GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS INGENIERÍA GENÉTICA 2016 Estudio de una vía de señalización de MAPK a nivel poblacional y de células individuales Equipo docente Lic. Daiana Sapochnik Lic. Gustavo Vasen Lic. Nicolás Nieto Moreno Dra. Luciana Giono Cronograma 2 Introducción El objetivo de este trabajo práctico es estudiar una vía de señalización prototípica de MAP quinasas (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK) tanto a nivel de la respuesta promedio de la población como de células individuales. Como modelo de trabajo se trabajará con la levadura Saccharomyces cerevisiae dado que presenta varias ventajas a la hora de trabajar en la mesada de un aula de docencia: tiempos cortos de trabajo, fácil obtención de cepas genéticamente modificadas, condiciones de crecimiento y manipulación sencillas. S. cerevisiae presenta cinco cascadas de MAPK. En particular, estudiaremos la vía que se activa en respuesta a alta osmolaridad, cuya MAPK es Hog1, homóloga a p38 en mamíferos. Frente a un shock hiperosmótico, Hog1 se activa por fosforilación, se trasloca al núcleo y promueve la transcripción de genes necesarios para re-establecer el volumen celular y adaptarse al nuevo medio extracelular. La respuesta a alta osmolaridad en S. cerevisiae. Las células presentan una determinada presión de turgencia. En el caso de las levaduras, esta presión la ejerce la membrana plasmática contra la pared celular. Esta presión es muy útil para las levaduras, que la usan como ayuda para poder crecer. Cuando la célula flexibiliza la pared en la zona de crecimiento, la presión ayuda a su expansión en esa zona. El aumento de la osmolaridad externa causa la salida de agua y la consiguiente caída en la presión de turgencia (Pτ). Para adaptarse a esta nueva situación, las levaduras activan una vía de respuesta que se conoce como HOG (High Osmolarity Glycerol). La respuesta consiste en aumentar la producción de glicerol (que es muy poco permeable a través de la membrana plasmática) y en reducir su escape hacia afuera de la célula cerrando el canal Fps1. El consecuente aumento de la concentración de glicerol intracelular hace que aumente la osmolaridad interna y que, por consiguiente, el agua vuelva a entrar a la célula y ésta recupere la turgencia normal (Figura 1A). A su vez, juntamente con esta respuesta rápida, se induce la expresión de un set de proteínas necesarias para la adaptación a este nuevo ambiente. 3 Figura 1. A, Respuesta fisiológica de una levadura frente a un shock hiperosmótico. B, Vía de señalización de respuesta a alta osmolaridad. Como se puede ver en la Figura 1B, existen dos ramas de activación de la cascada: la rama de Sho1 y la de Sln1. En ambas, sensores de membrana activan una cascada de MAPK. Las MAPKKK son respectivamente Ste11 y Ssk2. En el siguiente paso de la cascada, Pbs2, la MAPKK y también proteína de andamiaje del sistema, integra la información de ambos caminos y activa finalmente a Hog1, la MAPK. Hog1 fosforilado ejecuta la respuesta que consiste en: activar las enzimas de síntesis de glicerol presentes, reducir la pérdida de glicerol (cerrando canales como Fps1) y, a su vez, inducir la expresión tanto de enzimas como de canales relacionados con la síntesis y entrada de glicerol (Figura 3). 4 Figura 3. Respuestas ejecutadas por Hog1 frente a un aumento en la osmolaridad extracelular. Pττ, presión de turgencia; DHAP, dihidroxiacetona fosfato. La biología de sistemas postula que con ayuda de modelos matemáticos se pueden capturar y “explicar” los comportamientos dinámicos que exhiben los procesos biológicos, en los que en general participan grupos relativamente numerosos de componentes. Por ello, requiere de una combinación de matemática, computación y observación experimental cuantitativa. En particular, la filosofía de esta disciplina muchas veces implica pensar a las células como sistemas que responden frente a un INPUT, ofreciendo una variedad de OUTPUTs como resultado, donde no sólo importa cuáles son estos outputs sino también cuánto se produce/activa de cada uno. En la respuesta a alta osmolaridad en levaduras, se puede considerar como INPUT el shock hiperosmótico. ¿Qué posibles OUTPUTs se pueden medir y por qué técnica se podría realizar su cuantificación (Tabla 1)? OUTPUT Técnica de cuantificación Poblacional o Células individuales Microscopía/ Citometria de flujo Células individuales ………………………………………………..… ………………………………………………..… ………………………………………………..… ………………………………………………..… ………………………………………………..… ………………………………………………..… ………………………………………………..… Reducción del volumen celular Tabla 1. Posibles Outputs de la respuesta a alta osmolaridad. 5 Para un estudio completo de una vía de señalización es clave poder determinar la variabilidad de la respuesta. No todas la células responden de la misma manera y no siempre el comportamiento promedio de una población refleja lo que ocurre en cada célula. En una población, existen diferencias preexistentes entre los distintos individuos, por ejemplo, el momento en el ciclo celular, el tamaño, etc. Ésta es una fuente importante de “variabilidad” (entendida como la varianza con respecto a la media de un posible output) en el comportamiento. Pero, a su vez, existe otra fuente de variabilidad que se debe a la estocasticidad inherente a los procesos moleculares que orquestan la respuesta celular (“ruido”). Para determinar la variabilidad de la respuesta, es importante que el método de medición elegido para un dado output pueda arrojar valores confiables de cada célula. Por ello, en la Tabla 1 se pueden clasificar las técnicas según si son aptas para mediciones poblacionales o de células individuales. En este trabajo práctico, el objetivo es medir distintos outputs de la vía de señalización de HOG. Algunos de ellos brindarán información cuantitativa poblacional y otros, además, información de células individuales. Estos datos podrán ser utilizados para cuantificar las fuentes de variabilidad en distintos puntos de la respuesta. 6 1. SEMANA 1: Plásmidos a utilizar 1.1 REPORTERO TRANSCRIPCIONAL Manejo de plásmidos en la plataforma ApE El ApE es un editor de secuencias de ADN. Es un software libre (“open source”). Es sencillo y bastante versátil. Se puede bajar desde http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ o del campus de IG. Formatos: el formato “universal” de plásmidos es genebank (.gb o gbk). Todos los editores de plásmidos lo leen. Además de la secuencia, tienen identificados los “features” presentes. Secuencias de uso común se pueden generalmente encontrar en formato genebank del BLAST o de repositorios como www.addgene.org. LOCUS 2014 pFA6a_YFP_HIS3MX FEATURES gene 4729 bp ds-DNA circular 15-SEP- Location/Qualifiers 1406..2059 /note="HIS5" /label=HIS5 (S.pombe) /ApEinfo_fwdcolor=#008040 /ApEinfo_revcolor=green /ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0} width 10 offset 0 rep_origin complement(2625..3307) /label=ColE1 origin /ApEinfo_fwdcolor=gray50 /ApEinfo_revcolor=gray50 /ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0} width 10 offset 0 CDS complement(3405..4064) /label=AmpR /ApEinfo_fwdcolor=yellow /ApEinfo_revcolor=#ff8000 /ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0} width 10 offset 0 ORIGIN 7 1 GAACGCGGCC GCCAGCTGAA GCTTCGTACG CTGCAGGTCG ACGGATCCCC GGGTTAATTA 61 ACATGAGTAA AGGAGAAGAA CTTTTCACTG GAGTTGTCCC AATTCTTGTT GAATTAGATG 121 GTGATGTTAA TGGGCACAAA TTTTCTGTCA GTGGAGAGGG TGAAGGTGAT GCAACATACG (...) 4681 TAATACATAA CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATA // … Ejercicio 1: Anotar un plásmido en blanco Descarguen la secuencia del plásmido “Promotor STL1-TdTomato LEU2.ape” El esquema del plásmido se encuentra en la Figura 1. El ejercicio consiste en encontrar las distintas partes en la secuencia de ADN. El objetivo final es identificar con qué enzima de restricción conviene cortar para integrar el plásmido en un locus determinado. Figura1. Plásmido Promotor-STL1-TdTomato LEU2. El programa viene con una pequeña biblioteca de secuencias reconocidas (“features”). Uno puede incorporar a esta biblioteca nuevas “features” para empezar a personalizar el programa. 1) Vayan a Features>Annotate features using library o presionen Control+K. 8 Se anotan elementos comunes como orígenes de replicación y sitios de unión a primers universales con su Nombre, Dirección (>>>>, en la hebra cuya secuencia figura, <<<<<, en la que no figura), Tipo de “feature” y su posición en bp. 2) Generen un mapa del plásmido a medida que lo van anotando en Enzyme>Graphic Map o Control+Y o con el botón correspondiente. 3) Ahora encuentren el marcador, LEU2, y la proteína fluorescente, tdTomato. Para ello tienen que encontrar ORFs lo suficientemente grandes. Vayan a ORFs>Search Strands>Both, luego pongan el cursor al inicio de la secuencia y vayan ORFs>Find Next… o Control+>. Cuando encuentren un ORF lo suficientemente largo y en la orientación correcta según el esquema de la Figura 1, copien la secuencia o su reverso-complementario (Edit>copy o copy reverse-complement, o right-click, etc). a) En el BLAST directamente: busquen la secuencia en el BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). usando el programa Nucleotide Blast (blastn, en base de datos nucleotídica) o el blastx (que traduce la secuencia y busca en la base de datos de proteínas). b) Con el BLAST desde ApE: apretar Control+0 (cero) para abrir la consola. Ir a Tools>Blast sequences at NCBI…, clickear la opción Selection Onl(y) y elegir el programa a usar (blastn o blastx) 9 4) Una vez identificado, anótenlo como una nueva “feature”, Feature>New Feature o Control+. (punto). Elijan el color, nombre y tipo. Para que quede registrado en la bilblioteca tienen que elegir la opción New feature in library. 5) Falta identificar el promotor. En este caso, ya sabemos que está 972 bp río arriba del ATG de tdTomato. Pero en una situación desconocida, para encontrar tenemos que bajar la secuencia del locus STL1 (Hacerlo…) Ir a http://www.yeastgenome.org/, buscar STL1 y obtener la secuencia de DNA +/1kb. Descargar en formato .fsa y abrir el archivo desde ApE (Guardenlo como STL1 Locus.ape). Busquen el ORF de STL1 y anotenlo, como ya saben hacerlo. 6) Usen la herramienta Tools>Align two sequences… para encontrar la secuencia compartida entre el plásmido y el locus. Seleccionen los archivos a comparar y denle OK. Una vez realizado el alineamiento, seleccionen la parte inicial con 100% de identidad, cópienla y búsquenla en la secuencia del plásmido (al derecho o en revcom según como esté orientado) con Edit>Find o Control+F. Pueden elegir la opción Highlight All para que se seleccione. Anoten el promotor. 10 7) Por último, necesitamos el mapa de restricción para elegir la enzima a utilizar para integrar tanto en el locus de STL1 como en el de LEU2. Enzymes>Enzyme Selector o Control+E. Seleccionen Unique (1) y six cutter (enzimas más comunes) y luego “Select”. Finalmente, Graphic Map. Subir el mapa final al campus en la sección Plásmido por grupo. En el nombre de archivo indicar en número de grupo. 1.2 GENERACIÓN DEL FRAGMENTO DE PCR PARA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA. Ejercicio 2: Diseño de primers para fusionar YFP a Hog1. La estrategia y los plásmidos a utilizar son derivados del paper de Longtine (1998) (Búsquenlo en el campus). La estructura de los primers tiene que ser: 40nt de homología 20nt de apareamiento con el plásmido Las secuencias de homología tienen que ser: -Primer Forward: los últimos 40nt de la secuencia codificante de Hog1 sin el codón STOP. -Primer Reverse: los 40nt que se encuentran a continuación del codón stop. Buscar las secuencias en www.yeastgenome.org para SLT1. Los 20nt de apareamiento los tienen que elegir en el plásmido molde cuyo esquema se encuentra en la Figura 2. 11 “Cassette” de selección HIS3MX6 Figura 2. Esquema del plásmido pFA6-YFP-HIS3MX6. -Tienen que tener 20nt (se pueden sintetizar primers de hasta 60nt por la técnica común, si no ya es más complicado). -Las Tm de ambas secuencias deben rondar los 60°C y ser similares entre sí. La Tm se puede ver directamente en el mismo ApE al seleccionar la secuencia o bien en https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator donde se puede seleccionar la polimerasa a utilizar. -En lo posible la base 3’ tiene que ser una G o una C. -Verificar que la secuencia de Hog1 y YFP queden en fase. Para ello, usen la herramienta ORF>Translate…. Resuelvan si quieren o no incorporar un linker de algunos aminoácidos y cuáles pueden ser. ¿Qué tamaño en pb tiene que tener el producto de PCR? Subir las secuencias finales (en orientación 5’->3’) al campus en la sección Primers por grupo. Indicar el número de grupo. 12 2. SEMANA 2: PCR y DIGESTIÓN 2.1 PCR. Para obtener Hog1 fusionado a YFP nos valdremos de la alta eficiencia de recombinación por homología en levaduras. Al transformar levaduras con un fragmento de DNA lineal como el que se generó en la sección anterior que presenta homología con secuencias genómicas, las levaduras recombinan dicho fragmento y lo incorporan a su genoma. Mediante algún método de selección (ya sea utilizando una auxotrofía o un antibiótico) se puede aislar clones modificados genéticamente. Para recombinar YFP en el locus de Hog1 y obtener una proteína de fusión, debemos obtener un producto de PCR que incluya 40 bp de la secuencia del locus de Hog1 en los extremos y la proteína YFP completa, utilizando primers como los que diseñaron en el ejercicio 2 de la clase pasada. Además, dicho producto debe tener el ”cassette” HIS3MX6 que revierte la auxotrofía de histidina para poder seleccionar levaduras recombinantes. Cada grupo realizará la reacción de PCR utilizando como molde el plásmido pFA6aYFP-HIS3MX6. La composición final de la mix de PCR es la siguiente: Buffer de PCR 1x, dNTPS 0,2 mM, MgCl 1,5 mM, primers Fw y Rev 0,5 μM cada uno, Taq 0, 5 U, DNA molde 10 ng. Volumen final 20 μL. Al calcular el volumen de H2O que deben agregar a la “mix”, recuerden considerar el volumen de DNA molde que deberán agregar. Deberán preparar “mix” para 3 tubos: para realizar una reacción con molde, un control negativo sin molde y un tubo sobrante para compensar la imprecisión de las pipetas. “Mix” de PCR Buffer 10x dNTPs (2 mM) MgCl2 (15 mM) Primer Fw (10 µM) Primer Rv (10 µM) Taq (5U/µL) H 2O C o Cantfinal 1x 0,2 mM 1,5 mM 0,5 µM 0,5 µM 0,5 U 55.5 M Plásmido (5 ng/µL) Total 10 ng x1 (µ µL) x3 (µ µL) 20 µL 1U de Taq equivale a la cantidad de enzima que incorpora 15nmoles de dNTPs a 75°C 13 Una vez preparada la “mix”, alicuotar en un tubo de PCR el volumen de DNA molde necesario (y agua en el caso del control negativo). Agregar la mix de PCR a cada tubo. El programa de PCR es el siguiente: 5’ 94°C [20” 94°C 20” 60°C 2´ 72°C] [ ]x30 ciclos 5’ 72°C ∞ 16°C Tapa a 105°C Finalizada la PCR correrán un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de amplificación. 2.2 DIGESTIÓN Para integrar la proteína fluorescente TdTomato en levaduras por recombinación homóloga, deberán digerir el plásmido Promotor-STL1-TdTomato-LEU2 para linealizarlo con las enzimas que eligieron en el punto 7 del ejercicio 1 de la clase anterior. Algunos grupos integrarán TdTomato en el locus de Stl1, mientras que otros lo harán en el locus de Leu2. Deberán preparar una “mix” de digestión que contenga la enzima, en el buffer correspondiente en concentración 1x y DNA. “Mix” de digestión Buffer 10x Enzima (10 U/µL) H 2O C o Cantfinal 1x 2U 55.5 M Plásmido 200 ng Total El protocolo de digestión es el siguiente: x1 (µ µL) 20 1. Preparar la mix de digestión. 2. Agregar el DNA a digerir. 3. Incubar 15 minutos a 37°C. 4. Inactivar la enzima de restricción 5 minutos a 65°C 5. Correr 100 ng en un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de digestión. 14 3. SEMANA 3: TRANSFORMACIÓN 3.1 Cepas a transformar. Cepa Cepa parental Genotipo relevante ACL 379 W303 ura3 ade2-1 leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 bar1 YLD 3341 ACL379 pSTL1:: pSTL1-YFP-URA3 prm1::Cherry-hphMX4 3.2 PREPARACIÓN DE LEVADURAS COMPETENTES Cada grupo recibirá un cultivo de 50mL de la cepa ACL 379 o la cepa YLD 3341 luego del paso 2). Se debe trabajar en esterilidad bajo mechero durante todo el protocolo. 1) A partir de un cultivo ON en YPD, diluir en 50mL YPD a OD600=0,2 en erlenmeyer de 250mL preferentemente. 2) Crecer a 30°C por 3-4hs hasta OD=0,6-0,8. 3) Transferir a tubo falcon de 50mL y centrifugar 5’ a 3500rpm. 4) Descartar el sobrenadante por volcado y resuspender con 25mL de H2Od estéril. Vortexear. 5) Centrifugar 5’ a 3500rpm, descartar el sobrenadante y resuspender en 1mL de LiTE. Transferir a un tubo eppendorf. 6) Centrifugar 20” a máxima, volcar el sobrenadante y resuspender en 300µL de LiTE (Vf=500µL). 15 3.3 TRANSFORMACIÓN DE LEVADURAS. 1) Hervir ssDNA 5’ y mantener en hielo. 2) Mezclar: Tubo 1 Reportero STL1 pSTL1-TdTomatoLEU2 DNA (plásmido integrativo) Células competentes 50ng YLD 3341 50µL 5µL ssDNA 2 3 4 Control viabilidad Hog1-YFP Control + YFP-HIS3MX6 (Producto de PCR) pRS413 (plásmido replicativo) - 10µL ACL 379 150µL 15µL 50ng ACL 379 50µL 5µL YLD 3341 50µL - 400µL 400µL VORTEX Incubar a 42°C por 45’ Centrifugar 20” a 8000rpm SC SC 1000µL 50µL SC 50µL VORTEX PEG 40% en LiTE 400µL Resuspender en SC 50µL Incubar 30’ a 30°C No 1000µL Sí No No Centrifugar 20” a 8000rpm. Descartar el sobrenadante por volcado. Resuspender en el volumen residual Plaquear en -LU -H -H YPD 3) Incubar 2-7 días a 30°C. 16 4. SEMANA 4: Aislamiento de clones. 4.1 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN Calcular la eficiencia de transformación en UFC/µg DNA. Contar las colonias manualmente o bien usando el OpenCFU (en las compus o en el campus). Para ellos, se debe sacar una foto a cada placa de transformación. 4.2 AISLAMIENTO Cada grupo recibirá dos placas donde deberán re-estriar sus clones positivos: -1 placa –H: para colocar 5 de sus clones de Hog1-YFP de la placa de transformación correspondiente. -1 placa SC-Glicerol 2%: para estriar 5 de los clones de pSTL1-TdTomato que crecieron en la placa de transformación –LU. Para aislar los clones, con un escarbadientes estéril tocar la parte superior de una colonia y estriarla en forma de raya o parche en la placa correspondiente. Numerar los clones en ambas placas. 5. SEMANA 5: “SCREENING” El “screening” de Hog1-YFP se hará por “Colony PCR” y el de pSTL1-TdTomato por microscopía. 5.1 SCREENING Hog1-YFP. 1. Agregar a cada tubo 50µL de NaOH 10mM y picar con un tip estéril un poco de levaduras de la estría correspondiente a cada colonia en cada tubo correctamente rotulado. Entre 5-6 clones más el control positivo (HOG-GFP) y el negativo (ACL379) 2. Incubar 5 minutos a 100°C 3. Centrifugar 5 minutos a máxima velocidad 4. Preparar la “mix” de PCR según la siguiente tabla “Mix” Buffer 10x dNTPs (10mM) MgCl2 (50mM) Primer Fw (10µM) Primer Rv (10µM) Taq (5U/µL) H 2O x1 (µ µL) 2 0.4 0.6 1 1 0.25 13.75 Total 19 x10 17 5. Alicuotar 19 µL de la mix en los tubos de PCR o “strips” y agregarle a cada uno 1µL del sobrenadante de extracción del genómico. 6. Poner la PCR en el termociclador. El programa es el siguiente: 5’ 94°C [20” 94°C 20” 60°C 2´ 72°C] [ ]x30 ciclos 5’ 72°C ∞ 16°C Tapa a 105°C 7. Finalizada la PCR correr un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de amplificación. Primers 5'->3' P-Fw ACCTCAAAGCGCTTCGTCATGG P-Rv AGTGTTGGCCATGGAACAGG 5.2 “SCREENING” pSTL1-TdTOMATO. 1. Preparar 6 tubos con el número de clon correspondiente y un tubo para la cepa parental. Agregarle 200µL de medio SC. 2. Con un tip estéril picar de la estría de cada clon (una punta del tip cruzando la estría perpendicularmente) y resuspender en el tubo correspondiente. 3. Pasar 20µL de cada tubo a un pocillo de la placa de microscopía de 384 wells. 4. Dejar que las células se asienten. 5. Ir al microscopio. 6. Re-estriar en una placa –LU los clones positivos. 18 6. SEMANA 6: Experimento 1: Fosforilación de Hog1. 6. 1 PREPARACION DE MUESTRAS PARA WESTERN BLOT 1) Cada grupo recibirá: -un cultivo en –LU de un clon positivo de la cepa con el doble reportero pSTL1. -un cultivo en –H de un clon de Hog1-YFP. 2) Mezclar: 1 2 (NaCl 0.2M) Cepa Doble-STL1 Doble-STL1 Cultivo H2Od NaCl 4 M 900 µl 100 µl - 900 µl 50 µl 50 µl 3 y 4 (NaCl 0.4M) Doble-STL1 y Hog1-YFP 900 µl 100 µl VORTEX 5 min RT (estrictos) NaOH 10 M: βMSH 14 M (9:1) 100 µl 100 µl 100 µl 150µL 150µL VORTEX 5 min RT Ác. Tricloroacético 100% 150µL VORTEX 10 min en hielo Centrifugar 10 min a máx. velocidad Descartar el sobrenadante. ¡¡¡HAY QUE SACAR TODO EL SOBRENADANTE!!! 500µL 500µL 500µL Sc. Acetona (-20°°C) 5 min en hielo. Centrifugar 2 min a máx. velocidad. Descartar el sobrenadante y dejar secar. Buffer 25 µL 25 µL 25 µL resuspensión Incubar a 65°C 10 min (vortex de vez en cuando). Centrifugar 10 min a máx. Velocidad. Pasar sobrenadante a epp. nuevo (dejar el pellet detrás) Cracking Buffer 5x 6 µL 6 µL 6 µL 3) Conservar las muestras a -20°C. SOLUCIONES βMSH: βMercaptoetanol. Sc. Acetona: 70% v/v de acetona en Tris-HCl 100 mM pH 6,8. Buffer de resuspensión: Tris-HCl 100 mM pH 8.8, 3% SDS. 19 7. SEMANA 7: SDS-PAGE y Western blot 7.1 PRINCIPIOS El protocolo de Western implica la transferencia (o blotting) de las proteínas desde un gel desnaturalizante a una matriz denominada membrana. Esta membrana puede ser de distintos materiales, siendo la nitrocelulosa y el polivinilidenofluoruro (PVDF) las más utilizadas. Una vez terminada la corrida electroforética, las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana mediante una corriente eléctrica. Como se observa en la Figura 3, se arma un “sandwich” en el cual el gel y la membrana quedan en íntimo contacto para que, al aplicar una diferencia de potencial, las proteínas migren desde el gel a la membrana (recuerden que las proteínas siguen cargadas negativamente por el SDS y el pH del buffer). Figura 1. Armado de la transferencia. Se esquematiza el orden de ensamblado de los distintos componentes necesarios para transferir las proteínas de un gel a una membrana y la dirección de la corriente eléctrica. Una vez que las proteínas se encuentran en la membrana (específicamente en su superficie), la misma es sometida secuencialmente a distintas incubaciones: bloqueo, anticuerpo primario y anticuerpo secundario. Este último suele estar acoplado a alguna enzima de manera de permitir el revelado de las bandas específicas por medio de una reacción enzimática. Las enzimas más utilizadas son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa. El acoplado de anticuerpos secundarios a fluoróforos también es una herramienta para el revelado de Western blot. En este caso, la señal se analiza mediante herramientas de detección de fluorescencia en distintas longitudes de onda (acorde al fluoróforo al que se encuentre acoplado). Bloqueo. Dado que la membrana une proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza peptídica) empleado en la detección podría 20 unirse a ellos, dificultando la identificación del complejo antígeno-anticuerpo. En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o leche en polvo, junto con una pequeña cantidad de detergente, como Tween-20 o Tritón X-100 (típicamente entre 0,05 y 0,2%). Las proteínas y el detergente en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las proteínas transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo. Incubación con anticuerpos. Típicamente en un Western blot se utilizan secuencialmente dos anticuerpos: el primario que reconoce específicamente la proteína que se quiere detectar; y el secundario que reconoce al anticuerpo primario y nos da la posibilidad de “revelar” la presencia del complejo proteína de interésanticuerpo primario. Las incubaciones de la membrana con las soluciones de anticuerpo son un punto clave para un resultado exitoso a la hora de realizar un Western blot. Las mismas se hacen en una solución buffer que consiste en Tris-HCl y NaCl (TBS, por Tris-buffered saline) o fosfato y NaCl (PBS, por phosphate-buffered saline). La dilución del anticuerpo, el tiempo y la temperatura de la incubación, junto con la cantidad y duración de los lavados entre incubaciones, son parámetros que dependen de cada complejo antígeno-anticuerpo. Es una práctica común de las empresas que comercializan los anticuerpos, adjuntar una hoja indicando el protocolo optimizado para el anticuerpo comprado. Revelado. Una vez realizadas las incubaciones, existen complejos ternarios antígenoanticuerpo 1rio-anticuerpo 2rio. En el sistema de revelado más utilizado, el anticuerpo 2rio está asociado covalentemente a la enzima peroxidasa la cual, en presencia de peróxido de hidrógeno, cataliza la oxidación del sustrato luminol generando así emisión de luz. De esta manera, la luz generada será captada por una placa radiográfica revelando la presencia del antígeno. Las principales desventajas de este sistema son las variaciones de la actividad enzimática en función del tiempo así como el rango lineal de detección de la placa radiográfica, el cual no es muy amplio y es fácilmente saturable. Así, no es sencillo obtener conclusiones cuantitativas y, por lo tanto, se deberían tomar recaudos como por ejemplo curvas de dilución internas para conocer el rango lineal de detección del sistema. Si bien la aparición de equipos electrónicos que permiten la detección de quimioluminiscencia presenta una mejora en cuanto a la sensibilidad en comparación a las placas radiográficas, no deben dejar de tenerse en cuenta las desventajas que implican el revelado con un método enzimático (cinética, concentraciones de sustrato y producto, etc). Recientemente se ha desarrollado un nuevo sistema de detección que mejora algunas de las desventajas de los sistemas basados en reacciones enzimáticas: 21 El equipo Odyssey® Infrared Imaging System es un escáner capaz de producir imágenes a partir de excitación y emisión de moléculas fluorescentes en el rango infrarrojo cercano (IR). El equipo está constituido por un sistema de dos canales de detección independientes: un canal de 700 nm y otro de 800 nm de longitud de onda. Esta característica permite la detección simultánea de dos blancos en la misma membrana o en las mismas células utilizando dos anticuerpos (uno acoplado a un fluoróforo que emite a 680nm y otro a 800nm). Aplicaciones: Detección por anticuerpos 2rios infrarrojos (IRDye) de proteínas, ADN, ARN, etc.Las aplicaciones más comunes son i) detección de proteínas totales en gel, tipo coomassie, gracias al IRDye blue protein stain, ii) Westerns, iii) detección de ácidos nucleicos totales, tipo bromuro de etidio, gracias a los colorantes SYTO (Invitrogen) o bien de secuencias particulares (tipo Southern o Northern) gracias al uso de una sonda biotinilada y un IRDye-Streptavidina y iv) visualización de sección de tejidos o de pequeños animales (como ratas o ratones). Ventajas por sobre la detección por quimioluminisencia: • Mayor sensibilidad: las membranas y los plásticos pueden producir una alta señal de ruido en el espectro visible debido a la autofluorescencia y a la dispersión de luz de los materiales. Esto limita la sensibilidad de la fluorescencia visible y complica la detección de proteínas poco abundantes. • Mayor relación señal:ruido en comparación a la quimioluminisencia. • No se requieren sustratos, soluciones reveladoras ó películas fotográficas. • La señal de los anticuerpos 2rios infrarojos (IRDye) es muy estable por lo que, si la membrana se almacena correctamente, puede ser visualizada tiempo después. De manera similar, el tiempo no influye en la intensidad de la señal a diferencia de la quimioliminiscencia, donde es una variable a tener en cuenta dado que la intensidad de la señal no es constante. • Detección simultánea de dos anticuerpos marcados con fluoróforos distintos. Esto es muy útil para revelar en un paso proteína total y modificaciones posttraduccionales y proteínas distintas de pesos moleculares similares. • Mejor respuesta cuantitativa dada la ausencia de detección enzimática que suele aumentar la sensibilidad en detrimento de la linealidad de la detección. Links: • Western blot: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf 22 • Odyssey: http://www.licor.com/bio/products/imaging_systems/odyssey_selection.jsp 7.2 PREPARACIÓN DE GELES Y CORRIDA Acrilamida % 7% 10% 12% 15% 1. Rango de PM donde resuelve 50 kDa - 500 kDa 20 kDa - 300 kDa 10 kDa - 200 kDa 3 kDa - 100 kDa Grosor del gel Vol. del Stacking gel 0.75mm 1.0mm 1.5mm 2mL 3mL 4mL Vol. Del Resolving gel 4mL 6mL 8mL Se prepararán, cada 3 grupos, 1 gel de poliacrilamida desnaturalizante (12%) de acuerdo con los números que se muestran a continuación. Para 10ml de Resolving Gel Acrilamida % H2 O Acrilamida/BisAcrilamida (30%/0.8% m/v) 1.5 M Tris-HCl (pH=8.8) 10% (m/v) SDS 10% (m/v) Persulfato de amonio (APS) TEMED 12% 3,3 mL 4 mL 2,5 mL 100 μL 100 μL 10 μL Para 5ml de Stacking Gel Acrilamida % H2 O Acrilamida/Bis- 5% 3,3mL 830μL 23 Acrilamida (30%/0.8% m/v) 1.0 M Tris-HCl (pH=6.8) 10% (m/v) SDS 10% (m/v) Persulfato de amonio (APS) TEMED Se van a utilizar peines de 15 calles. 750μL 50μL 50μL 5μL 1. Armar el dispositivo y llenar la cuba con buffer de corrida. 2. Sembrar el contenido de cada tubo (30ul) en cada calle. En la calle que le indiquen los docentes sembrar 2ul del marker de proteínas. 3. Correr 60V durante 30 minutos y luego a 200V hasta que caiga el frente de corrida (entre 45 minutos y 1 hora). 4. Luego de la corrida sumergir el gel en buffer de transferencia (!). 5. Cortar membrana de nitrocelulosa del tamaño del gel (8,5 x 5,5 cm). 6. Armar un sandwich sumergido en buffer de transferencia en el siguiente orden (de abajo hacia arriba, sobre la parte negra del sandwich). ENTRE CADA CAPA SACAR LAS BURBUJAS UTILIZANDO UNA PIPETA O VARILLA DE VIDRIO COMO RODILLO. • • • • • • 1 esponja tipo ScotchBrite embebida en buffer de transferencia. 2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de transferencia. Gel. membrana de nitrocelulosa. 2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de transferencia. 1 esponja tipo ScotchBrite embebida en buffer de transferencia. IDENTIFICAR CADA MEMBRANA!!!! 7. Se ensambla en el cartucho de transferencia y se coloca dentro de la cuba de electrotransferencia (Biorad) que luego se llena de buffer de transferencia. Se agrega el recipiente refrigerante, se coloca la tapa y se conecta a una fuente de poder. La transferencia se hace a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora. 24 (!) TENER ESPECIAL CUIDADO AL MANIPULAR METANOL: Producto inflamable. Tóxico por inhalación o ingestión. Conservar alejado de las llamas o fuente de chispas. Evitar el contacto con la piel. En caso de ingestión beber etanol 40% y acudir a un médico. Usar guantes. SOLUCIONES Tris-Glicina 10X: Tris base 30,3 g, Glicina 144,0 g. Llevar a 1 litro con agua deionizada Buffer de corrida: 100 ml Tris-Glicina 10X + 10ml SDS 10%% + 890 ml H2O ml Buffer de transferencia: 100 ml Tris-Glicina 10X + 200ml metanol + 700ml H2O 8. SEMANA 8: Revelado del Western Blot 8.1 INCUBACIÓN CON ANTICUERPOS 1. Incubar la membrana con solución de bloqueo 1 hora a temperatura ambiente con agitación. 2. Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C con agitación, según detalla la siguiente tabla: Anticuerpo Companía Dilución Especie α-Hog1 Santa Cruz 1:1000 en solución de bloqueo Goat α-pp38 Cell Signalling 1:1000 en solución de bloqueo Mouse 3. Recuperar los anticuerpos (ya que son muy caros y pueden reutilizarse). 25 4. Lavar la membrana 3 veces con TTBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. 5. Incubar con el anticuerpo secundario anti-IgG para la especie correspondiente diluído 1:15.000 en solución de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. Se cuenta con los siguientes anticuerpos secundarios: ¿cuáles utilizará para la doble marcación? 1 2 3 4 5 6 7 No. Fluoróforo 926-32211 926-32210 926-32229 926-32212 926-32213 926-68074 926-68073 800CW 800CW 680RD 800CW 800CW 680RD 680RD Hecho en Goat Goat Goat Donkey Donkey Donkey Donkey Reconoce Type anti-Rabbit anti-Mouse anti-Rat anti-Mouse anti-Rabbit anti-Goat anti-Rabbit IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG 6. Los anticuerpos que se utilizan para revelar en el Odyssey están acoplados a un fluoróforo. PRESTAR ATENCIÓN AL ANTICUERPO SECUNDARIO QUE LE CORRESPONDE A CADA MEMBRANA. 7. Lavar la membrana 3 veces con TTBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. 8. Lavar la membrana 1 vez con TBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. SOLUCIONES TBS 10X: Tris-HCl 0,25 M pH 7,4, NaCl 1,5 M. Mezclar 30,28 g de Tris base con 87,7 g de NaCl Ajustar pH a 7,4 y llevar a 1 litro con H2O deionizada TTBS: TBS 1X + Tween 20 0,1% Solución de Bloqueo: Leche en polvo descremada 5% (0% grasa) en TBS cuyas fosfatasas fueron inactivadas por incubación a 65°C por una hora. 26 8.2 ESCANEO DE LA MEMBRANA El revelado del Western blot será realizado mediante el sistema Odyssey. Este es un lector de fluorescencia que posee 2 canales, uno para longitudes de onda de 700nm y otro para longitudes de onda de 800nm. Los anticuerpos utilizados para el revelado están acoplados a un fluoróforo que emite a 680nm o a un fluoróforo que emite a 800nm. Para el revelado, colocaremos la membrana en un scanner lector de fluorescencia y se analizarán los resultados usando ImageJ. 8.3 CUANTIFICACIÓN DEL WESTERN BLOT El instructivo se subirá al campus en el momento correspondiente. 9. SEMANA 8: Experimento 2: Relocalización nuclear de Hog1YFP 1) Incubar placa de 384 wells con 50 µL/well de Concanavalina A (ConA, 1mg/mL) durante 30 min. La ConA es una lectina que une glicanos de la pared celular de las levaduras. Se utiliza para inmobilizar a las celulas a la hora de hacer seguimiento por microscopía. 2) Lavar con H2Od estéril 2 veces con 80µL/well. 3) Sonicar un cultivo de la cepa a estudiar de una OD=0,05 durante 30 seg a 10% de potencia. Esto permite separa a las células entre sí. 4) Plaquear 20 µL de células por well. Cada grupo utiliza 4 wells. 5) Centrifugar 1 min a 4500 rpm en centrífuga de placas. 6) Sacar el sobrenadante con una pipeta desde una punta y agregar 20 µl de medio SC por well por la punta opuesta. 7) En el microscopio, primero se guardan las posiciones a estudiar y luego se agrega el estímulo: Condición: NaCl 0.15M NaCl 0.3M NaCl 0.6M Sin estimular - NaCl 0.1M 40 µL - NaCl 0.2M 40 µL - NaCl 0.4M 40 µL 27 8) Realizar el análisis de datos siguiendo el instructivo de cuantificación de relocalización nuclear. 10. SEMANA 12: Experimento 3: Análisis de la expresión del doble reportero transcripcional. 10.1. SHOCK HIPEROSMÓTICO 1) A partir de un cultivo ON en –LU de un clon positivo de cada grupo, diluir y crecer a 30°C por hasta OD=0,05. Diluir a 0,025. 2) Sonicar durante 30 seg a 10% de potencia. 3) Mezclar: Células NaCl 4 M H2O miliQ Cicloheximida (10x =25µg/mL) 1 180 µL 20 µL 20 µL 2 (NaCl 0.1M) 3 (NaCl 0.2M) 180 µL 180 µL 5 µL 10 µL 15 µL 10 µL VORTEX Incubar a 30°C 45 min 20 µL 20 µL 4 (NaCl 0.4M) 180 µL 20 µL - 20 µL VORTEX Incubar a RT 90 min Pasar 60µL/well a una placa tratada con ConA 4) Capturar las imágenes en el microscopio. 10.2 ANALISIS DE DATOS 1) Análisis de imágenes usando Cell-ID 2) Análisis de la variabilidad célula-célula a partir de los datos recolectados. 28 Para cada concentracion de NaCl tienen que calcular: 1. Calcular las variables sin el background: f.total.*=f.tot.*-a.tot⋅f.bg.* *: f.tot.y= YFP f.tot.r= tdTomato 2. Calcular las variables normalizadas por la media por concentración. 3. Calcular el ruido intrínseco y el extrínseco de a pares según: 2 int η = ( y − c )2 2 2 η ext = yc − 1 4.Gráficos: -Media±SD de f.total.* en función de [NaCl] -Histogramas de f.total.* en función de [NaCl] -Gráficos de puntos de f.total.* SIN normalizar de los pares (yc, cr, yr) para las distintas NaCl en un mismo par de ejes -Gráficos de puntos de f.total.* normalizadas de a pares (yc, cr, yr) para las distintas NaCl -Ruido intrínseco y extríseco en función de [NaCl] 29