividad enzimática hasta cesar. Es común que entre los 0 °C y 40 °C se observe un aumento de la actividad enzimática, intervalo en el cual ocurren cambios mínimos en la estructura de la enzima. Se postula que en una reacción química por cada incremento de 10 °C aumenta la velocidad reacción al doble, lo cual en la reacción enzimática tiene un efecto de la frecuencia de los choques entre las moléculas del sustrato y de la enzima. Si la temperatura aumenta por encima de los 40 °C las colisiones se incrementan y se inicia el rompimiento de enlaces. A los 55 °C la actividad enzimática empieza a disminuir, hasta que cerca de los 70 °C su actividad es cercana a cero como resultado de que desnaturaliza la proteína. La mayoría de la enzimas presentan una actividad óptima entre los 40 y 50 °C; sin embargo, algunos organismos poseen enzimas cuya actividad se da a temperaturas bajas, como es el caso de la lactato-deshidrogenasa de pez del antártico Trematomus bernacchii cuya actividad máxima se observa a Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 21 temperaturas muy por debajo de las enzimas homologas, de organismos que viven en ambientes más cálidos. Así mismo, organismos extremófilos como la bacteria termófila Thermus aquaticus presenta la enzima la ADN polimerasa con una temperatura óptima de funcionamiento alrededor de los 75 °C. 1.4.2. Competencia. Analizar el efecto de la temperatura en una reacción enzimática a través de la velocidad de hidrólisis del sustrato, para evaluar el funcionamiento óptimo de la enzima bajo estudio, con organización y disciplina. 1.4.3. Materiales y reactivos. 1.4.3.1. Materiales. Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 mL, pipetero, vasos de precipitado 125 mL, gradilla, piseta. 1.4.3.2. Instrumental. Planchas de calentamiento. 1.4.3.3. Reactivos. Amilasa (0.02%), almidón (8 mg/mL), glucosa (0.02 M), buffer de fosfatos pH 7, reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (disolver 1 g en 20 mL de NaOH 2 M, mezclar con 50 mL de NaKC4H4O6.4H2O 2.13M y aforar con agua destilada a 100 mL). 1.4.4. Metodología. I) Ensayo enzimático. 1) Preparar y correr una serie de tubos de acuerdo a lo establecido en la siguiente tabla, mezclar perfectamente al añadir cada reactivo. 2) El tubo 1 será el testigo negativo por lo que antes de añadir la enzima, se adicionara 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico como inhibidor enzimático. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 22 3) Al término del calentamiento en el baño de agua a ebullición, enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo 1 como blanco para ajustar el cero. 4) En caso de que las lecturas presenten valores altos de absorbencia se puede diluir la mezcla final de reacción, en una proporción de 1 mL de solución con 5 mL de agua destilada, para proceder a leer los valores por tubo. El contenido de glucosa liberada en cada tubo de reacción se determinará mediante el uso de una curva de calibración de glucosa. II) Curva de calibración de glucosa. 1) Preparar una serie de 11 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: 2) Calentar los tubos en baño de agua a ebullición por 10 minutos. 3) Enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo del blanco para ajustar el cero. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 23 1.4.5. Resultados a reportar. • Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de glucosa. • Grafica de concentración de glucosa generada en función de la temperatura enzimática de reacción. • Temperatura optima de la enzima bajo estudio. 1.4.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.4.7. Bibliografía. Daniel, R.M., Danson, M.J., Eisenthal, R., Lee, C.K., Peterson, M.E., 2008. The effect of temperature on enzyme activity: new insights and their implications. Extremophiles 12 (1), 51-59. Daniel, R.M., Peterson, M.E, Danson, M.J., Price, N.C., Kelly, S.M., Monk, C.R., Weinberg, C.S., Oudshoorn, M.L., Lee,C.K., 2010. The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity. Biochemical Journal 425, 353–360. Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica Médica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formación Básica Disciplinaria. Academia de Bioquímica Médica I. Cinética enzimática. México, pp. 30-31, 56. Somero, G.N., 2004. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic ‘‘strategies”. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 139, 321–333. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.5. Página 24 Determinación de parámetros de cinética enzimática. 1.5.1. Introducción. El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Se evalúa la influencia de estos factores en la reacción catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en una reacción y el papel que juegan en la reacción enzimática, es decir, para predecir mecanismos de reacción. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. También es usual medir la actividad enzimática con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cómo las diferencias en actividad están relacionadas con la función y/o la fisiología del organismo del que proceden. El modelo clásico de Michaelis-Menten para explicar la cinética enzimática considera la unión de una enzima (E) con un sustrato (S) para formar un complejo enzima-sustrato (ES), el cual puede generar el producto (P) más la enzima (E) o disociarse para dar la enzima y el sustrato. Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una dependencia hiperbólica de la velocidad respecto a la concentración de sustrato, distinguiéndose 3 componentes en la curva. En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentración de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentración de sustrato, se duplica la velocidad (reacción de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que en la primera parte con el incremento de la concentración, iniciando alrededor de la ½ de la Vmax. La última parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la concentración de sustrato (reacción de orden cero), así la velocidad alcanzada es cercana a la máxima. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 25 Figura 5.1. Representación de la cinética de Michaelis-Menten. La ecuación de Michaelis- Menten expresa la relación matemática de la hipérbola cuadrática que existe entre las variables: En la ecuación de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v) y la concentración de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad teórica máxima de la reacción catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Los valores de Km y Vmax son característicos de una enzima, y se conocen como parámetros cinéticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción, la enzima es una proteína cuya estructura y carga eléctrica se modifican cuando los componentes de la solución cambian. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es graficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una línea recta, por lo que la interpolación es difícil. Otra manera para obtener los valores de Km y Vmax es la de utilizar Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 26 expresiones matemáticas que producen una línea recta como la de Lineaweaver-Burk, también denominada de dobles recíprocos, la cual se utiliza frecuentemente: Figura 5.2. Representación de Lineaweaver-Burk de la cinética de Michaelis-Menten. 1.5.2. Competencia. Investigar la cinética enzimática de una hidrolasa mediante el modelo de MichaelisMenten, para evaluar sus parámetros cinéticos y contrastar con los establecidos en la literatura, con un enfoque propositivo y compromiso. 1.5.3. Materiales y reactivos. 1.5.3.1. Materiales. Matraces Erlenmeyer 50 mL, pipetas graduadas de 1, 10 y 5 mL, pipeteros, vasos de precipitado 500 mL, bureta 25 mL, pinzas para bureta, soporte universal, piseta. 1.5.3.2. Instrumental. Baño de temperatura controlada. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.5.3.3. Página 27 Reactivos. Urea 0.01 M, solución de ureasa (2.5 mg/mL), CuCl2 2%, HCl 0.01M, solución de fenolftaleína 1%. 1.5.4. Metodología. 1) Preparar una serie de matraces de acuerdo a lo establecido en la siguiente tabla: Matraz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Urea 0.01M (ml) 0 5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 24 Agua (ml) 24 19 14 11.5 9 6.5 4 1.5 0 2) Colocar los matraces en un baño de agua a 40 C y esperar que alcancen la temperatura del mismo. 3) Añadir 1 ml de la solución de ureasa a cada matraz y esperar que transcurra la reacción enzimática durante 20 minutos. 4) Adicionar 1 ml de CuCl2 2% a cada matraz y agitar vigorosamente para suspender la actividad de la enzima. 5) Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.01N y fenolftaleína como indicador, hasta el vire de rosa a incoloro. 1.5.5. Resultados a reportar. • Velocidad de reacción enzimática en mEq de NH3/minuto. • Gráfica de Michaelis-Menten. • Gráfica de Lineweaver-Burk. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 28 • Valores de Km y Vmax de la enzima. 1.5.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.5.7. Bibliografía. Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 5: Enzyme Kinetics, p. 81-122. Grunwald, P., 1984. Imparting some biochemical fundamentals in the course of basic education of chemistry students with the system urease/urea as an example. Biochemical Education 12(4), 170-173. Minch, M.J., 1989. Experiments in Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey, pp. 164-167, 182-184. Sorensen, R., Novak, N., 1996. The use of Michaelis-Menten kinetics in cell biology and physiology teaching laboratories. Biochemical Education 24(1), 26-28. Tayyab, S., Qamar, S., 1992 A look into enzyme kinetics: some introductory experiments. Biochemical Education 20(2), 116-118. Bezerra, R.M.F., Dias, A.A., 2007. Utilization of integrated Michaelis-Menten equation to determine kinetic constants. Biochemistry and Molecular Biology Education 35 (2), 145– 150. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.6. Página 29 Determinación de carbohidratos totales. 1.6.1. Introducción. Los carbohidratos o sacáridos son compuestos de gran importancia para los seres vivos, los cuales son muy abundantes en la naturaleza. Las unidades básicas de los carbohidratos son los monosacáridos, los cuales no hidrolizables en unidades más pequeñas. La glucosa es el monosacárido, aldohexosa, es el combustible principal para la mayoría de los organismos. Los oligosacáridos contienen de dos a diez unidades de monosacáridos unidas covalentemente. Por su parte, los polisacáridos están constituidos por gran número de unidades de monosacáridos unidos covalentemente, los cuales pueden alcanzar pesos moleculares de hasta 106 daltons. Los polisacáridos desempeñan dos funciones biológicas principales: almacenar energía metabólica y aportar elementos estructurales a la célula. Monosacáridos como la glucosa y sus derivados, son piezas fundamentales en muchas rutas metabólicas esenciales para la obtención de energía. La glucosa actúa en el organismo como combustible energético de uso inmediato, mientras polisacáridos y grasas son biomoléculas de reserva que deben ser catabolizadas antes de su aprovechamiento como fuentes de energía. Los carbohidratos están ampliamente en organismos vegetales y animales con funciones metabólicas y estructurales. En los vegetales la glucosa es sintetizada por fotosíntesis a partir de CO2 y agua, y es almacenada como almidón o convertida en celulosa para formar parte de la pared celular. Los animales obtienen sus carbohidratos principalmente de fuentes vegetales, una forma de acumularlos es como glucógeno, pero en casos de deficiencia pueden sintetizar algunos como la glucosa a partir de fuentes de carbono derivadas de lípidos y proteínas. Es frecuente que durante la transformación o el aislamiento de los carbohidratos se requiere el cuantificar la cantidad total del producto obtenido. Un método para cuantificar el contenido de carbohidratos totales, el cual incluye a los reductores y no reductores, es mediante su reacción con un ácido fuerte y a alta temperatura, bajo estas condiciones ocurre una deshidratación simple y la catálisis ácida da como productos como furfural e hidroximetilfurfural que se reaccionan con compuestos como el fenol para producir compuestos coloridos. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 30 El método es simple, rápido, sensible a bajas concentraciones de carbohidratos (10 µg/mL) y genera resultados con una buena precisión (± 2%). Los reactivos son de bajo costo, el color producido es estable y la determinación no presenta interferencia con proteínas. Ya que la intensidad del color que se genera como producto final de la reacción varía de acuerdo al tipo carbohidrato, se debe seleccionar el estándar adecuado para una cuantificación precisa. La proporción de ácido sulfúrico, como fuente de calor, deberá ser la apropiada para favorecer que la reacción se complete. 1.6.2. Competencia. Evaluar el contenido de carbohidratos totales en una muestra biológica, para evaluar sus parámetros cinéticos y contrastar con los establecidos en la literatura, con un enfoque propositivo y compromiso. 1.6.3. Materiales y reactivos. 1.6.3.1. Materiales. Tubos de ensayo con tapón, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipetero, gradilla, piseta, celdas para espectrofotómetro, termómetro, vaso de precipitado 125 mL. 1.6.3.2. Instrumental. Baño de temperatura controlada, espectrofotómetro. 1.6.3.3. Reactivos. Fenol acuoso 5%, ácido sulfúrico concentrado. 1.6.4. Metodología. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 31 1) Preparar una solución acuosa de la muestra, el contenido de los carbohidratos deberá estar en el intervalo de sensibilidad del método (10-100μg/mL). 2) En tubos de ensaye etiquetados colocar 0.5 mL de la solución de la muestra. 3) Adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución de fenol al 5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de ácido sulfúrico concentrado y homogeneizar. 4) Calentar los tubos en baño de agua a 90 C por 15 minutos. 5) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia a 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua. 6) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrón preparada con el carbohidrato de interés en el intervalo del método (10-100 μg de glucosa/mL), tratada de la misma manera que el problema. 1.6.5. Resultados a reportar. • Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de glucosa. • Contenido de carbohidratos totales en la muestra analizada. 1.6.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.6.7. Bibliografía. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 32 Fournier, E., 2001. Colorimetric quantification of carbohydrates. Current Protocols in Food Analytical Chemistry E1.1.1-E1.1.3. Kochert, G., 1978. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric acid method. En: Hellebust. J.A., Craigie, J.S., (eds.), Handbook of Phycological Methods. Physiological & Biochemical Methods. Cambridge University Press, New York, pp. 95-97. Masuoka, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S.I., Lee, Y.C., 2005. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry 339, 69-72. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.7. Página 33 Aislamiento y cuantificación de glucógeno. 1.7.1. Introducción. Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como almidón, en los animales se presentan en forma de glucógeno. El glucógeno es una biomolécula que está conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α(1-4) con ramificaciones mediante enlaces α(1-6). El glicógeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales. El depósito principal de glicógeno son el hígado (de 2 a 5%) y los músculos (de 0.5 a 2%), en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el organismo. En situación de inanición, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del glucógeno está asociado al nivel de la glucosa sanguínea, durante una buena alimentación se presenta su síntesis o glucogenogénesis, en condiciones de ayuno ocurre su degradación o glucogenólisis El glucógeno del músculo esquelético tiene como finalidad suministrar glucosa para que sea degradada oxidativamente y se pueda obtener ATP para la actividad muscular. En contraste, el glucógeno hepático sirve como fuente de glucosa Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 34 para los tejidos extrahepáticos, incluido el músculo esquelético, ante un descenso de la glucemia. Una vez agotado el suministro de glucosa vía glucogenólisis y para cubrir requerimientos tejidos del organismo la ruta para síntesis de glucosa es a través de la gluconeogénesis, la cual procede a partir de sustancias distintas a los carbohidratos, tales como aminoácidos y lactato glicerol. La extracción del glucógeno de tejidos, como el hígado, se realiza mediante un proceso de homogenización y ruptura celular, así como la extracción y la eliminación de las proteínas para evitar interferencias en el análisis posterior del polisacárido. 1.7.2. Competencia. Determinar el contenido de glucógeno en tejidos de un animal acuático, para estimar su capacidad de almacenamiento y relacionar con su función metabólica, con organización y compromiso. 1.7.3. Materiales y reactivos. 1.7.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, homogeneizador manual, tubos de ensaye, pipetas volumétricas de 1 y 5 mL, pipeteros, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotómetro. 1.7.3.2. Instrumental. Balanza analítica, baño de temperatura controlada, centrifuga, espectrofotómetro. 1.7.3.3. Reactivos. KOH acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4 concentrado. 1.7.4. Metodología. 1) A partir de peces recién sacrificados obtener muestras de hígado y musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hígado y 2 g de músculo. 2) Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de KOH al 30%. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 35 3) Calentar los homogenizados en un baño de agua a ebullición por 15 minutos, agitar ocasionalmente. 4) Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye. 5) Tomar 0.1 ml del sobrenadante y añadir 3 mL de etanol y 0.1 ml de K2SO4 al 10%, agitar. 6) Reposar los tubos con la mezcla en baño de hielo por 5 minutos. 7) Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y separar el glucógeno precipitado. 8) Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua. 9) Colocar en dos tubos de ensaye alícuotas de 0.5 mL de la solución de glucógeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución de fenol al 5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de ácido sulfúrico concentrado y homogeneizar. 10) Calentar los tubos en baño de agua a 90 C por 15 minutos 11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua destilada. 12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrón preparada con glucógeno en el intervalo de sensibilidad del método colorimétrico. 1.7.5. Resultados a reportar. • Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de glucógeno. • Contenido de glucógeno (mg/g) en los tejidos analizados. 1.7.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 36 1.7.7. Bibliografía. Dalrymple, R. H., Hamm, R., 1973. A method for the extraction of glycogen and metabolites from a single muscle sample. International Journal of Food Science & Technology 8 (4), 439–444. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356. Moraes, G., Choudhuri, J. V., Souza, R. H. S., Neto, C. S., 2004. Metabolic effects of exercise in the golden fish Salminus maxillosus "dourado" (Valenciennes, 1849). Brazilian Journal of Biology 64(3B), 655-660. Ojea, J., Martínez, D., Novoa, S., Pazos, A. J., Abad, M., 2002. Contenido y distribución de glucógeno en relación con el ciclo gametogénico de Ruditapes decussatus (L., 1758) en una población natural de las lagunas de Baldaio (Galicia, noroeste de España). Boletín Instituto Español de Oceanografía 18 (1-4), 307-313. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.8. Página 37 Extracción y cuantificación de lípidos. 1.8.1. Introducción. A diferencia de otras biomoléculas los lípidos son un grupo heterogéneo que no poseen un grupo funcional característico. Los lípidos son sustancias presentes en tejidos animales y vegetales que comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos no polares, como benceno, hexano y cloroformo, éter, con escasa o nula solubilidad en agua. Como consecuencia de ello, el término lípido abarca a un gran número de compuestos orgánicos con estructuras muy diversas; no obstante, poseen algo en común, la parte principal de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y ésta es la razón de su carácter hidrófobo. En general los lípidos pueden ser clasificados de acuerdo a sus propiedades en dos grupos: No polares o lípidos neutros, los cuales comprenden triacilglicéridos, diacilglicéridos, ceras, esteroles, terpenos; polares integrados por fosfolípidos y glucolípidos. Los lípidos son una fuente muy importante de energía metabólica los cuales aportan 9.5 kcal/g, en contraste con carbohidratos y proteínas, que generan 4.1 y 5.6 kcal/g, respectivamente. Los triacilglicéridos son los lípidos más abundantes en la naturaleza, en tanto que los fosfolípidos son constituyentes principales de membranas celulares. Triacilglicérido Fosfolípido R1, R2, R3: ácidos grasos; X: hidrógeno o radical (p.ej. etanolamina, colina, serina, glicerol, mio-inositol) Los lípidos pueden ser utilizados por los organismos animales como una fuente de energía, a través del metabolismo oxidativo de ácidos grasos, de igual forma pueden aportar ácidos grasos esenciales. Por presentar un estado de oxidación más reducido con relación a carbohidratos o proteínas proporcionan mayor energía al oxidarse. Los lípidos son componentes de reserva y estructurales de las células, aportan ácidos grasos insaturados para el mantenimiento e integridad de membranas celulares, participan el Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 38 transporte de lipídico (v. gr. fosfolípidos, actúan como agentes emulsificantes) y son precursores de hormonas (p. ej. el ácido araquidónico, 20:4n-6, es precursor de prostaglandinas). En animales marinos los lípidos muestran importancia en la boyancia, debido a su baja densidad y al volumen que ocupan sin requerir osmoregulación, mantenimiento de estructura corporal (v. gr. la presencia de ácidos grasos de la serie n-3 permite retener la fluidez de la membrana celular a bajas temperaturas) y en osmoregulación (integran un espacio osmóticamente inactivo que no requiere gasto de energía). Los lípidos son requeridos como fuente de energía y en el aporte de lípidos polares necesarios en la formación de membranas celulares. Este carácter dual es reflejado en la compartamentalización de los lípidos corporales en tejido adiposo, integrado fundamentalmente por triglicéridos, y lípidos de membranas celulares compuestos por lípidos polares y colesterol. Un procedimiento para la determinación de lípidos a partir de muestras animales o vegetales se basa en la digestión de la muestra en ácido concentrado que hidroliza y disuelve componentes proteicos, en tanto que los lípidos que se separan puede ser extraídos mediante el uso de solventes orgánicos no polares, como una mezcla de éter etílico-éter de petróleo. 1.8.2. Competencia. Extraer y cuantificar el contenido de lípidos en tejidos de un organismo acuático, para evaluar su relación con la función metabólica tisular, con compromiso y disciplina. 1.8.3. Materiales y reactivos. 1.8.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, termómetro, pipetas Pasteur, vaso de precipitado de 5 mL, desecador. 1.8.3.2. Instrumental. Balanza analítica, baño de temperatura controlada, centrifuga, plancha de calentamiento, estufa de convección. 1.8.3.3. Reactivos. HCl 6M, metanol, éter de petróleo, NaCl 30%. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 39 1.8.4. Metodología. 1) Pesar 1 g de una muestra picada de un tejido o alimento y colocarla en un tubo de ensayo con tapón, adicionar 5 mL HCl 6M y 5 mL de metanol, mezclar y tapar los tubos. Efectuar la determinación por triplicado. 2) Calentar en baño de agua a 70 C por 30 minutos. 3) Enfriar el digerido a temperatura ambiente y adicionar 10 mL de éter de petróleo, agitar, añadir 5 ml de NaCl 30%, reposar y centrifugar la mezcla (3000 rpm, 10 min.) para separar la capa orgánica con el extracto lipídico. 4) Remover con pipeta Pasteur la capa de éter con el extracto lipídico y colocarla en un tubo de ensayo limpio y seco. 5) Medir un volumen conocido (5 mL) de la solución del extracto y colocarlo en un vaso de precipitado o vial de 10 mL a peso constante, evaporar el solvente a 60 C en la campana de extracción. Colocar el recipiente + extracto de lípidos en estufa de convección a 60 C hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar los lípidos. % Lípidos = (Peso del extracto /peso de muestra*) x 100 * Peso de muestra correspondiente al volumen evaporado del extracto. 1.8.5. Resultados a reportar. • Contenido de lípidos (g/100 g) en los tejidos analizados. • Contenido de lípidos que se reportan en la literatura para el tipo de muestra analizada. 1.8.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 40 1.8.7. Bibliografía. AOAC, 1990. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. Chapter 35: Fish and Other Marine Products. 948.15 Fat (crude) in seafood. Acid hydrolysis method. 15th edition. Arlington, Virginia, p. 871. Aveldaño, M.I., Horrocks, L.A., 1983. Quantitative release of fatty acids from lipids by a simple hydrolysis procedure. Journal of Lipid Research 24, 1101-1105. Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Alimentos y Bebidas no Alcohólicas con Modificaciones en su Composición. Especificaciones Nutrimentales. Secretaría de Salud, México. Diario Oficial de la Federación 26 de junio de 1996. Apéndice Normativo C. Determinación de grasa. 1.1.3.1. Por hidrólisis ácida. Robinson, J.E., Singh, R., Kays, S.E., 2008. Evaluation of an automated hydrolysis and extraction method for quantification of total fat, lipid classes and trans fat in cereal products. Food Chemistry 107, 1144–1150. Serwata, R.D., 2007. Nutritional evaluation of rendered animal by- products and blends as suitable partial alternatives for fish meal in diets for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Thesis MPhil, University of Stirling, Stirling, Scotland. Chapter 2: General materials and methods. 2.9.1. Determination of total lipid, p. 59. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.9. Página 41 Determinación de fosfoglicéridos. 1.9.1. Introducción. La principal clase de fosfolípidos que existe en la naturaleza son los fosfoglicéridos, se le encuentra como componentes esenciales de las membranas biológicas. Estos son lípidos con grupos de cabeza que contienen fosfato. Se encuentran conformados por glicerol, polialcohol de tres carbonos, con dos enlaces acilo de ácidos grasos unidos en la posiciones 1 y 2 del glicerol y un grupo fosfato esterificado en el tercer hidroxilo el cuál a su vez se encuentra unido a grupo sustituyente, el cual dependiendo de su naturaleza que da nombre al tipo de fosfoglicérido. Estructura general de un fosfoglicérido Los diferentes fosfoglicéridos difieren en el tamaño, forma y carga eléctrica de los grupos (X) de la cabeza polar. A su vez, cada tipo de fosfoglicérido puede presentarse en especies químicas distintas que se diferencian en los grupos acilos asociados a los ácidos grasos (parte apolar). Comúnmente hay un grupo acilo saturado y otro insaturado, se presenta una cabeza polar (grupo X) y una cola apolar (cadena hidrocarbonada), lo cual les confiere a las moléculas una naturaleza anfipática con un extremo hidrofílico y otro hidrófobo. Esta característica estructural posee una gran importancia en la estructura celular ya que los fosfoglicéridos pueden agruparse al interaccionar las partes apolares, dando lugar a estructuras más complejas como las membranas biológicas celulares. Tipos de fosfoglicéridos: Fosfatidilcolina (PC) Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 42 Fosfatidiletanolamina (PE) Fosfatidilserina (PS) Fosfatidilinositol (PI) Fosfatidilglicerol (PG) Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 43 Fosfatidildiglicerol (DPG) Los fosfoglicéridos más abundantes en las membranas de las células de animales y de plantas superiores son la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilcolina, mientras que el fosfatidilglicerol y el difosfatidilglicerol son más frecuentes en membranas bacterianas. Un método utilizado con frecuencia para el análisis de fosfolípidos es la cromatografía de capa fina, en la cual es posible separarlos mediante la participación de estos entre la fase estacionaria polar y la fase móvil de baja polaridad del solvente. El tipo de sistema de solventes utilizado determina el patrón de separación de los lípidos bajo estudio. 1.9.2. Competencia. Determinar los tipos principales de fosfoglicéridos presentes en tejidos de un organismo acuático, para evaluar su relación con características tisulares estructurales, con compromiso y disciplina. 1.9.3. Materiales y reactivos. 1.9.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, mortero, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, tubos de ensaye con tapón, pipetas Pasteur, placa de vidrio, micropipetas, cuba cromatográfica, regla. 1.9.3.2. Instrumental. Balanza analítica, centrifuga, estufa de convección. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.9.3.3. Página 44 Reactivos. Mezcla de cloroformo-metanol-ácido clorhídrico (20:10:0.1 v/v), HCl 1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo:metanol: ácido acético:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v, cristales de yodo. 1.9.4. Metodología. 1) Disecar peces recién sacrificados y obtener muestras de hígado. 2) Homogeneizar 2 g de hígado, en un mortero con 10 mL con una mezcla de cloroformo-metanol-ácido clorhídrico (20:10:0.1 v/v) por 10 minutos. 3) Adicionar 3 mL de HCl 1N y mezclar, centrifugar 2000 rpm por 10 minutos. 4) Descartar la fase metanólica (superior), con el uso de una pipeta Pasteur remover la fase clorofórmica inferior y transferirla a un tubo de ensaye. 5) Adicionar 0.5 mL de la fase clorofórmica en un tubo de ensaye y agregar 0.5 mL de cloroformo. 6) Mediante una micropipeta aplicar una 1 gota de la dilución en 3 puntos equidistantes en una placa de silica gel previamente preparada (suspensión de 25 g silicagel/50 mL de agua destilada, secado al aire, activación a 100 C por 30 min.), a 2 cm de altura de la base. Evaporar el cloroformo en la campana de extracción. 7) Colocar la placa en una cuba cromatográfica saturada que contenga como fase móvil el sistema de solventes cloroformo:metanol: ácido acético:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v). 8) Desarrollar el cromatograma hasta que el solvente alcance 1 cm antes del borde superior de la placa, remover esta de la cubeta y secar a temperatura ambiente en la campana de extracción. 9) Revelado: Colocar las placas en un recipiente que contenga cristales de yodo, tapar y dejarlas hasta observar marchas color marrón-amarillas bien definidas. El yodo forma complejos moleculares reversibles por adición a los dobles enlaces C=C de los ácidos grasos componentes de los lípidos, lo cual permite su visualización. 10) Retirar la placa y marcar con lápiz las manchas observadas ya que el yodo se evapora y la mancha desaparece. Calcular los Rf para cada mancha y compararlos con los Rf esperados para el sistema de solventes utilizado. Rf Dr. Eduardo Durazo Beltrán dist(cm) recorrida soluto dist(cm) recorrida solvente Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 45 1.9.5. Resultados a reportar. • Valores de Rf de los compuestos separados mediante la cromatografía. • Tipos de fosfolípidos identificados en la muestra de lípidos del tejido analizado. 1.9.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.9.7. Bibliografía. Fried, B., 2003. Lipids. En: Sherma, J. Fried, B. (eds.), Handbook of Thin-Layer Chromatography. 3rd edition. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 826-875. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 46 Holub, B., Skeaff, C.M., 1987. Nutritional regulation of cellular phosphatidylinositol. En: Conn, P.M., Means, A.R. (eds.), Methods in Enzymology, Volume 141. Academic Press, Orlando, pp. 234-244. Muciño Hidalgo, C. A., Sámano Nájera, J.B., 2008. Manual de prácticas de bioquímica metabólica. Universidad Autónoma del Estado de México, Facultad de Química. Práctica No 2: Separación de fosfolípidos por cromatografía en capa fina. México, pp. 17-19. Parker, F., Peterson, N. F., 1965. Quantitative analysis of phospholipids and phospholipid fatty acids from silica gel thin-layer chromatograms. Journal of Lipid Research 65, 455-460. Peterson, B.L., Cummings, B.S., 2006. A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples. Biomedical Chromatography 20, 227–243. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.10. Página 47 Extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos. 1.10.1. Introducción. Los pigmentos fotosintéticos (clorofilas, carotenoides, etc.) son fundamentales para transformar la energía lumínica en energía química, por medio de la fotosíntesis. En plantas superiores se encuentra, en su mayoría, la clorofila a (PM=893.4) y en menor proporción la clorofila b (PM=907.4). La relación entre ambas depende de las condiciones ambientales y de crecimiento. Una relación (a/b) de 3-4 se espera en plantas que han crecido bajo altas intensidades de luz y una relación de 2.5-3 se espera en plantas que han crecido con poca luz (sombra). La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se conocen al menos siete tipos) se encuentran en los sustituyentes que presentan; la clorofila a (verde azulada) presenta un grupo metilo (CH3) en el carbono 3, y la clorofila b (verde amarillenta) contiene un grupo aldehído (CHO) en la misma posición. Estructura de la clorofila a y b Los carotenoides, por su parte, pueden dividirse en dos grupos: (a) Carotenoides sin oxígeno como los -carotenos; (b) Carotenoides que contienen oxígeno, denominados xantofilas. Entre las xantofilas se encuentran la violaxantina, anteraxantina, zeaxantina, entre otras. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] Página 48 Los pigmentos vegetales en base a su solubilidad pueden dividirse en dos grandes grupos: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo vacuolar; b) Solubles en solventes orgánicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo, naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y tilacoides de los cloroplastos. Son los responsables de la captación de la energía luminosa en el proceso de la fotosíntesis. Las clorofilas poseen unas estructura porfirínica, formada por cuatro anillos pirrólicos con un átomo de magnesio en su centro, un anillo de ciclopentanona y un éster de fitol unido a uno de los anillos de pirrol que provee a la molécula de una cola lipófila. Existen plantas que contienen solamente clorofila a, como las algas azules, las diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas contienen en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e), fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus respectivos colores a las algas. Las clorofilas tienen típicamente dos picos de absorción en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media del espectro, correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta característica origina que las clorofilas presenten un color verde, el cual se asocia con organismos o tejidos que contienen cloroplastos activos en sus células. Espectro de absorción de la clorofila a y b Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.10.2. Página 49 Competencia. Analizar el tipo y contenido de pigmentos fotosintéticos presentes en un vegetal acuático, para estimar la relación con funciones metabólicas del organismo de estudio, con organización y compromiso. 1.10.3. Materiales y reactivos. 1.10.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, mortero, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, tubos de ensaye con tapón, pipetas Pasteur, placa de vidrio, micropipetas, cuba cromatográfica, regla. 1.10.3.2. Instrumental. Balanza analítica, centrifuga, estufa de convección. 1.10.3.3. Reactivos. Mezcla de cloroformo-metanol-ácido clorhídrico (20:10:0.1 v/v), HCl 1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo-metanol-ácido acético-H2O (50:37.5:3.5:2 v/v), cristales de yodo. 1.10.4. Metodología. 1) Pesar 1 gramo de un vegetal fresco y macerar en un mortero con arena calcinada hasta obtener una pasta homogénea. 2) Añadir 15 mL de acetona y mezclar al abrigo de la luz durante 5 minutos, enseguida filtrar a través de papel filtro para remover sólidos de la solución con pigmentos. 3) Centrifugar el filtrado a 3000 rpm durante 5 min para separar los restos de arena y partículas en suspensión. 4) Medir el volumen del sobrenadante, tomar 1 mL en un tubo de ensayo y diluir con 4 mL de acetona. 5) Medir el espectro de absorbancia de la solución en el intervalo de 380 a 700 nm. 6) Estimar el contenido de clorofila a en el tejido midiendo la absorbencia (A) a 663 nm y mediante el uso de la siguiente ecuación: Clorofila a (mg/g peso fresco) = A x 11.9 mg/L x (volumen total del extracto/g de muestra) Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD I] 1.10.5. Página 50 Resultados a reportar. • Espectro de absorción del extracto con pigmentos del vegetal. • Tipo de pigmentos identificados en la muestra analizada. • Contenido de clorofila a por g de peso fresco del vegetal. 1.10.6. Método de evaluación. Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 1.10.7. Bibliografía. Dawes, C.J., 1991. Botánica Marina. Editorial Limusa, Mexico, D.F., pp. 421-429. Dunn, J.L., Turnbull, J.D., Robinson, S.A., 2004. Comparison of solvent regimes for the extraction of photosynthetic pigments from leaves of higher plants. Functional Plant Biology 31, 195-202. Hagerthey, S.E., Louda, J.W., Mongkronsri, P., 2006. Evaluation of pigment extraction methods and a recommended protocol for periphyton chlorophyll a determination and chemotaxonomic assessment. Journal of Phycology 42, 1125-1136. Schagerl, M., Künzl ,G., 2007. Chlorophyll a extraction from freshwater algae – a reevaluation. Biologia 62(3), 270-275. Vicente, E., De Hoyos, C., Sánchez, P., Cambra, J., 2005. Protocolos para el muestreo y análisis para fitoplancton. Ministerio de Medio Ambiente, Confederación Hidrográfica del Ebro, Zaragoza, pp. 25-27. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC 2. METABOLISMO Analizar cambios bioquímicos asociados a procesos biológicos lo cual permita para desarrollar una visión general de rutas metabólicas centrales. Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] 2.1. Página 52 Oxidación biológica y transporte de electrones. 2.1.1. Introducción. Los organismos animales son heterótrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia energía, como lo hacen las plantas en la fotosíntesis, sino que deben ingerir esa energía en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante su oxidación mediante una serie de reacciones bioquímicas. La oxidación de los compuestos orgánicos se asocia a la ganancia de oxígeno, perdida de hidrógeno o perdida de electrones; en tanto que la reducción implica pérdida de oxígeno, ganancia de electrones o ganancia de hidrógeno. Las principales fuentes de energía para los animales son los carbohidratos, lípidos y proteínas, el metabolismo energético de estos compuestos incluye reacciones como la glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las células oxidan los compuestos orgánicos para generar ATP, necesario para su trabajo útil. Es en la mitocondria donde se llevan a cabo las reacciones oxidativas para la obtención de energía. En la mitocondria se halla un conjunto de enzimas que hacen posible la oxidación de los metabolitos en el ciclo de Krebs del cual se derivan electrones hacia la cadena respiratoria, la cual se efectúa en la membrana interna de la mitocondria donde ocurre un transporte de electrones para formar como producto final H2O. Reacciones de la cadena respiratoria La generación de ATP en la mitocondria a través de la fosforilación oxidativa es el resultado de la transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 al oxígeno. Los pares de electrones derivados de los intermediarios del ciclo de Krebs fluyen a lo largo de una cadena de varios eslabones, constituidos por enzimas de transporte electrónico, Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 53 con niveles de energía sucesivamente inferiores hasta reducir al oxígeno molecular, que es el último aceptor electrónico, en la respiración. Durante este proceso se conserva gran parte de la energía libre de estos electrones en forma de energía del enlace fosfato del ATP; el proceso se le denomina fosforilación oxidativa. Una forma de estudiar la producción de energía por parte de la mitocondria, la cual implica el transporte de electrones a lo largo de una cadena de reacciones, es mediante la oxidación de un sustrato como el succinato y el uso de un compuesto químico colorido aceptor de electrones, con el cual pueda estimarse la velocidad de transferencia de dichos electrones con la perdida de color del compuesto. Un aceptor artificial de electrones es el ferrocianuro de potasio, esta sustancia es de color amarillo y a medida que capta electrones se decolora y adquiere una tonalidad más pálida. El proceso de cambio de color en una solución de ferrocianuro por efecto de la cantidad de electrones aceptados como resultado de la oxidación del succinato se puede evaluar mediante uso de espectrofotometría en el intervalo del espectro visible. 2.1.2. Competencia. Analizar la oxidación de un sustrato orgánico y el transporte de electrones presentes en el tejido de un animal acuático, para estimar la capacidad biológica para producir energía, con disciplina y dedicación. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 54 2.1.3. Materiales y reactivos. 2.1.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 1 y 25 mL, embudo de vidrio, tubos de ensaye con tapón, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipeteros, gradilla, pipetas Pasteur, vasos de precipitado 250 mL, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotómetro, papel filtro. 2.1.3.2. Instrumental. Balanza analítica, plancha de calentamiento, centrifuga, espectrofotómetro. 2.1.3.3. Reactivos. Buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), succinato de sodio 0.01M (en buffer de fosfatos), malonato de sodio 0.01M (en buffer de fosfatos), cianuro de potasio 0.01M, ferrocianuro de potasio 0.01M, ácido tricloroacético 10%. 2.1.4. Desarrollo 1) Disecar peces recién sacrificados y obtener muestras de corazón. 2) Picar finamente las muestras y pesar 1 g de tejido y colocarlo en 19 mL de buffer de fosfatos frío. 3. Homogeneizar la muestra mediante un homogeneizador manual de tubo con embolo en un baño de hielo durante un 1 minuto. 4. Filtrar a través de una capa de gasa fina o papel filtro de poro abierto y separar el filtrado, colocar este en un baño de agua con hielo. 5. Numerar 3 series tubos de ensayo por triplicado y proceder de acuerdo a la siguiente tabla: Solución Buffer de fosfatos pH 7.4 Succinato de sodio 0.01M Malonato de sodio 0.01M Extracto del tejido Cianuro de potasio Dr. Eduardo Durazo Beltrán Serie 1 3 mL Serie 2 2 mL 1 mL 1 mL 1 gota (0.06 mL) 1 mL 1 gota (0.06 mL) Serie 3 1.9 mL 1 mL 0.1 mL 1 mL 1 gota (0.06 mL) Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 55 6. Colocar los tubos en un baño de agua a 37 C por 5 minutos. 7. Añadir a cada tubo 1 mL de ferrocianuro de potasio 0.01 M y reposar por 10 minutos. 8. Adicionar 5 mL de ácido tricloroacético a cada tubo y mezclar en forma homogénea. 9. Centrifugar los tubos a 2000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante obtenido. 10. Leer la absorbencia de las soluciones a 420 nm. Ajustar la absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga únicamente solución buffer. 11. Calculo del contenido de micromoles de ferrocianuro contenidas en cada serie de reacción: M Ferrocianuro = A/E*L= A/(1x10-3 mol-1 cm-1)*1 cm A: absorbencia; E: coeficiente de extinción molar del ferrocianuro; L: longitud de la celda de lectura. 2.1.5. Resultados a reportar. • Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos sin succinato. • Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos con succinato. • Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos con malonato. • Micromoles de succinato oxidadas. 2.1.6. Método de Evaluación Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 56 2.1.7. Bibliografía Devlin, T.M., 2004. Bioquímica. 4ª edición. Editorial Reverté, S.A., Barcelona, pp. 566575. Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 10: Electron Transport and Oxidative Phosphorylation, p. 223-238. Hatefi, Y., 1985. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annual Review of Biochemistry 54, 1015-1069. Martínez Montes, J.M., 2011. Practica de bioquímica para veterinaria No 10. Oxidación mitocondrial del succinato [en línea, fecha de consulta: 18 julio 2013]. Disponible en: http://practicasdebioqumica.blogspot.mx/2010/11/practica-de-bioquimica-paraveterinaria.html Quaciliariello, E. & Palmieri, P., 1968. Control of succinate oxidation by succinateuptake by rat-liver mitochondria. European Journal of Biochemistry 4, 20-27. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] 2.2. Página 57 Actividad oxidativa de lactato deshidrogenasa. 2.2.1. Introducción La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima citoplasmática que se encuentra en forma soluble o ligada a membrana, se presenta ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos, la cual cataliza la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también se encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y en mucho menor concentración en páncreas y pulmón. A pH 7.3 – 7.8 el equilibrio de la reacción está desplazado hacia el lactato, pero a pH más alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato; la reacción puede ocurrir en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la concentración de los sustratos que se encuentren presentes. Presenta un papel importante en el metabolismo de carbohidratos, interviniendo en el último paso de la glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeogénesis a partir de lactato. Además, aporta combustible al ciclo de Krebs en tejidos consumidores de lactato como el músculo cardiaco. La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre otros α-ceto o α-hidroxiácidos estructuralmente similares al pirúvico, como el α-cetobutírico. De igual forma, puede utilizar también el NADPH, como coenzima, aunque las velocidad de reacción es mucho menor con relación al NADH. Su peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un tetrámero dispuesto tetraédricamente, en el que las subunidades van unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Existen dos tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles dan lugar a cinco formas moleculares (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5) con actividad lactato deshidrogénica y con características cinéticas y fisicoquímicas diferentes, que se han denominado isoenzimas. En mamíferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporción que utiliza cada órgano como fuente de combustible es variable. Durante una actividad física el requerimiento energético del músculo esquelético y el corazón aumenta considerablemente. En los dos primeros minutos de esta actividad el miocardio obtiene esa energía a partir de glucosa tanto sanguínea como de sus propias reservas de glucógeno, y aunque el consumo de oxígeno aumenta unas cuatro veces, un 50% del Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 58 piruvato formado se convierte en lactato (participación de la LDH1 y LDH2), Este cambio metabólico temporal le permite al corazón obtener la energía necesaria hasta que adapte su metabolismo para lograr un incremento en el consumo de ácidos grasos. El músculo esquelético utiliza (en los primeros segundos) la energía almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la degradación del glucógeno muscular para aportar glucosa como fuente de energía. Aunque en este tejido durante una actividad intensa el consumo de oxígeno aumenta unas veinte veces, gran parte del piruvato formado se convierte en lactato (participación de la LDH5 y LDH4). Este cambio metabólico le permite a este órgano obtener energía extra utilizando la glucólisis anaeróbica. El cambio de piruvato a lactato es una vía de recuperación de NAD + para que la glucólisis continúe. La mayor parte del lactato formado en esta etapa es recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en el hígado mediante un proceso que requiere el aporte de energía (Ciclo de Cori). Aquí la oxidación de lactato a piruvato es favorecida por la baja relación NADH/NAD+ y la escasa presencia de piruvato intracelular. La LDH es una enzima cercana al equilibrio, regulada por la razón NADH/NAD+ y por presentar formas isoenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición por sustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación de un complejo NAD-piruvato que compite con el NADH por el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo tricarboxílico: oxalacetato y citrato. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 59 2.2.2. Competencia. Evaluar la capacidad redox de la enzima lactato deshidrogenasa de musculo esquelético e hígado de un animal acuático, para estimar su relación con el metabolismo tisular de carbohidratos, con organización y disciplina. 2.2.3. Materiales y reactivos. 2.2.3.1. Materiales. Estuche de disección, espátula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 5 y 1 mL, tubos de ensaye, micropipetas, pipeteros, gradilla, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotómetro. 2.2.3.2. Instrumental. Balanza analítica, centrifuga refrigerada, espectrofotómetro. 2.2.3.3. Reactivos. Sacarosa 0.25M, buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), NADH 3.5 mM, piruvato de sodio 21 mM. 2.2.4. Desarrollo. 1) Disecar peces recién sacrificados y obtener muestras de hígado y músculo. 2) Homogenizar 1 g de cada muestra en 10 mL de solución de sacarosa 0.25 M fría. 3) Centrifugar a 15,800 rpm durante 20 minutos en centrífuga refrigerada. 4) Separar el sobrenadante y diluirlo en una relación 1:50 con sacarosa 0.25 M. 5) Preparar series de tubos por duplicado de acuerdo con la siguiente tabla: Solución Buffer de fosfatos pH 7.4 NADH 3.5 mM Extracto del tejido Dr. Eduardo Durazo Beltrán Serie 1 2.8 mL 0.1 mL Serie 2 2 mL 0.1 mL 1 mL Serie 3 2 mL 0.1 mL 1 mL Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 60 6) Adicionar 0.1 mL de piruvato de sodio 21 mM a cada tubo y leer la absorbencia a 340 nm cada 30 segundos durante un intervalo de 10 minutos. 7) Calcular la actividad específica de la enzima, en µM/ min x g de tejido, con base en los valores de absorbencia (A) registrados y de acuerdo a la siguiente expresión: A = x c x l = Coeficiente de extinción del NAD+ = 6.22 cm-1 mM-1; c: concentración en moles/L; l: longitud en cm de la celda de lectura. 2.2.5. Resultados a reportar. • Valores y gráfica de absorbencia contra tiempo de la oxidación del NADH. • Actividad específica de la enzima lactato deshidrogenasa en cada tejido. 2.2.6. Método de Evaluación Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 2.2.7. Bibliografía Crabtree, B., Newsholme, E. A., 1972. The activities of phosphorylase, hexokinase, phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and the glycerol 3-phosphate dehydrogenases in muscles from vertebrates and invertebrates. Biochemical Journal 126, 49-58 Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 8: Carbohydrate Metabolism A: Glycolysis and Gluconeogenesis, pp. 163-204. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 61 Živadinović, D., Nikčević, M., 2010. Kinetic properties of lactate dehydrogenase from trout muscle. Archives of Biological Sciences, Belgrade, 62 (2), 297-300. Sensabaugh, G.F., Nathan, O., 1972. Liver of gadoid fish lactate dehydrogenase specific to the liver of gadoid fish. Journal of Biological Chemistry 247, 585-593. Tseng, Y.-C., Lee, J.-R., Chang, J. C.-H., Kuo, C.-H., Lee, S.-J., Hwang, P.-P., 2008. Regulation of lactate dehydrogenase in tilapia (Oreochromis mossambicus) gills during acclimation to salinity challenge. Zoological Studies 47(4), 473-480. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] 2.3. Página 62 Capacidad metabólica celular y actividad de citocromo oxidasa. 2.3.1. Introducción La citocromo C-oxidasa es un enzima que está presente en todos los organismos aerobios, la cual en la cadena respiratoria cataliza la transferencia de electrones al oxígeno como último aceptor de electrones para formar agua. La citocromo oxidasa conforma el Complejo IV dentro de los complejos de transportadores y proteínas que integran la cadena respiratoria, el cual cataliza la formación de H2O a partir de 2e-, ½O y 2H+. Este complejo contribuye con la generación de un gradiente de protones para generar un ATP. La reducción del oxígeno para generar agua permite liberar energía por flujo de electrones el cual favorece la fosforilación de ADP a ATP, este proceso se denomina fosforilación oxidativa y tiene lugar en la membrana interna de la mitocondria. La citocromo oxidasa cataliza la transferencia de electrones del citocromo C al oxígeno para formar agua de acuerdo a la siguiente redacción: 4Citocromo c (Fe+2) + 4H+ + O2 Dr. Eduardo Durazo Beltrán 4Citocromo c (Fe+3) + 2H2O Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 63 La actividad de la citocromo oxidasa se puede determinar mediante el uso de dimetilpara-fenilendiamina, indicador de reducción-oxidación, compuesto que al ser oxidado y en presencia de -naftol genera un cromóforo colorido denominado azul de indofenol. 2.3.2. Competencia Evaluar la capacidad de oxidación de la citocromo oxidasa de corazón e hígado de un animal acuático, para estimar su relación con la capacidad metabólica celular del tejido, con voluntad y disposición. 2.3.3. Material 2.3.3.1. Materiales Estuche de disección, espátula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 10, 2 y 1 mL, tubos de ensaye, pipeteros, gradilla, tubos de centrifuga, cronometro. 2.3.3.2. Instrumental Balanza analítica, centrifuga refrigerada, baño de temperatura controlada. 2.3.3.3. Reactivos KCl 0.15M, -Naftol 0.15% en etanol 10%, dimetil-para-fenilendiamina 0.15%, KCN 0.01%. 2.3.4. Desarrollo I) Separación de fracciones. 1) Disecar peces recién sacrificados y remover el hígado y el corazón. 2) Pesar los órganos extraídos y mantenerlos en baño de hielo. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 64 3) Picar finamente las muestras y preparar un homogeneizado por tejido con 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo de tejido. 4) Centrifugar el homogeneizado en frio, a 500 rpm por 15 minutos. 5) Decantar el sobrenadante en un recipiente limpio y frío y desechar el residuo. 6) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 3000 rpm por 15 minutos. 7) Separar el sobrenadante en un recipiente limpio y frio y etiquetar como "sobrenadante de hígado" o “sobrenadante de corazón” según corresponda. De igual forma, separar y pesar en frio el precipitado, mezclar en 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo y etiquetar como "suspensión de hígado" o “suspensión de corazón” según corresponda. II) Actividad enzimática. 1) Preparar series de 5 tubos de sobrenadante y suspensión de cada tejido, de acuerdo a la tabla siguiente: Tubo 3 0.5 Reactivos 1 2 4 0.5 0.5 -Naftol 0.15% en etanol 10% Dimetil-para-fenilendiamina 0.15% 0.5 0.5 0.5 Agua destilada 1 1.5 1.5 0.5 Mezclar y calentar en baño de agua a 37C por 10 minutos KCN 0.01% 0.5 Sobrenadante o suspensión del tejido 1 1 1 1 5 0.5 0.5 2 2) Calentar los tubos en baño de agua a 37 C con agitación suave. 3) Registrar los cambios de color en cada tubo al tiempo 0, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la adición de los extractos de tejidos. 4) Los colores esperados se asocian a las siguientes condiciones en el medio de reacción: Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 65 Características de reacción Oxidación de la dimetil-para-fenilendiamina e interacción con el -naftol para formar azul de indofenol Oxidación de la dimetil-para-fenilendiamina, ausencia de naftol Sustrato en forma reducida y presencia de -naftol Inhibición de la reacción de oxidación Color esperado Morado Café Violeta Lila 2.3.5. Resultados a reportar. • • Tiempo de detección de la oxidación de la dimetil-para-fenilendiamina por tipo de muestra y fracción de extracto analizados. Fracciones de extractos con actividad positiva de la citocromo oxidasa. 2.3.6. Método de Evaluación Al final de la sesión de laboratorio, el estudiante deberá mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la práctica. El reporte escrito de la práctica se deberá de entregar al profesor, a más tardar antes del inicio la siguiente sesión de laboratorio, la entrega extemporánea originara una deducción de puntos del orden de 10 puntos/día. El estudiante recibirá el reporte calificado en la siguiente sesión de laboratorio. 2.3.7. Bibliografía Chance, B., Saronio, C., Leigh, J. S., 1975. Functional intermediates in the reaction of membrane-bound cytochrome oxidase with oxygen. Journal of Biological Chemistry 250, 9226-9237. Goolish, E. M., Adelman, I. R., 1987. Tissue-specific cytochrome oxidase activity in largemouth bass: the metabolic costs of feeding and growth. Physiological Zoology 60 (4), 454-464. Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica Médica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formación Básica Disciplinaria. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA [UNIDAD II] Página 66 Academia de Bioquímica Médica I. Oxidaciones biológicas: Obtención de la fracción mitocondrial del tejido; Determinación de la actividad de citocromo-oxidasa. México., pp. 42-45. Kuboyama, M., Yong, F.C., King, T.E., 1972. Studies on cytochrome oxidase . VIII. Preparation and some properties of cardiac cytochrome oxidase. Journal of Biological Chemistry 247, 6375-6383. Ludwig, B., Bender, E., Arnold, S., Hüttemann, M., Lee, I., Kadenbach, B., 2001. Cytochrome c oxidase and the regulation of oxidative phosphorylation. ChemBioChem 2(6), 392-403. Speers-Roesch, B., Ballantyne, J. S., 2005. Activities of antioxidant enzymes and cytochrome c oxidase in liver of Arctic and temperate teleosts. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 140(4), 487-494. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Anexos Página 67 Anexos Normas Generales de Seguridad e Higiene 1. El uso de bata es obligatorio. 2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles. 3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos. 4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio. 5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas. 6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia médica. 7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables. 8. 8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias. 9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos. 10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios. 11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio. 12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio. 13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad. 14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente informado. 15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos. 16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con la boca. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Anexos Página 68 17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona. 18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella. 19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, productos químicos vertidos. 20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc. 21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado. 22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. 23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes. 24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso. 25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias. 26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Anexos Página 69 Medidas Generales en Caso de Accidente Plan general de emergencia Dar la alarma. Ponerse a salvo. Ayudar a las personas. Luchar contra el fuego. Avisar al responsable del departamento. Evacuación del edificio en caso necesario. Avisar a ambulancias, bomberos. Fuego en el laboratorio Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de emergencia, sí la principal está bloqueada. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la calma. Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente. Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y evacuar el edificio. Fuego en el cuerpo Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda. Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas. No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de ti. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con una manta antifuego, condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no coja frío y proporciónale asistencia médica. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Anexos Página 70 Quemaduras Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves. Cortes Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio. Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo. Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con una venda. Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata. Derrame de productos químicos sobre la piel Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos. Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila. Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. Proporcionar asistencia médica a la persona afectada. Corrosiones en la piel por ácidos y álcalis Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido. Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con agua corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de ácido tánico. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA Anexos Página 71 Corrosiones en los ojos En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. Ingestión de productos químicos Antes de cualquier actuación pide asistencia médica. Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera. Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC
