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Química Biológica II A
Organización y Función Celular
Trabajo Práctico
Respuesta celular a estrés: formación de gránulos de estrés
Turno Mañana: JTP
Alejandra Guberman (algub@qb.fcen.uba.ar)
Ay 1o Claudia María Solari (cmsolari@gmail.com)
Ay 2o Emilio Santillán (emilio.msantillan@gmail.com)
Turno Noche: JTP Ezequiel I. Surace (esurace@hotmail.com)
Ay 1o Luciano Morosi (luciano.morosi@gmail.com)
Ay 2o Sebastián Vishnopolska (sebasvishno@gmail.com)
En la trastienda del TP: JTP Luciana Giono (lgiono@fbmc.fcen.uba.ar)
Ay 1° Daiana Sapochnik (daianasapochnik@gmail.com)
Marcelo Pérez-Pepe (Laboratorio de Biología Molecular del ARNFundación Instituto Leloir)
Coordinadoras: Graciela L. Boccaccio (gboccaccio@leloir.org.ar)
Anabella Srebrow (asrebrow@fbmc.fcen.uba.ar)
Dirección de mail de la materia: qbiia.fbmc@gmail.com
Página web de la materia: http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/qbiia/
2016
QBIIA-Organización y Función Celular 2016
Contenidos
I. Objetivos
II. Introducción
II.1 La respuesta celular a estrés
II.2 Estrés celular y traducción
II.3 Gránulos de estrés
III. El modelo experimental y metodología general
III.1 Líneas celulares
III.2 Inducción de estrés oxidativo en líneas celulares
III.3 Visualización de estructuras intracelulares
IV. Desarrollo experimental
IV.1 Estudio de la viabilidad celular frente a una condición de estrés
por tinción con Cristal Violeta y observación al microscopio de la
morfología celular.
IV.2 Formación de gránulos de estrés (SG) y efectos farmacológicos
de Cicloheximida y Puromicina
IV.3 Empleo de construcciones reporteras de DCP1a para la
visualización de Processing Bodies.
V. Informe Final
VI. Bibliografía
VII. Bioseguridad
VIII. Protocolos
IX. Anexo. Fraccionamiento subcelular mediante centrifugación en gradiente
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I. Objetivos
La biología celular se ocupa de la caracterización morfológica y funcional de estructuras y
organelas celulares, y de la fisiología celular en distintos contextos. Las principales técnicas
utilizadas en biología celular son el cultivo in vitro de tejidos y de líneas celulares para
establecer sistemas celulares modelo, la microscopía en todas sus formas para determinar la
localización y seguimiento de estructuras macromoleculares, las técnicas de evaluación de
función celular (e.g. proliferación, migración, invasión, etc.) y los métodos de caracterización
de interacciones moleculares (e.g. centrifugación diferencial, coinmunoprecipitación, pull down
de complejos macromoleculares, FRET, etc.).
Objetivo general: recibir entrenamiento en técnicas usuales de biología celular (cultivo de líneas
celulares, microscopía, etc.) mediante el estudio de un proceso celular relevante a la respuesta
celular a estrés: la formación de gránulos de estrés (SGs).
Objetivos específicos:
1. Visualizar la formación de SGs por monitoreo de la distribución subcelular de RNA poliadenilado
en células de mamífero sometidas a estrés oxidativo. Se realizarán simultáneamente, FISH
(hibridización in situ fluorescente) y tinción de ADN nuclear.
2. Analizar por microscopía de epifluorescencia el efecto en la formación de SGs de inhibidores
traduccionales estabilizadores o desestabilizadores de polisomas.
3. Visualizar conjuntamente con los SGs, estructuras de silenciameinto de mRNAs relacionadas,
denominadas Processing Bodies (PBs). Se realizarán experimentos de transfección transitoria
empleando cDNAs codificantes de DCP1, proteína co-activadora del decapping.
4. Redactar un informe con formato de artículo científico el cual incluirá: 1. Descripción del
fenómeno observado (desesamblado de polisomas, redistribución del RNA poliadenilado y
formación de SGs), 2. Planteo de hipótesis (relación causa-consecuencia entre formación de
SGs y el desensamblado de polisomas y fosforilación de eIF2alfa) y 3. Interpretación y
discusión de los resultados obtenidos.
II. Introducción
II.1 La respuesta a estrés.
Toda célula, desde las bacterias hasta las especializadas neuronas del sistema nervioso
del Homo sapiens, está capacitada para reaccionar cuando las condiciones ambientales son
desfavorables. Esta “reacción” comprende un conjunto de cambios morfológicos y fisiológicos
denominado respuesta a estrés. Distintos estímulos nocivos (radiación UV, golpe de calor, falta de
aminoácidos, condiciones oxidantes, presencia de sustancias tóxicas, proteínas mal plegadas o
patógenos intracelulares) desencadenan un complejo mecanismo de protección que se inicia a
nivel de la regulación de la traducción de mRNAs y concluye en una fina regulación
transcripcional. Para defenderse de distintos agentes estresantes, la célula desplegará distintas
estrategias. Ante el aumento de la concentración intracelular de radicales libres de oxígeno o
especies reactivas de oxígeno (ROS), un conjunto de macromoléculas induce la síntesis de
factores neutralizadores de ROS que facilitan la recuperación del equilibrio redox. Ante la
presencia de proteínas mal plegadas, otra vía de señalización estimula la síntesis de chaperonas
específicas, proteínas encargadas de facilitar el plegamiento de otras proteínas. En todos los
casos esta respuesta adaptativa se inicia con un silenciamiento general de la síntesis proteica.
Esto evita que se acumulen proteínas que puedan ser dañadas por las condiciones de estrés
(oxidadas o mal plegadas en los ejemplos anteriores), además de que permite concentrar la
energía celular en la síntesis de moléculas protectoras.
La capacidad de las células de montar una adecuada respuesta de estrés está
directamente vinculada a su supervivencia. Por eso la respuesta celular a estrés es relevante a
numerosas patologías. Las ROS son liberadas normalmente como producto secundario de la
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actividad metabólica celular. El sistema nervioso central es peculiarmente sensible a un
desbalance redox, dada su intensa actividad metabólica. El estrés oxidativo contribuye a la
etiología y/o evolución de diversas patologías neurodegenerativas. Por otro lado, la exposición a
citoquinas pro-inflamatorias durante una reacción inmunológica o la liberación de ROS por
macrófagos en una inflamación inducen estrés oxidativo. Otro factor patogénico vinculado a estrés
celular es la presencia de proteínas mal plegadas. La muerte o supervivencia de neuronas en
estas condiciones depende de su capacidad para montar una respuesta efectiva de UPR
(unfolded protein response), también conocida como estrés de retículo.
II.2 Estrés celular, fosforilación de eIF2alfa e inhibición traduccional
La iniciación de la traducción es casi siempre el paso limitante en la síntesis de polipéptidos,
ya que la elongación procede más rápidamente. El estrés celular controla la velocidad de la
iniciación, regulando de esta manera la tasa de síntesis proteica general. Un blanco conservado
en la respuesta a estrés es el factor de iniciación eIF2alfa. Este puede ser fosforilado en la Ser 51
por distintas kinasas que son específicamente activadas por distintos factores de estrés. El
eIF2alfa fosforilado resulta inactivo y la traducción de la mayoría de los mRNAs celulares
disminuye drásticamente. Concomitantemente, los polisomas se desensamblan (Figura 1).
Met
Traducción
normal
60S
eIF2
40S
Estrés
celular
stress
Met
Met
PKR
PERK
HRI
GCN2
40S
Met
AAA
eIF2
eIF2
43S
48S
AAA
AAA
80S
Met
60S
Met
PeIF2
Met
AAA
PeIF2
43S*
PeIF2
AAA
X
abortive 48S
Met
AAA
80S
TIA-1/R
Stress granule (SG)
assembly
Figura 1. Distintos estímulos de estrés activan distintas kinasas específicas de eIF2alfa. Cuando este factor de iniciación está
fosforilado se bloquea la incorporación de la subunidad ribosomal mayor. No se incian nuevas rondas de traducción, los
polisomas siguen elongando y eventualmente se desensamblan cuando se alcanza el codón stop
En estas condiciones, ¿cómo pueden ser traducidos los mRNAs de las proteínas de estrés,
colectivamente conocidas como proteínas de heat shock o HSPs? Esto no está del todo claro.
Algunos de los mRNAs que se traducen eficientemente en condiciones de estrés, es decir en
presencia de eIF2alfa inactivo, no emplean el mecanismo general de iniciación de la traducción
basado en un codón de iniciación ATG sino que presentan pequeños marcos de lectura río arriba
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(5’UORF) lo que facilita la re-iniciación aún en presencia de bajas concentraciones de eIF2alfa
activo. Otros no poseen una estructura CAP en el 5’UTR, sino que presentan sitios internos de
entrada de ribosomas (IRES), facilitando la iniciación en ausencia del factor 4G (que también es
inactivado en condiciones de estrés). Con estos elementos, el reclutamiento de factores de
iniciación y de subunidades ribosomales está asegurado aún cuando la traducción general se
encuentre silenciada (los review de Holcik y Sonemberg, 2005 y Gebauer y Hentze, 2004, ofrecen
una descripción detallada de los mecanismos moleculares subyacentes).
La fosforilación del eIF2alfa es transitoria y en todos los casos la fosfatasa denominada PP1
(Protein Phosphatase 1) es clave. Esta se activa por estrés celular: el transcripto de GADD34, un
activador de la PP1 contiene uORFs y esto facilita su traducción cuando eIF2alfa está fosforilado.
II.3 Gránulos de estrés
La respuesta a estrés es conocida hace décadas, sin embargo todavía se siguen realizando
hallazgos relevantes, como es el caso de la formación de gránulos de estrés (SGs). Estas densas
estructuras citosólicas aparecen en toda célula eucariota sometida a diversas condiciones de
estrés. Los SGs son grandes ribonucleopartículas, inducidas específica y transitoriamente por
estrés celular que contienen RNA poliadenilado (Figura 2). Se cree que la mayoría de los mRNAs
celulares que interrumpen su traducción son almacenados en los SGs, conjuntamente con parte
de la maquinaria traduccional. Los SGs contienen los factores de iniciación 4E y 4G, PABP y
subunidades ribosomales 40S y excluyen subunidades mayores (60S). Además se ha descripto
un número reducido de proteínas de unión a RNA que desempeñan distintas funciones:
represores traduccionales, estabilizadores, RNasas. En particular, las proteínas TIAR y TIA-1 son
proteínas normalmente nucleares que poseen dominios de unión a RNA y dominios de agregación
del tipo prion. Estos últimos median la agregación, la cual es regulada negativamente por la
actividad chaperona de HSP70. TIA1 y TIAR son clave en el ensamblado de SG y resultan por lo
tanto excelentes marcadores moleculares de estas estructuras.
Los SGs son altamente dinámicos, sus componentes se intercambian continuamente con el
citosol. Varios grupos de investigación reportaron que drogas que estabilizan polisomas evitan la
formación de gránulos de estrés, en tanto que drogas que desensamblan polisomas potencian su
formación por estrés celular (Figura 3).
No está claro si la formación de SGs es un requerimiento para la inhibición traduccional
eficiente o si es una consecuencia del mismo. En general se acepta esta última hipótesis. Los
complejos de iniciación de 48 S abortados que se forman en presencia de bajas cantidades de
eIF2alfa (recordemos que la mayor parte de eIF2alfa está fosforilado en condiciones de estrés)
serían agregados por la acción de TIA1/TIAR. Los SGs se forman transitoriamente,
desapareciendo gradualmente aun en presencia del agente estresor. La Figura 4 muestra la
correlación temporal de la presencia de SGs con la fosforilación de eIF2alfa.
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Figura 2: Formación de SGs en células de mamífero expuestas durante los tiempos indicados (min) a Arsenito 0,5 mM. Se realizó
inmunofluorescencia para TIA1.
Puromicina
Figura 3: Desensamblado de polisomas por
tratamiento con puromicina: La puromicina
es una droga inhibitoria de la síntesis
proteica, que interrumpe la elongación de la
cadena polipeptídica. Al unirse la puromicina,
el ribosoma queda con sus sitios A y P
vacantes, lo cual disminuye su afinidad por
mRNA y los polisomas se desensamblan.
(http://www.cs.stedwards.edu/chem/Chemistr
y/CHEM43/CHEM43/Protinhib/transan.html)
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Figura 4: La formación de SGs es transitoria. El porcentaje de células con SGs alcanza un máximo a 30-120 min después del
estímulo de estrés, dependiendo del tipo e intensidad del mismo (en este caso, células NIH 3T3 fueron tratadas con 0.250
mM de arsenito, conocido inductor de estrés oxidativo). La inhibición de la síntesis proteica (no mostrado) correlaciona
temporalmente con la formación de gránulos de estrés y con la fosforilación de eIF2alfa.
___________________________________________________________________________
III. Modelo experimental y metodología general
III.1 Uso de líneas celulares.
Las líneas celulares son ampliamente utilizadas como modelo experimental para
investigaciones en diversos temas, incluyendo control del ciclo celular, transducción de señales,
transporte intracelular, regulación transcripcional, etc. Son siempre preferidas frente al uso de
cultivos primarios, los cuales son comparativamente más laboriosos y frecuentemente muy
variables. Existen diversas líneas celulares, con mayor o menor grado de diferenciación. Por
ejemplo, las líneas neuro2A y PC12 son prototipos de neuronas y pueden ser tomadas, dentro de
ciertos límites, como modelo experimental para el estudio de ciertas funciones neuronales. La
línea celular que se escoge es en gran medida determinante de la universalidad de las
observaciones que realicemos. El ejemplo más claro de esto es el hecho de que líneas celulares
tumorales suelen tener alteradas diversas funciones que hacen a su supervivencia: respuesta a
estrés, muerte celular programada (apoptosis), inhibición de crecimiento por contacto o
hambreado, etc.
En este trabajo práctico, emplearemos las líneas celulares NIH 3T3 o U2OS. La línea NIH 3T3
es no tumoral, de tipo fibroblastoide, y fue obtenida a partir de embriones de ratón de la cepa NIH,
con el siguiente ritmo de pasajes en P100 (placas de 100 mm): cada 3 días, eran transferidas 3
millones de células. Las células NIH3T3 no son tumorales, y en muchos aspectos se comportan
en forma similar a cultivos primarios. La línea U2OS deriva de un osteosarcoma humano y
presentan altísima capacidad de transfección. Ambas líneas celulares requieren condiciones de
bioseguridad 1, lo cual es excepcional para células de origen tumoral humano, por lo que las
U2OS son un modelo experimental muy usado.
NOTA: simultáneamente a la línea NIH3T3 se aisló también de fibroblastos embrionarios, la línea
celular NIH3T12, en donde se plaqueaban cada 3 días 12 millones de células en la misma
superficie que las NIH3T3. A diferencia de las NIH3T3, las NIH3T12 no presentan inhibición por
contacto. ¿Por qué?
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III.2 Inducción de estrés oxidativo por arsenito en U2OS.
Se empleará como modelo de estrés oxidativo agudo la exposición a sales de arsénico. Este
es un modelo ampliamente utilizado dado la facilidad experimental que ofrece. Se empleará como
agente de estrés una dosis de arsenito de sodio 0,05 mM en medio condicionado, es decir el
mismo en el que las células están creciendo al momento del experimento. Esta dosis de arsenito
es sub-letal, es decir que las células se recuperan y pueden proseguir su ciclo celular
normalmente.
III.3 Visualización de estructuras intracelulares
A)Tinciones fluorescentes
Se dispone actualmente de numerosos reactivos comerciales con fuerte afinidad por
componentes de distintas estructuras intracelulares. De esta manera es posible distinguir
mitocondrias, retículo endoplásmico, Golgi, cromatina y estructuras de citoesqueleto sin recurrir a
inmunotinciones. En este TP emplearemos tinciones específicas para núcleo y microfilamentos.
Núcleo: El DAPI es un colorante fluorescente que se une a DNA, marcando claramente la
cromatina y cromosomas en células en cultivo. La visualización de la cromatina con DAPI,
además de facilitar la identificación de células individuales, permite monitorear estadios de la
mitosis y correlacionar preliminarmente el fenómeno en estudio con el ciclo celular (Figura 6A).
Microfilamentos: La Falloidina es un alcaloide sintetizado por Amanita phalloides. La actina
polimerizada en microfilamentos o F-actina, es visualizada fácilmente por tinción con falloidina
conjugada con un fluoróforo. La visualización de F-actina permite identificar el contorno celular, los
microfilamentos corticales, las fibras de estrés y los sitios de adhesión focal. El patrón de F-actina
es característico de cada tipo celular y, por lo tanto, el aspecto del citoesqueleto de actina puede
ser indicativo del estado de “salud” celular. En ciertas condiciones, incluyendo estrés oxidativo en
neuronas y en ciertas enfermedades neurodegenerativas, se ha descripto la formación de
agregados de actina y ADF/cofilina (“actin-rods”) (Figura 6B).
A
B
Figura 6: A, tinción de núcleos por DAPI. B,
tinción con Falloidina de células NIH3T3. Se
observan fibras de estrés.
B)Transfección transitoria de construcciones reporteras basadas en proteínas
fluorescentes .
La introducción en células en cultivo de genes codificantes de proteínas quimeras para
el estudio de su localización subcelular y función es una estrategia comúnmente empleada en
Biología Celular. En este práctico se realizará la transfección de plásmidos por lipofección. Se
utilizarán construcciones reporteras de la proteína
coactivadora de decapping DCP1a,
frecuentemente empleada como marcador de “processing bodies” (PB). Se emplearán fusiones de
una proteína marcadora de PBs a una etiqueta molecular denominada FLAG, la cual es
reconocida por anticuerpos específicos, de fuentes comerciales. RFP, mCherry, GFP (Green
fluorescent protein) y sus variantes son moléculas “tag” o reporteras de amplio uso, siendo su
ventaja principal la capacidad de fluorescer en el medio intracelular. De esta manera proporciona
una señal que puede observarse en células vivas o fijadas, y sin requerir tinciones específicas.
En experimentos de transfección transitoria o “transiente”, se observa que un porcentaje
variable de células, dependiendo del método, de la línea celular y de la construcción, expresan el
gen transfectado, en niveles variables de célula a célula. Según el tipo de experimento, se
preferirá fuerte sobre-expresión por promotor viral, o bajos niveles, cercanos a los endógenos.
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Figura 7: Expresión de GFP en fibroblastos BHK (Baby Hamster
Kindney) por transfección transitoria. Los porcentajes de eficiencia de
expresión pueden alcanzar 70-90 %, con las células mostrando
distinta intensidad de fluorescencia
C) Inmunofluorescencia
Esta técnica permite determinar la distribución subcelular de proteínas específicas. Después
de fijadas y permeabilizadas las células, se realizan los siguientes pasos:
- Saturación de todos los lugares de unión inespecíficos, para evitar la unión inespecífica de
anticuerpos.
- Incubación del preparado con un anticuerpo primario contra la proteína de interés.
- Lavado del exceso de anticuerpo.
- Incubación con anticuerpos unidos a grupos químicos fluorescentes. También se pueden usar
anticuerpos secundarios unidos a enzimas. En este caso se utilizan sustratos específicos de forma
que sus productos coloreados insolubles se depositen en el lugar donde se encuentran las
proteínas de interés.
D) FISH
FISH, o hibridación fluorescente in situ, es una técnica de marcación específica de ácidos nucleicos
mediante la cual los mismos son hibridados con sondas fluorescentes que permiten su visualización
La técnica de FISH permite la observación detallada de la distribución de mRNAs específicos. En
este caso empelaremos una sonda de oligodT marcada con el fluoróforo Cy2, que nos permitirá
visualizar la distribución del RNA poliadenilado, el cual se acumula en SGs bajo condiciones de estrés
celular
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IV. Desarrollo experimental
Se emplearán las siguientes técnicas:
A. Manejo de cultivos celulares in vitro de líneas establecidas (osteosarcoma U2OS).
B. Evaluación de la viabilidad celular ante un estímulo estresor.
C. Localización subcelular por microscopía de epifluorescencia y confocal utilizando marcadores
de estructuras y organelas celulares:

Sondas de oligodT conjugadas a Cy2

Tinciones diferenciales (e.g. DAPI para núcleos)

Proteínas de fusión fluorescentes
______________________________________________________________________________
IV.1 Estudio de la viabilidad celular frente a una condición de estrés por tinción con
Cristal Violeta y observación al microscopio de la morfología celular
OBJETIVO
Estudiar la viabilidad de células U2OS luego de la inducción de estrés a distintos tiempos
mediante el uso de H2O como agente estresor.
ESQUEMA EXPERIMENTAL
Los docentes plaquean células U2OS en 36 pocillos de MW96 y en 3 pocillos de MW12.
Día 1: Se incuban las células de las MW96 en distintas condiciones (medio de cultivo, PBS 1x,
H2O) durante 30 y 60 minutos. Se fijan las células, se tiñen con Cristal Violeta y se lavan. Se
dejan secando las placas a temperatura ambiente (TA). Se observa el efecto de los
tratamientos en las células de la MW12 al microscopio a lo largo del TP.
Día 2: Se solubiliza el colorante y se determina la Absorbancia a 590-595 nm.
PROCEDIMIENTO
Día 1
A.- Tratamiento de las células y tinción con cristal violeta
Tratamiento
Se emplearán pocillos de MW96 (volumen de medio de cultivo: 0,1 ml). Cada grupo recibirá una
placa con 36 pocillos con células que se utilizarán según el siguiente esquema:
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Se descarta únicamente el medio de los pocillos que se incubarán 60 minutos, se lavan con
aproximadamente 200 µl de PBS y se agregan 80 µl del tratamiento que corresponda según el
esquema anterior, PBS 1x y H2O, respectivamente. Se incuban durante 30 minutos a 37°C.
Transcurrido ese tiempo, se descarta el medio de los pocillos que se incubarán 30 minutos, se
lavan y se agregan 80 µl del medio que corresponda según el esquema. Se incuban durante 30
minutos a 37°C. De esta manera, todos los tratamientos finalizan en el mismo momento.
Tinción con Cristal Violeta
Se retira el medio y se lavan las células con 0,1 ml de PBS 1x (siempre agregando las soluciones
por la pared del pocillo para evitar que las células se levanten).
Para fijar las células se agregan 50 µl de Metanol por pocillo y se incuban durante 10 minutos a 20 °C. Luego, se descarta el Metanol y se agregan 50 µl de Cristal Violeta 0,5 % en Metanol por
pocillo para teñirlas (agregar colorante a 6 pocillos vacíos para utilizar como blanco). Incubar
durante 10 minutos a TA. Recuperar el Cristal Violeta de los pocillos en el tubo correspondiente.
Finalmente, se realizan lavados con agua para retirar el excedente de colorante y se deja secando
a TA, protegido de la luz, hasta la clase siguiente.
B.- Observación al microscopio
Inmediatamente después de comenzado el tratamiento de las células de la MW96, un grupo
prepara las células para observación.
Se descarta el medio de 2 de los 3 los pocillos de la placa MW12, se lavan con 400 µl de PBS y
se agregan 400 µl de PBS 1x y H2O respectivamente. Observar al microscopio el efecto de cada
tratamiento sobre la morfología celular en diferentes momentos a lo largo de TP.
Día 2
Determinación de Absorbancia a 595 nm
Se solubiliza el colorante agregando 0,1 ml de Ácido acético 10% a cada pocillo y se incuba la placa
durante 30 minutos a TA.
Se determina la Absorbancia a 590-595 nm utilizando un espectrofotómetro de placa según las
instrucciones del docente. Graficar la Absorbancia en función de cada condición para evaluar la
viabilidad celular en cada condición ensayada.
______________________________________________________________________________
V. 2 Formación de gránulos de estrés (SGs) y efectos farmacológicos de
Cicloheximida y Puromicina
OBJETIVOS:
- Evaluar la formación de SGs como resultado del tratamiento con arsenito durante 90 min,
visualizados por la técnica FISH.
- Evaluar el efecto en la formación de SGs de drogas que estabilizan o desestabilizan polisomas
ESQUEMA EXPERIMENTAL
Los docentes plaquean células U2OS, 6 MW24 por grupo, cada uno con 1 vidrio
Día 5: Se realiza el tratamiento con arsenito (0,05 mM arsenito), con arsenito más droga
(cicloheximida o puromicina 100 µg/ml cada una) y con cada droga por separado. Tiempo de
tratamiento: 90 min.
Días 6 y 7: Se realiza la FISH, la tinción con DAPI y el montaje.
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Días 8 y 9: Adquisición de imágenes.
Día 10: Análisis de imágenes
PROCEDIMIENTO
Día 5
1- Formación de SGs en respuesta al Arsenito. Tratamientos farmacológicos
Se utilizan células plaqueadas el día anterior. Se emplearán pocillos de MW24 (volumen de
medio: 0,5 ml) en las que se habrán colocado vidrios redondos (“covers”) tratados con polilisina
(las U2OS tiene fuerte adherencia a vidrio, por lo que puede omitirse le tratamiento con polylisina). Los vidrios se emplearán para Hibridación in situ fluorescente (FISH).
Cada grupo recibirá una placa con 6 pocillos con células que se utilizarán según el siguiente
esquema:
1. Retirar el medio condicionado (MC) a todos los pocillos y pasarlo a un tubo Falcon de 15 ml
vacío.
2. Tomar 300 µl de MC del tubo Falcon y pasarlo al pocillo 1 (Vehículo) y 150 µl de MC a los 5
pocillos restantes.
3. Colocar 450 µl del MC en el tubo eppendorf que contine 50 µl de arsenito 5 mM y mezclar bien
con pipeta. Este eppendorf posee ahora MC y arsenito a una concentración 0.5 mM, que es 2x del
final (0.25 mM final). Este es el eppendorf “MC+ars”
4. Agregar 150 µl de “MC+ars” directamente al pocillo 4 (Arsenito) y aparte 150 µl a uno de los
eppendorfs que contiene cicloheximida y 150 µl a un eppendorf que contiene Puromicina (ambas
están 100 x).
5. Agregar 150 µl de MC que tienen en el falcon (“MC SIN Ars”) a los otros dos eppendorfs con
sendas drogas.
6. Agregar todo ese volumen (153 ul) a cada pocillo correspondiente.
7. Incubar en la estufa a 37 grados por 60 minutos.- Se retira el medio y se fijan las células
siguiendo el protocolo C
Las concentraciones de uso son: NaAsO2
0,25 mM
Stock: 5mM
Puromicina: 100 g/ ml
Stock: 10 mg/ml
Cicloheximida: 100 g/ml
Stock: 10 mg/ml
Los “stocks” de arsenito, puromicina y cicloheximida son soluciones acuosas.
Discuta la necesidad de incluir el control de vehículo en cada caso.
2- Fijación de vidrios para FISH
Se utiliza el Protocolo C. La fijación se realiza a temperatura ambiente con PFA 4% por 15
minutos. Después de la fijación se realizan 3 lavados con 0,5 ml de PBS (5 minutos cada uno). Si
no van a procesarse inmediatamente los vidrios pueden lavarse con 1 ml agua, escurrir y congelar
a -70ºC
Días 6 y 7
1- FISH y tinción con DAPI
Para realizar la FISH utilizar el Protocolo D con sonda de oligodT fluorescente
Simultáneamente se visualizan los núcleos por tinción con DAPI.
Días 8 y 9
1- Visualización de gránulos de stress
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Se realizan micrografías 40x (o 100x si fuera necesario) para evaluar cuantitativamente la
distribución subcelular de RNA poliadenilado. Para un instructivo general del correcto uso de
microscopios ver el punto H al final de la guía
Día 10
1- Interpretación de las imágenes:
Después de un análisis detenido de las imágenes, se seleccionará un criterio para cuantificar los
cambios observados.
i) Describa brevemente que es lo que observa (presencia de acúmulos, tamaño, distribución y
abundancia de éstos, etc.) a los 90 min post-estímulo en comparación con la condición basal
ii) Discuta cuales parámetros le parece conveniente evaluar para tener una medida cuantitativa de
los cambios observados:
a) Porcentaje de células con acúmulos. Cuantos acúmulos debe tener una célula para
considerarla positiva
b) Tamaño de los acúmulos
c) Número de acúmulos por célula.
d) Número de acúmulos por célula normalizado al volumen celular.
e) etc.
iii) Discuta la necesidad de realizar este análisis empleando microscopía confocal
Para cada tratamiento, se calcula el porcentaje de células mostrando los fenotipos escogidos
como significativos.
NOTA: Un criterio aceptado para estimar el número de células N que deben evaluarse es el
siguiente: N para cada condición es tal que la frecuencia de los distintos fenotipos no cambia al
evaluar N + N/10 células. En la práctica, para la observación de SGs, N es aproximadamente 100200 células.
1- Describir los cambios observados en la distribución subcelular de la sonda de oligo dT
en presencia de Arsenito
2- ¿Qué puede concluir respecto al efecto de desensamblado o estabilización de polisomas
en la formación de los gránulos de estrés?
IV. 3 Empleo de una construcción reportera para la visualización de Processing
Bodies (PBs)
OBJETIVO
Comparar la distribución de SGs y de PBs empleando construcciones codificantes para
proteinas marcadoras transfectadas transitoriamente
ESQUEMA EXPERIMENTAL
Se plaquean células U2OS en placas de 24 pocillos. Se tripsinizan las células y se plaquea el
número de células pre-estipulado en placa de 24 pocillos (MW24).
Se realiza la transfección. Entre 8 y 24 horas después se realiza el tratamiento con arsenito
durante 90 minutos. Se fijan los cubre-objetos y se realiza una FISH con oligodT o la
inmunofluorescencia correspondiente. Se analiza la formación de SGs y se analiza la distribución
de las proteínas marcadoras de PBs en comparación con los SGs mediante microscopía confocal
o de epifluorescencia
1. Hay algún cambio en la distribución subcelular de la proteína marcadora de PBs
en condiciones normales y de estrés.
2. ¿Qué relación se observa entre los PBs y los SGs?
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V. Informe Final
Confeccione un informe con formato de artículo científico discutiendo los resultados
obtenidos en IV1, IV2 y IV3.
Incluya las siguientes secciones:
1. Introducción
2. Materiales y Métodos
3. Resultados
4. Discusión
Las recomendaciones para la elaboración pueden leerse en el punto I al final de la guía
Presentación oral del informe:
El enfoque debe estar en la estrategia de publicación, no en la naturaleza de los datos, los cuales
ya se discutieron / criticaron / aceptaron / descartaron o aprobaron en clase. En este sentido, esta
presentación debe diferir de la de un seminario típico, en donde el énfasis está puesto en los
resultados.
Cada grupo de trabajo presentará, en 15 min:
- Uno o varios títulos a elegir. Discutir ventajas y desventajas.
- Cual es el foco del manuscrito
- Qué información se incluye en la introducción
- Títulos a incluir en Materiales & métodos
- Los títulos de las subsecciones si las hay.
- Las figuras en su versión más definitiva. Discutir si blanco y negro o color, barras o grafico x-y,
etc. Células únicas o campo con varias células. Flechas y asteriscos en ellas.
- Los títulos y contenido de las leyendas de figuras.
- Breve descripción de los puntos más importantes a incluir en la Discusión.
- Breve enumeración del listado bibliográfico.
VI. Bibliografía








Holcik M and Sonenberg N (2005). Translational control in stress and apoptosis. Nature
Cell Biol 6: 320-326
Anderson, P and Kedersha, N. (2006) RNA granules J Cell Biol 1-6
Kedersha and Anderson (2007) Methods in Enzymology, 431: 61-81
Kedersha N, Chen S, Gilks N, Li W, Miller IJ, Stahl J, Anderson P.(2002) Evidence that
ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core
constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell 13:195-210.
Buchan and Parker (2009) Eukaryotic Stress Granules: The Ins and Outs of Translation.
Mol Cell 36, 932-941.
Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., and Boccaccio, G. L. (2011) RNA granules:
The good, the bad and the ugly, Cell Signal 23(2):324-334.
An, S., et al., Reversible compartmentalization of de novo purine biosynthetic complexes in
living cells. Science, 2008. 320(5872): p. 103-6.
Narayanaswamy, R., et al., Widespread reorganization of metabolic enzymes into
reversible assemblies upon nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009 106(25):
p. 10147-52.
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VII. Bioseguridad
DAPI (4,6 Diamidino-2-Phenylindole)
CARCINOGENIC EFFECTS: Not available.
MUTAGENIC EFFECTS: Classified PROVEN for human. Mutagenic for mammalian germ and
somatic cells based on in vitro studies. Mutation Data: DNA damage: 100 µg/L, HeLa cells, human;
cytogenic analysis: 25 mg/L, fibroblast, hamster; 50 mg/L, leukocyte, human.
TERATOGENIC EFFECTS: Not available.
Eye Contact Hazardous in case of eye contact (irritant).
Aggravating conditions Repeated exposure to a highly toxic material may produce general
deterioration of health by an accumulation in one or many human organs.
Paraformaldheído
Potential Acute Health Effects:
Very hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant). Hazardous in case of skin
contact (sensitizer), of ingestion, of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact
(corrosive), of eye contact (corrosive). The amount of tissue damage depends on length of contact.
Eye contact can result in corneal damage or blindness. Skin contact can produce inflammation and
blistering. Inhalation of dust will produce irritation to gastro-intestinal or respiratory tract,
characterized by burning, sneezing and coughing. Severe over-exposure can produce lung
damage, choking, unconsciousness or death. Inflammation of the eye is characterized by redness,
watering, and itching. Skin inflammation is characterized by itching, scaling, reddening, or,
occasionally, blistering.
Arsenito de sodio (polvo)
May cause CANCER.
Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Cicloheximida
Potential Acute Health Effects:
Very hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of ingestion, of inhalation.
Severe over-exposure can result in death. Inflammation of the eye is characterized by redness,
watering, and itching. Skin inflammation is characterized by itching, scaling, reddening, or,
occasionally, blistering.
Puromicina
Potential hazardous compound, CAUTION: may be harmful if swallowed
- Eyes: May cause irritation.
-Skin: Can cause moderate skin irritation,. Not likely to cause permanent damage.
- Inhalation: Can cause moderate respiratory irritation.
-Ingestion: may be harmful if swallowed
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VIII. Protocolos
________________________________________________________________________________________________
A. Tratamiento de cubre-objetos de cultivo con Poli-L-lisina
1- Esterilizar los cubre-objetos de vidrio sumergiéndolos en etanol 70%, flamearlos en mechero
hasta secarlos (moverlos constantemente para evitar que estallen) y colocarlos en los pocillos.
2- Agregar poli-L-lisina 0.01% y dejar incubando a 37°C al menos durante 30 minutos (puede ser
durante un tiempo más prolongado).
3- Enjuagar 3 veces con agua apirógena.
4- Dejar secar en campana de cultivo.
5- Guardar en esterilidad hasta su uso.
Los cubre-objetos con poli-lisina deben usarse dentro de los 3-4 días.
B. Plaqueo de células
1- Sacar el medio (con la bomba y pipeta pasteur o con pipeta) y realizar 1 lavado con PBS.
2- Agregar TRIPSINA 0,25 % / EDTA 0,2 % (0,5 ml, o lo necesario para cubrir las células).
3- Poner en la estufa 3-5 minutos (no debe pasarse este tiempo de digestión).
4- Disgregar los cúmulos de células con pipeta. Agregar igual volumen de medio de cultivo que
contiene 10% de suero fetal bovino (FBS). El suero es importante para la inhibición de la tripsina.
Opcional: Centrifugar 5-10 minutos a 1000-1200 rpm (para eliminar la tripsina), descartar el
sobrenadante y resuspender las células suavemente en 5 ml de PBS.
5- Combinar 20 microlitros de células + 20 microlitros de Tripan-blue (0.4%) y contar en cámara de
Neubauer (ver esquema) bajo el microscopio. Para un correcto uso del microscopio ver el punto H
al final de esta guía.
6- Se contabilizan las células en los cuadrados fuera de la cruz central (si hay poca cantidad de
células se cuentan los 4 cuadrados, si hay gran cantidad se pueden contar las células de los
cuadrados ubicados en diagonal).
Figura 8. Esquema de la cámara de Neubauer vista al microscopio
(objetivo 10 X)
Nº de células/ml = Nº de células (en los cuadrados contados)* 10exp4 * dilución
Nº de cuadrados contados
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_______________________________________________________________________________________________
C. Fijación de vidrios para FISH o inmunofluorescencia
1-Agregar fijador (PFA 4%) e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente.
2- Después de la fijación se realizan 3 lavados con 0,5 ml de PBS (5 minutos cada uno). Si no van
a procesarse inmediatamente, los vidrios pueden guardarse por un día en PBS. También se
pueden lavar con agua, aspirar bien y congelar hasta su próximo uso a -70ºC. (En todos los casos
debe determinarse experimentalmente si se afecta la detección de las moléculas en estudio).
D. Protocolo FISH con oligo-dT
1-Fijar células con 0,4 ml de PFA 4% durante 15 min. Si la FISH no se realiza a continuación,
lavar 3X con 0,5 ml de PBS, 1X con agua, escurrir bien y congelar a -80ºC. Recordar envolver
con Parafilm el costado de la placa.
2- Lavar con 0,5 ml de PBS
3- Permeabilizar con 0,2 ml de TX-100 0.1% por 10 min
4- Lavar con 0,5 ml de PBS
5- Bloquear con reactivo de bloqueo 1% por 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda.
Para ello colocar una gota de 15 l en parafilm (no estirar el parafilm excesivamente) y apoyar los
vidrios con las células para abajo en un recipente cerrado con papeles empapados en agua. En
todos los pasos de transferencia de vidrios hay que evitar pinchar al parafilm con las pinzas: es la
causa más frecuente de que el líquido se vaya para abajo y borronee los rótulos.
6- Prehibridizar por 90 minutos a temperatura ambiente con 15 l de solución de
prehibridización, en cámara húmeda.
7- Hibridizar ON con 15 l de solución de hibridización a temperatura ambiente, en cámara
húmeda. ¡Cubrir con papel metálico! ¡A partir de aca proteger de la luz!
8- Transferir los vidrios a MW24 con las células para arriba y lavar con 0,4 ml de SSC 4X por 5min
9- Lavar dos veces con 0,4 ml de SSC 2X, por 5 min cada vez
10- Teñir con DAPI durante 10 minutos: transferir el vidrio con las células hacia abajo sobre una
gota de 15 l de DAPI en SSC1X
11- Lavar con con 0,4 ml de SSC1X por 5 min, y montar los vidrios en 5 l de Gelvatol
En general, todo el material utilizado para una FISH debe ser libre de RNAsas. En el caso
particular de este TP, no es necesario ¿Por qué le parece que es así?
Soluciones:
a) Solución básica
Reactivo de bloqueo 1%
Denhard 5X
SSC 4x
SDS 5%
FORMAMIDA 35%
b) Solución de Prehibridización: Sc Basica + ADN de esperma de salmón a dilución 1:25.
Precalentar la Solución básica a 37°C
c) Solución de Hibridización: Solución de prehibridización + sonda oligo dT (Cy2) en dilución
1:200. PROTEGER DE LA LUZ.
Stocks
ADN esperma de salmón (ADNes): 25X
Sonda oligo-dT: 200X
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Ejemplo:
Para preparar 100 µl de Solución de Prehibridización: Tomar 96 µl de Solución básica y agregarle
4 µl de ADN esperma de Salamón
Para preparar 100 µl de Solución de hibridización: Tomar 96 µl de Solución Básica + 4 µl de ADN
esperma de Salmón + 0,5 µl de Sonda
E. Inmunofluorescencia
1. Permeabilizar con 500 l Triton X-100 0,1 % 10 min.
2. Lavar con 500 l PBS por 5 min.
3. Bloquear con BSA 1 % en PBS por 1 hora.
4. Incubar con el anticuerpo primario (dilución apropiada en sc. de bloqueo) por 1 hora.(*)
5. Lavar con PBS 4 veces por 2 min.
6. Un lavado con BSA 1 % 10 min.
7. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo (dilución apropiada en sc. de
bloqueo y con DAPI 100 nM) (*) durante 30 min. ¡Cubrir con papel metálico!!
8. Lavar 3 veces con PBS por 2 min c/u.
9. Colocar los cubre-objetos invertidos en una gota de 30 l, sobre parafilm en cámara húmeda.
¡Cubrir con papel metálico!
10. Lavar con PBS 3 veces por 5 min c/u.
11. Guardar a 4 ºC o montar en Fluorsave (reemplazar por 5 l/vidrio de gelvatol si se usan
anticuerpos conjugados a Cys o Alexa dyes).
(*)Para N covers, preparar (N+1) x 30 l de la dilución
Volumen recomendado para incubación de anticuerpos:
Cubre-objetos 10 mm: 25 l
Suero como bloqueante:
Se agrega al bloqueo y durante la incubación con el anticuerpo primario.
Cabra, dilución 1:10
Conejo, dilución 1:50
Anticuerpos primarios:
anti-eIF3η: policlonal cabra, dilución 1:300
Anticuerpos secundarios:
Antiratón o anti cabra, según sea el primario, dilución 1:500 o la que se indique
________________________________________________________________________________________________
F. Tinción con Falloidina y/o DAPI. Montaje.
En el último lavado de la FISH o de la IF, se agregan Falloidina conjugada a un fluoróforo adecuado
(dilución a determinar) y DAPI (1 ng/ml)
Montaje:
Gelvatol para para Cy3, Cy2, DAPI
Fluorsave para rodamina, fluoresceína, DAPI
________________________________________________________________________________________________
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G. Lipofección de células
Transfección en placa de 24 pocillos (MW24)
1- Plaquear células (50.000 A 80.000 en el caso de U2OS) el día anterior en pocillos de MW24, en
la que se colocaron cubre-objetos de 12 mm de diámetro en 500 l de medio completo.
2- Diluir en un eppendorf 0,5 g de plásmido en 50 l de jetPRIME buffer y vortexear.
3- Agregar 1 l de JetPRIME Reagent y vortexear. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Esto se hace independientemente para cada pocillo o en bloque, escalando estas cantidades
4- Agregar los 50 l de los complejos a las células (Volumen final 550 l).
5- Opcional: cambiar el medio a las 4-6 hs.
________________________________________________________________________________
H. Instructivo general para el uso de microscopios
Ver video en el link http://vimeo.com/64405384 antes del comienzo de la materia
1. Si es necesario traslade el microscopio con sumo cuidado hasta la mesada de trabajo
tomándolo de la columna con una mano y sujetando la base del mismo con la otra mano.
2. Quite la funda.
3. Encienda el microscopio.
4. Coloque el preparado o la placa con células en la platina.
5. Aumente la intensidad lumínica.
6. Enfoque con el objetivo de menor aumento.
7. Pase a otros aumentos colocando la mano sobre el revólver, NO sobre los objetivos.
8. Cuando necesite observar con el objetivo de inmersión (100x), coloque una pequeña gota
de aceite sobre el cubreobjetos. Si necesita cambiar la zona de enfoque rote el revólver en
sentido inverso (de 100x a 4x y luego a 10x) sin pasar por el objetivo de 40x.
9. Cuando cambie el preparado o bien no va a continuar observando por un breve tiempo,
baje la intensidad lumínica y apague el microscopio.
10. Una vez finalizada la observación asegúrese de:
a) Ajustar el tornillo de los oculares si lo utilizó.
b) Rotar el revólver dejándolo centrado en el objetivo de menor aumento.
c) Limpiar el objetivo de 100x quitando el aceite con el papel especial para lentes
(papel arroz). Si requiere de una limpieza más profunda, embeba el papel arroz con
una solución de 70% de éter etílico y 30% de alcohol etílico.
d) Limpiar la platina si hubo algún derrame.
e) Dejar abierto el diafragma.
f) Bajar la intensidad lumínica.
g) Apagar y desenchufar el microscopio.
h) Cubrir el microscopio con su funda antipolvo.
i) Trasladar el microscopio a su ubicación con sumo cuidado si hubo traslado.
Atención: Los microscopios de fluorescencia tienen cuidados y consideraciones adicionales que
serán discutidas durante el TP.
I. Instructivo para la elaboración del informe
Consideraciones Generales:
Longitud total: 4 páginas, incluyendo figuras
- Utilizar oraciones cortas, sin estructuras rebuscadas. Lenguaje plano (por oposición al lenguaje
en artículos de difusión), evitar uso de metáforas y comparaciones
- Cuidar tiempos verbales (presente para lo asentado en la literatura, pasado para lo que se
describe en el presente artículo), evitar voz pasiva, y el uso del potencial (“estos resultados
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pag 20
podrían sugerir una posible conexión…”: “estos resultados sugieren (no necesariamente
demuestran) que X es causa de Y”).
Título compatible con los resultados, idealmente informativo del mensaje global del paper (Evitar
“Estudio de la formación de SGs y efecto de las drogas tales y cuales- Habitualmente una oración
con sujeto y predicado ayuda a la claridad).
Abstract (200-300 palabras). Se confecciona a partir de destacar los puntos más relevantes de la
Introducción, Resultados y Discusión. Tiempo verbal presente o pasado.
Palabras clave: 5 que no figuren en el título. Se escogen como orientación del foco y focos
secundarios del trabajo. Su utilidad es fundamentalmente para indexar.
Introducción: ir de “mayor a menor”, de conceptos globales a preguntas particulares. Citas
bibliografiítas. Que interrogante se aborda en este trabajo. Anticipar brevemente que se descubrió.
No puede exceder en longitud la sección Resultados.
Materiales y Métodos: lo necesario para garantizar rigor en los experimentos realizados y que otro
lo pueda reproducir, lenguaje –convertir los protocolos (habitualmente en presente) en lo que ya
se hizo. Cuando corresponda detallar protocolo o remitir a manuales o papers anteriores. Cuando
corresponda indicar marca de un reactivo o modelo de un equipo. Indicar que tratamiento se les
dio a las imágenes de microscopía.
Resultados (O Resultados y Discusión)
Considerar dividir en subsecciones.
Describir resultados con un hilo conductor: observación-hipótesis-testeo experimental en el
siguiente ensayo-los resultados sugieren/ son compatibles con…
Considerar no contar los experimentos en el orden en que se realizaron, sino en el más didáctico
o que ayuda a la comprensión del trabajo
Hacer siempre alusión a la figura (panel de figura, cual célula, marcada con flecha o asterisco) que
muestra la observación que se describe. Tiempo verbal: obligatoriamente pasado.
Figuras de leyendas, Resultados y Materiales y Métodos no deben ser demasiado redundantes.
Cada uno tiene un mensaje distinto
Figuras: buscar células que representen lo que muestran los gráficos de cuantificación. No hace
falta mostrar todos los marcadores celulares que se emplearon. Mantenerlas lo más simple
posible. En general se recomienda blanco y negro (hay un % de daltonismo importante en el
mundo) y colores solo cuando es necesario mostrar más de un marcador.
Leyendas de figuras: Poner lo mínimo necesario para que se entienda el experimento. Puede
incluir o no una pequeña interpretación del resultado (“tal cosa inhibe tal proceso”). Algunas
revistas desaconsejan (o prohíben) esto último.
Es informativo incluir un breve título en cada una de ellas, que conecte con las subsecciones de la
sección Resultados.
Discusión o Conclusiones y Perspectivas. NO son un resumen de lo ya escrito y en gral no se
hace alusión a las figuras de los resultados. Estos ya están entendidos y el lector ya está
convencido de las nuevas observaciones cuando llegó a este punto del escrito.
En gral no se incluye mucha bibliografía nueva, todo lo necesario importante debe hacer sido
presentado en la introducción. La bibliografía nueva aquí es para comparar/conectar/contrastar lo
observado en este trabajo con lo de otros. (Esto y lo de tal autor apoyan un modelo en el que…)
(Esto es distinto de lo reportado en tal otro sistema experimental y puede deberse a…) .
Que interrogantes nuevos se plantean. Elaboración de un modelo. No puede exceder en longitud
la sección Resultados. Debe ser creativa, pero con mesura.
Si se presenta un modelo en la discusión, este debe ser lo más sencillo posible y limitarse a las
moléculas / fenómenos que se analizaron en el trabajo. Eventualmente se pueden incorporar
datos de bibliografía para enriquecer o complementar el modelo.
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pag 21
Globalmente, si el trabajo está bien escrito, un experto en el tema, accede al mensaje principal del
trabajo leyendo el título, el abstract, las figuras con sus leyendas y la discusión. Es un buen modo
de testear la didáctica.
Hay varios sitios web útiles, también las instrucciones para autores de por ej MCB son un
buen punto de partida.
IX. ANEXO
Fraccionamiento subcelular mediante centrifugación en gradiente.
El fraccionamiento bioquímico por centrifugación diferencial de los componentes subcelulares
es una estrategia complementaria a la visualización por inmunocitoquímica. Brinda distinta
información: permite estudiar la distribución de proteínas marcadoras en ribonucleopartículas y
polirribosomas a partir de la separación de gradientes de velocidad y la detección de las proteínas
por Western Blot.
Centrifugación en gradientes de velocidad
Esta es una técnica utilizada para separar componentes celulares (organelas y partículas) en
base a sus propiedades diferenciales de sedimentación. El comportamiento de las partículas en
un campo centrífugo se describe mediante la siguiente ecuación:
v=
d2 (p - l) g
18 
v: Velocidad de sedimentación.
d: Diámetro de la partícula.
p: Densidad de la partícula.
l: Densidad del líquido.
g: Fuerza centrífuga.
: Viscocidad del líquido.
En su forma más simple, las partículas se separan en función de su velocidad de
sedimentación en un medio de densidad uniformemente baja. Se lleva a cabo centrifugando la
muestra a baja velocidad y separando el sobrenadante del pellet, para posteriormente recentrifugar el sobrenadante a velocidad y tiempo mayores, y así sucesivamente.
Durante la centrifugación los componentes de la muestra se separan en una serie de bandas o
zonas, con una velocidad de sedimentación característica. La velocidad a la cual las partículas
sedimentan depende de:

Tamaño.

Forma (en general es irrelevante porque las formas son similares: más o menos
globulares)

Densidad (densidades dentro de un rango muy angosto: lipidos<proteínas <RNA)
Por lo tanto, LA SEPARACION SE PRODUCE POR DIFERENCIA DE TAMAÑOS. Sin
embargo, es importante destacar que, en la centrifugación diferencial por gradientes de velocidad,
partículas de rápida sedimentación quedan contaminadas con partículas de lenta sedimentación,
lo cual impide obtener fracciones totalmente puras. Esto se debe a que mientras las partículas
grandes que están en el tope del tubo llegan al fondo, algunas de las partículas pequeñas cerca
del fondo también habrán peleteado. Además, existen otros factores como vibraciones mecánicas,
gradientes térmicos y corrientes de convección, que pueden afectar las propiedades de
sedimentación.
Centrifugación en gradientes de densidad
Existe otro tipo de centrifugación diferencial, que permite disminuir al mínimo los problemas de
comigración de partículas grandes con pequeñas que se presentan en gradientes de velocidad. La
centrifugación en gradientes de densidad o gradientes isopícnicos, que se realiza en medios
de mayor densidad que el agua, permite obtener una mayor resolución (mayor separación entre
partículas con propiedades similares). La separación de los componentes de la muestra se realiza
por sedimentación en una solución que aumenta en densidad a medida que aumenta la distancia
hacia el fondo del tubo.
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En la centrifugación en gradientes isopícnicos se siembra la muestra sobre el gradiente o se la
mezcla con el material del gradiente antes de su formación. Se centrifuga durante un tiempo
prolongado, hasta llegar a un equilibrio en el cual cada partícula no se mueve porque ha llegado a
una zona en la que su densidad es igual a la densidad del medio. Por lo tanto, LA SEPARACION
SE PRODUCE SEGÚN DIFERENCIAS DE DENSIDAD. Para generar el gradiente se elige un
rango de densidades que incluya las densidades de todas las partículas que se quieren separar.
Así, el solvente en la parte inferior del tubo debe tener una densidad mayor que cualquiera de las
partículas a separar.
Cuando se usan gradientes de densidad, un gradiente particular puede estar operando
como un gradiente de velocidad para una determinada separación y como un gradiente isopícnico
para otra. Esto depende de la relación entre densidades de las partículas y el rango de
densidades del gradiente.
Los gradientes de velocidad de sedimentación resultan ideales para analizar la cantidad y
tamaño de los polisomas. Para esto, las células deben ser lisadas en presencia de estabilizadores
de polisomas, tales como la cicloheximida.
Figura 5. Ruptura de polisomas por estrés
oxidativo. Se expusieron células a arsenito (ars) y
se evaluó la movilidad de los polisomas
(comparándola con la de polisomas de células
control, cont) en gradiente de sedimentación (top,
tope del gradiente, bottom, fondo). La distribución
de la proteína ribosomal P0 fue monitoreada por
Western Blot. Se observa que el estrés induce un
desplazamiento de la señal hacia fracciones de
menor velocidad de sedimentación.