GenomicaVirus2014.pdf
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Secuenciación genómica de virus vegetales Dra. Ana Julia Distéfano Instituto de Biotecnología, INTA-Castelar Enfermedades del maíz, una guía para su identificación en el campo. CIMMYT Maíz de Orán (Salta) con clorosis en la base de las hojas Sugarcane mosaic virus (SCMV) Maize dwarf mosaic virus (MDMV) Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus Morfología: filamentosos y flexibles, de simetría helicoidal y desnudos. 700-900 nm de largo y 11-13 nm de ancho. Género Potyvirus Potato virus X (PVX), Potexvirus Potato leafroll virus (PLRV), Polerovirus Tejido vegetal infectado Purificación de la partícula viral Obtención de DNA o RNA total Obtención del material genético del virus PCR o RT-PCR Genotecas PCR o RT-PCR Genotecas RNA DNA cDNA Romper el DNA 3´ 5´ cDNA 1ª cadena Clonar Primers al azar o poliT Transcriptasa reversa 3´ 5´ Secuenciar cDNA 2º cadena RNAsa H DNA pol I Clonar Secuenciar PCR o RT-PCR Se diseñan primers en base a las secuencias depositadas en las bases de datos públicas de virus relacionados al virus en estudio Genoma DNA PCR Genoma RNA cDNA PCR Oligonucleótido diseñado a partir de un motivo altamente conservado en el dominio NIb, amplifica la región 3’ del genoma (producto:1,7-1,9 Kpb) Los extremos 5´y 3’ del genoma son difíciles de obtener 5’ 3’ 1 2 Rapid Amplification of cDNAs Ends (RACE) 3’ RACE 5’ RACE 5’ 5’ AAAAA 3’ 3’ TTTTTT AP 5’ 3’ 3’ 5’ GSP Transcriptasa reversa 5’ AAAAA 3’ TTTTTT 3’ Transcriptasa reversa 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ RNAsa H 3’ RNAsa H 5’ TTTTTT 3’ Taq Pol PCR 5’ TdT 3’ CCCC 5’ GSP 5’ 3’ 3’ TTTTTT 5’ Taq Pol PCR 3’ 5’ AUAP 5’ 3’ 5’ TTTTTT AAAAAA AAP GGGG 3’ 3’ CCCC 5’ 3’ 5’ GSP 2 5’ 3’ 5’ 3’ GSP2 5’ 3’ GGGG CCCC 3’ 5’ Métodos de secuenciación de nueva generación Instituto de Biotecnología- INTA Castelar Secuenciación de genomas completos y regiones candidatas Secuenciación y análisis de sRNAs 454 Sequencing –INDEAR, Rosario Secuenciación de gDNA de virus por shotgun Targeted resequencing strategies: estudiar una región genómica de interés a partir de un producto de PCR Detectar y cuantificar variantes de baja frecuencia, como mutaciones virales resistentes a drogas Aplicaciones a la genómica de virus Tejido vegetal infectado Purificación de la partícula viral Obtención del material genético del virus Genotecas PCR o RT-PCR Shotgun sequencing Obtención de DNA o RNA total PCR o RT-PCR Shotgun sequencing Estudios de variabilidad de un virus a campo Targeted resequencing strategies (454 Sequencing system) PCR amplicon sequencing El producto de PCR se amplifica con primers que poseen una región de adaptadores especificos para el 454 y luego se secuencia sin necesidad de preparar una library Analizar pools de muestras y se obtienen secuencias independientes del amplicon ( 100 ó 1000 ) en una única corrida Secuenciacion de RNAs pequeños (Illumina) En respuesta a una infección, los genomas virales son procesados por proteínas ribonucleasas Dicer-like (DCL) en RNAs pequeños virales (vsRNAs) de tamaños discretos. Los vsRNAs son luego usados como guias para el silenciamiento del genoma del virus. Estudiar y caracterizar el perfil de vsRNAs que se producen durante el proceso de Infección del virus en la planta Caracterizar los miRNAs que se expresan luego de una infeccion viral Se obtiene sRNAs pequeños de plantas infectadas y no infectadas Se clonan y se realiza deep-sequenced utlizando la plataforma Illumia Los vsRNAs son de 21 a 24 nt de longitud y sus secuencias deben coincidir con las del genoma viral. En general están distribuidos a lo largo de todo el genoma, pero hay regiones mas representadas y en general son zonas esenciales del genoma viral. “hot spots” Los vsRNA mapean en orientación sentido y antisentido del genoma viral. A veces hay cantidades equivalentes de vsRNAs en sentio y antisentido, y aveces no Información importante para diseñar estrategias de control de la enfermedad por PTGS Ejemplo de un virus nuevo encontrado por pirosecuenciación Phytopathology 2013 Identification of a new enamovirus associated with citrus vein enation disease by deep sequencing of small RNAs. Vives MC, Velázquez K, Pina JA, Moreno P, Guerri J, Navarro L. Con el objetivo de identificar el agente causal de la enfermedad “citrus vein enation”, examinaron por deep sequencing (Solexa-Illumina) la fracción de small RNA (sRNA) de plantas de cítricos (Etrog citron) con síntomas y sanas. El ensamblado de los Contigs de los vsRNA mostraron identidad de secuencia con Luteovirus, particularmente con Pea enation mosaic virus, perteneciente al genero Enamovirus. La secuencia genómica del RNA de este nuevo virus , denominado provisoriamente Citrus vein enation virus (CVEV), fué completada y caracterizada. Secuenciación y caracterización molecular del virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) del maíz. . A. J. Distéfano, V. Mongelli, G. Maroniche, E. Hopp, M. del Vas Instituto de Biotecnología-INTA CONICET Distribución de la enfermedad Tomado del informe PROMARC, IFFIVE-INTA Síntomas de la enfermedad Acortamiento de los entrenudos y altura reducida Tomado del informe PROMARC, IFFIVE-INTA Las mazorcas presentan escasa formación de granos Síntoma distintivo: Enaciones en las nervaduras en el envés de las hojas Insecto vector: Delphacodes kuscheli Fennah (chicharrita) Partícula del MRCV Genoma del MRCV 4500 pb S1 S2/S3 S4 S5 S6 S7 S8 1700 pb S10 S9 10 segmentos genómicos de dsRNA (~ 29 Kpb) Estrategias de clonado y secuenciación (1999-2002) Genoteca de cDNA con oligonucleótidos al azar Genotecas de cDNA con oligonucleótidos específicos Amplificación por RT-PCR Amplificación de los extremos 5’ y 3’ de los segmentos por “Rapid Amplification cDNA Ends” o RACE 5’ 3’ MRCV S1 1 2 3 4 Secuenciación y caracterización del genoma del virus asociado a la enfermedad azul del algodón. V. Delfosse, Y. Agrofoglio, M.F Casse, I. Bonacic Kresic, E. Hopp, A.J. Distéfano Instituto de Biotecnología-INTA CONICET Producción de Algodón en Argentina El algodón (Gossypium spp.) es un cultivo regional importante en el NEA. Enfermedad azul del algodón Es causada por Cotton leafroll dwarf virus Osmério Pupim Junior et al., 2008. Corrêa et al., 2005 Enrollamiento de las hojas hacia su cara inferior Hojas con textura coriácea con coloración verde oscura–azulada Clorosis en las nervaduras Enanismo, entrenudos cortos y tallos en zig-zag Vector: Aphid gossypii Glover o pulgón del algodón El virus es transmitido por el vector Aphis gossypii Glover en forma persistente, circulativa y no-propagativa No se transmite en forma mecánica Virus esta restringido a las células acompañantes del floema Familia Luteoviridae Los viriones son icosahedricos, de aproximadamente 25 nm de diámetro Limitados al floema de sus plantas huéspedes Genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positiva de entre 5 a 6 kb Los virus pertenecientes a la familia Luteoviridae se agrupan en tres géneros Género Especie tipo Luteovirus Barley yellow dwarf virus-Pav, BYDV-PAV Polerovirus Potato leafroll virus, PLRV Enamovirus Pea enation mosaic virus-1, PEMV-1 Organización genómica de los Polerovirus RdRp P0 5’ ORF0 ORF2 ORF1 sgRNA CP RT ORF3 ORF5 ORF4 MP El genoma esta formado por seis marcos abiertos de lectura (ORFs) Los ORFs 0, 1 y 2, próximos al extremo 5´, se traducen a partir del RNA viral dando como producto las proteínas P0, P1 y la proteína P1-2 a partir de un cambio de marco traduccional (frameshift). La proteína P0 corresponde al supresor de silenciamiento, las proteínas P1 y P1-2 son componentes de la RNA polimerasa dependiente de RNA. Los ORFs 3, 4 y 5, próximos al extremo 3´ viral, se traducen a partir de un RNA subgenómico (sgRNA), dando lugar a las proteínas P3, P4 y P3-5. La proteína P3 corresponde a la cápside viral, P4 a la proteína de movimiento viral y P3-5 al dominio readthrough de la proteína de cápside 3’ OBJETIVOS GENERALES Los objetivos generales del trabajo son la secuenciación y caracterización del genoma del virus asociado a la enfermedad azul del algodón presente en la región del NEA, y la caracterización de las proteínas codificadas por el mismo para profundizar los conocimientos básicos que se tienen sobre las funciones virales. Secuenciación del genoma (2008-2009) En la EEA Saenz Peña del Chaco, se obtuvieron plantas infectadas con el virus presente en la zona en condiciones controladas de invernáculo. Extraccion de RNA con Trizol Síntesis de cDNA PCR Se utilizaron las secuencias de los siguientes Polerovirus : Turnip yellows virus (TYV, NC003743), Beet mild yellowing virus (BMYV, AF167480), Beet western yellows virus (BWYV, NC004756), Beet chlorosis virus (BChV, NC002766) Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV, AY758560), 1 4 6 8 3 2 10 5 7 * ORF 0 12 15 9 13 11 P0 ORF 2 225 225 18 ORF 5 ORF 3 P3 3630 21 22 5866 4236 22.3 kDa P1 70.1 kDa 16 ORF4 856 29.8 kDa 19 20 ◊ ORF 1 71 17 14 2156 P5 3630 5717 77.1 kDa P1+P2 1706 1706 3661 3442 P4 4185 20 kDa 119 kDa Esta estrategia permitió secuenciar el genoma viral completo (5,866 Kb) Distefano y col, Archieves of Virology 2010 Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) Familia Luteoviridae, genero Polerovirus Genoma de ARN simple cadena positiva de 5866 nt Posee los seis marcos abiertos de lectura (ORFs) típicos de los Polerovirus RdRp P0 5’ ORF0 ORF2 ORF1 sgRNA CP RT ORF3 ORF5 3’ ORF4 MP Distéfano, 2010 PHYLIP_1 PEMV TVDV 100 98 93 88 80 96 85 100 96 100 100 0.1 Neigbhor joining method SbDV BLRV PLRV CYDV-RPV 100 CYDV-RPS GRAV CAbYV CpSDaV CLRDVBr 100 100 CLRDVAr BMYV 88 BWYV 100 TYV 73 BChV ScYLV BYDV-MAV BYDV-PAV BYDV-PAS Polerovirus * Luteovirus Enamovirus Enfermedad azul atípica En las campañas de algodón 2009/2010, 2010/2011, 2012/2013 se observaron plantas con síntomas atípicos de enfermedad azul en la provincia de Chaco Entrenudos acortados Enrollamiento de las hojas y hojas arrugadas Clorosis internerval y marginal de las hojas afectadas Las plantas infectadas tardíamente en el desarrollo presentan una morfología normal en la parte inferior de la planta pero deformaciones en las hojas apicales (achaparramiento) Enfermedad azul atípica Los síntomas no se corresponden con enfermedades descriptas en el país Se observó inicialmente tanto sobre las variedades susceptibles como las resistentes. Incidencia entre un 7 a un 12% de plantas afectadas, dependiendo del material genético y del lugar geográfico En todos los casos y en ambas campañas agrícolas, se observó la presencia del pulgón del algodonero (Aphis gossypii) y también en algunos lotes la presencia de mosca blanca (Bemisia tabacci). Los síntomas se observaron en variedades de algodón susceptibles y resistentes en enfermedad azul Debido a la sintomatología presentada por las plantas de algodón infectadas y por el tipo de insecto vector observado en los campos afectados (mosca blanca) y pulgón algodonero (Aphis gossypii), se analizaron por PCR las siguientes familias virales: Familia Geminiviridae Familia Bromoviridae Género Begomovirus Cotton leaf crumple virus (CLCrV) Cotton leaf curl disease (CLCuD) Abutilon mosaic virus (AbMV) Género Ilarvirus Tobacco streak virus (TSV) Familia Potyviridae NEGATIVO Familia Luteoviridae POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO Un virus recombinante o una nueva variante del CLRDV? Los virus recombinantes son comunes en esta familia. Se analizó la región intergénica con primers universales que amplifican a virus del todo el género de polerovirus La región analizada tiene un 97% de identidad con CLRDV Se descartó la idea de que el virus se generó por recombinación Una nueva variante del CLRDV La variabilidad natural en la secuencia genómica de los virus de RNA es del 2-3%. La región analizada era similar al CLRDV pero había un quiebre en la resistencia y además las plantas presentaban distinta sintomatología. Por este motivo se decidió secuenciar el nuevo virus por completo Estrategia de secuenciación Obtuvimos la secuencia completa del genoma utilizando primers específicos, diseñados en base a la nueva secuencia viral obtenida de un lado, y un primer degenerado del otro lado. Identidad de secuencia en aminoácidos y nucleótidos entre el CLRDV y la nueva variante P0 P1 P1-P2 P3 P4 P3-P5 Amino acid sequence identity 88,2% 93,6% 95,6% 98,0% 95,4% 96,6% Nucleotide sequence identity 91,6% 94,4% 95,5% 97,9% 98,7% 96,7% La proteína P0 tiene menos del 90% de identidad con el CLRDV Agrofoglio et alresultados no publicados 2014 Uno de los criterios para determinar una nueva especie dentro del género Polerovirus es una diferencia mayor al 10% en la secuencia de aminoácidos de cualquier producto génico. Además, la sintomatología diferentes es un criterio importante para la definición de buevas especies. Por lo tanto proponemos que la enfermedad azul atípica esta asociada a una especie viral nueva del genero Polerovirus y proponemos denominarla Cotton leafroll bushy virus (CLRBV) Desarrollo y caracterización de un clon infectivo del CLRDV pGEMT-35S-CLRDV sonda ORF5 ORF3 ORF2 ORF0 p35S ORF4 ORF1 pBin19-CLRDV Sal I p35S LB Sal I CLRDV A(15) RB Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 A(15) Estudio de la capacidad de replicación del clon infectivo en plantas de algodón Se registró la aparición de síntomas típicos de la infección (enrollamiento de las hojas, enanismo, color verde-azulado) y se analizó la capacidad de replicación y de infección del clon infectivo de cDNA en las hojas sistémicas (NI) mediante RT-PCR y Northern blot. Delfosse et al, Virus Res 2013 Virus quimeras Reemplazo de P0 Reemplazo de MP Ejemplos de la aplicación de la tecnología Illumina MUCHAS GRACIAS
