Clase TP Metabolomica 2013.pdf

Perfiles metabólicos por
cromatografía gaseosa
acoplada a espectrometría de
masas (GC-MS) en plantas
Dra. Mariana G. López
mglopez@cnia.inta.gov.ar
PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN
DE PERFILES METABOLICOS EN
PLANTAS
1. Procesamiento de las muestras vegetales.
Extracción de metabolitos de fase polar
2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS
3. Obtención de perfiles metabólicos
4. Análisis de los resultados
PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN
DE PERFILES METABOLICOS EN
PLANTAS
1. Procesamiento de las muestras vegetales.
Extracción de metabolitos de fase polar
2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS
3. Obtención de perfiles metabólicos
4. Análisis de los resultados
Muestra
1. Procesamiento de las
muestras vegetales. Extracción
de metabolitos de fase polar
Extracción
* Estándar interno
Derivatización
2. Análisis de las muestras.
Corrida GC-MS
* Estándares de RT
GC-MS
Muestra
- Condiciones controladas de muestreo:
-Definir momento de muestreo, tejido a muestrear
(homogeneidad)
- Controles (tener en cuenta que la cuantificación es relativa)
- La muestra debe congelarse INMEDIATAMENTE
- Pesado de la muestra
Extracción
- Definir el protocolo de extracción según objetivo de estudio
- Se utiliza metanol frío para inhibir la actividad enzimática
- Se utiliza un control interno de cuantificación (cantidad conocida de ribitol)
- La muestra se seca en vacío, se modifica la atmósfera para evitar la
oxidación
- Puede conservarse a -80ºC durante 3 meses
Derivatización
GC-MS
- Antes de analizar la muestra se derivatiza para disminuir la polaridad
de los compuesto y favorecer su volatilización
Se utilizan compuestos que modifican la estructura química de
los compuestos, reemplazando sus residuos
- A la muestra se le agregan estándares de tiempo de retención (RTI),
para corregir desviaciones de la corrida
Protocolo de Extracción
Homogeneizar la muestra (80 mg) en mortero con N2 líquido - polvo fino.
1,2 ml de mezcla de extracción (metanol + ribitol) fría y mantenida en hielo
Vórtex 15 segundos
Agitar 15 minutos a 70°C (termobloque a 1000 rpm)
Centrifugar 10 minutos a 14000 rpm
Transferir 600 µl del sobrenadante a un eppendorf de 2 ml limpio
Agregar 300 µl de cloroformo
Agregar 600 µl de H20 bi-destilada calidad HPLC
Vórtex 15 segundos
Centrifugar 15 minutos a 4000 rpm
Transferir una alícuota de 150 µl a un tubo epp de 1,5 ml
Secar los extractos en speedvac 8 horas
Manos a la
obra!!!
PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN
DE PERFILES METABOLICOS EN
PLANTAS
1. Procesamiento de las muestras vegetales. Extracción
de metabolitos de fase polar
2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS
3. Obtención de perfiles metabólicos (análisis de la
corrida)
4. Análisis de los resultados
3. Obtención de perfiles metabólicos
Obtener los perfiles metabólicos, implica identificar el o los compuestos de
cada uno de los picos del cromatograma y cuantificarlos
-
Para la identificación de los compuestos se utilizan el espectro y el
Índice de Retención (IR); que representa el valor del RT corregido por
los estándares de RT agregados en la muestra
-
Identificación manual: comparando el espectro de cada uno de los
picos contra librerías de espectros. Consume mucho tiempo, requiere
gran experiencia y es dificultosa en el caso de mezclas complejas
-
Existen programas que utilizan distintos algoritmos para ‘extraer’ todos
los picos en forma de matriz, identificarlos y cuantificarlos (AMDIS,
ChromaTOF, TagFinder, TargetSearch, entre otros)
-
El programa TagFinder ha sido especialmente diseñado para la
obtención de perfiles metabólicos en plantas (Max Planck Insitute)
3. Obtención de perfiles metabólicos
3. Obtención de perfiles metabólicos
3. Obtención de perfiles metabólicos
DESARROLLO DEL TP (Guía de TP A MANO!!!)
Visualización e interpretación de un cromatograma
Abrir AMDIS
- Abrir archivo “Tomate.cdf”
- Familiarizarse con el cromatograma, RE, m/z, espectros…
- Ubicar los FAMEs (m/z: 87)
- Ubicar los picos que se mencionan en la guía (para ello considerar RI,
TMS y buscar en la base de datos las masas específicas de cada
compuesto)
Visualización e interpretación de un cromatograma
Anotación manual de los picos
Citric acid 4TMS (RTI: 9.88)
Sucrose 8TMS (RTI: 14.01)
Valine 2TMS (RTI: 4.52)
(http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/home/gmd_sm.html)
Citric acid 4TMS (RTI: 9.88)
Citric acid
Sucrose 8TMS (RTI: 14.01)
Sucrose
Valine 2TMS (RTI: 4.52)
Valine
Anotación de los tags utilizando TagFinder
La utilización de este programa implica una serie larga de pasos:
1. Se cargan los datos de todos los cromatogramas en el programa
2. El programa busca los picos de los cromatogramas y los convierte en
una matriz que incluye toda la información
3. Se calculan los índices de retención de todos los picos (a partir de la
información de los FAMEs)
4. Se establecen los parámetros de búsqueda de los tags y luego se
buscan (la información se almacena en una matriz)
5. Se anotan los tags (identificación de los compuestos a partir de la
matriz obtenida en el punto anterior). Se obtienen el perfil metabólico
SEGUIR LA GUIA!!
Análisis de los resultados
- El primer paso antes de cualquier análisis debe ser ‘estandarizar’ los
valores obtenidos, para que nuestras mediciones puedan ser
comparables entre si. Para esto debemos conocer los datos de FW de
la muestra original y la intensidad del ribitol (estándar interno)
-Luego debemos realizar un análisis estadístico de los datos, puede
utilizarse test de T (el más común), ANOVA, etc
-Recordar que en el enfoque propuesto proporciona una cuantificación
RELATIVA de los metabolitos, es decir los valores serán
significativamente mayores o menores respecto a una muestra control
-Finalmente, para favorecer la interpretación de set de datos tan
grandes pueden utilizarse diferentes enfoques: PCA, HCA, SOM, etc.
Perfil Metabólico