3. Bioprospeccio_n.pdf
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Metagenómica y bioprospección Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2do cuatrimestre 2012 Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular FCEN-UBA La metagenómica es un nuevo campo de la biología http://dels-old.nas.edu/metagenomics/ Por qué metagenómica ? En bases de datos hay un enorme número de proteínas no caracterizadas, a las que se deben sumar genes aún no descubiertos, que están presentes en ambientes naturales La predicción funcional basada en estructuras podrá ser un mecanismo para obtener nuevas enzimas MetaGene: Noguchi et al. 2006 Nucleic Acids Research 34, 5623–5630 Metagenómica como respuesta a la demanda de nuevos genes y sus productos La diversidad natural es a fuente principal de nuevas moléculas La explicación está en la vasta riqueza de suelos, océanos y otros nichos microbianos La metagenómica es una tecnología clave para acceder al potencial presente en los genomas de los microorganismos Permite la investigación de los genes individuales, el análisis de operones completos codificantes para vías biosintéticas o degradativas Metagenómica como respuesta a la demanda de tecnologías más limpias 1. Detergentes 2. Alimentos 3. Agricultura 4. Procesamiento textil 5. Industria del papel 6. Industria química Qué genes, qué productos? Screening metagenómico funcional de actividades hidrolíticas dominan actualmente la literatura NGS: Secuenciación paralela masiva Next Genera9on Sequencing • Masiva por la capacidad de secuenciar tanto ADN • Es masiva porque se hace muchas veces en paralelo 7 Alcance de la metagenómica The New Science of Metagenomics: Revealing the Secrets of Our Microbial Planet (2007) National Academy of Sciences, USA Objetivos de estudios metagenómicos Integrar conocimientos biológicos fundamentales para crear una imagen integrada de como funciona una comunidad Determinar que genes hay (metagenómica basada en secuencia) Extracción de ADN de la comunidad • Identificar genes y pathways metabólicos • Determinar la expresión de dichos genes • Comparar entre comunidades • y más… Determinar que hacen los genes (metagenómica basada en función) • Screening para identificar funciones de interés (producción de vitaminas, resistencia a antibióticos, etc) • y más… Secuenciación shotgun paralela masiva Fragmentación al azar DNA total Selección de tamaño secuenciación Amplificación Agregado de adaptadores 10 Etapas de secuenciación con NGS 11 Métodos de estudios metagenómicos Gilbert & Dupont Annu. Rev. Mar. Sci. 2011. 3: 347–371 Anotación 13 Información no basada en similitud Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) mapas metabólicos 14 Métodos de estudios metagenómicos Iqbal et al., Curr Op Chem Biol 2012, 16:109–116 • Nuevas funciones • Selección por genes funcionales No depende del huésped Estrategias similares para diferentes targets (PCR/hibrid) • Laborioso (screening) • Baja frecuencia • Depende de la expresión en un huésped Genes relacionados a genes conocido Limitaciones en la predicción Búsqueda metagenómica de biocatalizadores Iqbal et al., Curr Op Chem Biol 2012, 16:109–116 Construcción de bibliotecas metagenómicas Fragmentos 2-8kb Necesidad de expresión en un sistema heterólogo Plásmido de expresión DNA metagenómico Pequeños insertos • Alto número de copias. • Mayor expresión (promotores) • DNA degradado o contaminado • Técnicamente simple • Requiere mucho análisis para hallar positivos • Improbable clonar vías completas Fragmentos >30kb cósmidos, fósmidos BAC Grandes insertos • taxones raros • Clones positivos con menos número de análisis • Vias metabólicas completas • Requiere DNA de alto PM y altamente purificado • Expresión limitada de genes • Técnicamente complejo Screening El screening funcional es aplicable principalmente en biotecnología El screening por secuencia es más utilizado para la identificación de genes y elucidación de su papel dentro de comunidades microbianas complejas Selección del ambiente • Ambientes naturalmente enriquecidos en el blanco (celulasas en rumen de vacas) No garantiza alta frecuencia de detección • Ambientes extremos Biocatalizadores estables en condiciones extremas • Ambientes altamente diversos (suelos) Mayor diversidad y mayor flexibilidad Aislamiento de ADN 1. El DNA debe ser extraído de un amplio rango de microorganismos para que sea representativo de la comunidad original 2. Se requiere DNA de alto peso molecular 3. El DNA debe estar libre de sustancias contamnantesque interfieren con el procesamiento (restricción, ligación) • Métodos directos e indirectos • Pre-enriquecimiento Screening basado en función La probabilidad de identificar un cierto gen depende de: 1. El sistema vector-huésped 2. Tamaño del gen 3. La abundancia del gen en el metagenoma de origen 4. La eficiencia de expresión heteróloga Clonado La estrategia depende del objetivo Genes individuales vs operones completos y clusters que codifican para vías biosintéticas o degradativas? • plásmidos (<15 kb) • cósmidos o fósmidos (25–40kb) • BAC (100–200kb) Screening Libraries metagenómicas: screening funcional Suenaga et al., 2007 Environmental Microbiology 9, 2289–2297 Construcción de bibliotecas metagenómicas Meyerdierks & Glöckner Metagenome analysis, en Introduction to Marine Genomics 2010, Springer Screening basado en función La actividad enzimática se puede ensayar en agar suplementado con sustratos + simple - señales débiles Medio conteniendo trioleilglicerol y rodamina Metaloproteasa en agar + leche (80000 clones) Waschkowitz et al. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75: 2506-2516 Screening basado en función Posibles causas de la falta de expresión • Diferencias en el uso de codones • Falta de reconocimiento del promotor • Falta de factores de iniciación • Folding inadecuado • Formación de cuerpos de inclusión • Ruptura enzimática del producto • Toxicidad • Incapacidad de secreción del huésped Vectores autolíticos para screening masivos cassette autolítico SRRz Inducible por UV insertado en pUC18 para transformar E. coli BL21 Eficiencia de lisis: 44.5% a 30 °C Li et al. 2007 J Biotech 127: 647–652 Uso de vectores con amplio rango de huésped antibact en R metallidurans antibact en E. coli • Agrobacterium tumefaciens • Burkholderia graminis • Caulobacter vibrioides • Escherichia coli • Pseudomonas putida • Ralstonia metallidurans antibact en R metallidurans antibact en E. coli Pigmento en P putida Pigmento en A tumefaciens Mínima superposición de clones Craig et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol. 76, 1633-1641 Wrinkle en A tumefaciens Pigmento en R metallidurans Expresión de DNA metagenómico en otras Proteobacterias Craig et al. 2011 Curr. Op. Biotechnol, 22:465–472 Complementación heteróloga Uso de cepas huéspedes mutantes que requieren el gen blanco para crecer en condiciones selectivas. Ventajas: simple, rápida, no hay falsos positivos, altamente selectiva. 9 genes nuevos Ejemplo: gen codificante para DNA polimerasa por complementación de una mutante polA de E.coli. Simon et al., 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75, 2964-2968 Screening funcional: SIGEX DNA metagenómico es clonado upstream del gen de gfp Se basa en que los genes catabólicos están en operones cuya expresión en muchos casos es controlada por elementos regulatorios próximos a los genes catabólicos (inducibles por sustrato) Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening funcional: SIGEX 152000 clones con insertos de 7kb 1. Construcción de library 58 clones regulados por benzoato metagenómica 4 clones regulados por naftaleno 2. Eliminación de clones conteniendo plásmidos expresando gfp constitutivamente 3. Selección de clones expresando gfp en presencia del inductor 4. Aislamiento en agar de colonias separadas Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening funcional: SIGEX Clon bzo71-8: homólogo a P450 (71% similitud) subclonado en plásmido de expresión bajo control de T7 abs característica de P450 Binding a 4-HB Screening por secuencia Screening funcional Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Es la primer P450 relacionada con degradación de benzoato Débil expresión en el clon original Screening funcional: SIGEX • El clon tiene que contener suficiente porción del operón para ser útil en los subsiguientes estudios funcionales, pero no debe tener la porción terminal del operón que lleve una señal de terminación de la transcripción REDUNDANCIA EN LA LIBRARY • Requerimiento de la maquinaria regulatoria que reconoce el promotor y el sustrato deben estar presentes y ser funcionales en el huésped USO DE OTROS HUESPEDES • Hay genes que se activan por efectores que no son sustratos • Los genes regulatorios y catabólicos pueden estar alejados • No siempre los genes catabólicos se inducen por sustratos Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening funcional: SIGEX Los clones positivos para amidasa catalizan la conversión de benzamida a benzoato se induce la expresión del gen reportero El benzoato activa el regulador transcripcional BenR, que activa el promotor benA gfp Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035 Screening funcional: PIGEX 96,000 clones 11 amidasas, 3 nuevas 1. Capacidad de distinguir entre sustrato y producto 2. Ausencia de inductores endógenos 3. Los productos generados por la amidasa deben ser inertes in vivo para asegurar constante inducción del sensor Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035 Screening funcional: METREX El desarrollo de un ensayo intracelular para pequeñas moléculas se basó en un sistema que se encontrara en organismos y ambientes diversos y respondiera a una variedad de moléculas Moléculas que inducen quorum sensing Proceso de comunicación inter-celular mediado por pequeñas molécula que le permite a las bacterias sensar su propia densidad celular Variaciones estructurales en inductores de QS sirven para regular específicamente muchas funciones ecológicamente relevantes, tales como formación de biofilms, luminescencia, virulencia y producción de antibióticos Screening funcional: METREX METabolite Regulated EXpression El biosensor que detecta los clones activos está dentro de la misma célula que el DNA metagenómico Williamson et al. 2005 Appl. Environ. Microbiol 71, 6335-6344 El clon metagenómico BSS3 induce quorum sensing en la cepa biosensor JB525 TLC El plásmido BSS3 introducido en una cepa sin biosensor (A) induce la señal en células cercanas (B,C y D) 1. El plásmido es responsable del fenotipo del clon original 2. El compuesto responsable de la inducción es difusible en agar Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:3669–3676 Una monooxigenasa cataliza una vía de oxidación de indol que lleva a la produccción de un compuesto que induce QS Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:3669–3676 Screening basado en homología La aplicación de estrategias basadas en homologías implica el diseño de sondas de DNA o primers derivados de regiones conservadas de genes ya conocidos o familias de proteínas • Hibridación • PCR • Síntesis Busqueda metagenómica de enzimas lipolíticas Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Busqueda metagenómica de enzimas lipolíticas agar tributirina Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Esterasas: estabilidad al pH y temperatura Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Esterasas: estabilidad frente a solventes 160 140 EstA3 % Actividad 120 100 80 60 40 20 0 ctrl 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% metanol DMSO DMF isopropanol acetonitrilo Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Esterasas: rango de sustratos Biofilm en cañería de agua potable suelo contaminado + pre-enriquecimiento Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Microbioma especializado en actividad hidrolítica Celulasa Hess et al., (2011) Science 331, 463-467 Screening basado en homología 268 gigabases 27,775 genes putativos, activos para H de C 90 candidatos amplificados 51 con actividad celulolítica Hess et al., (2011) Science 331, 463-467 Screening basado en homología Hess et al., (2011) Science 331, 463-467 Metagenómica sintética Uso en industria química, agroquímica, precursores de síntesis de hidrocarburos MHT cloruro cloruro de metilo S-adenosil-L-metionina (SAM) S-adenosil-L-homocisteína Screening de MHT en base de datos Construcción de library metagenómica sintética Screening en E coli Sólo un gen anotado como HMT Solo 55% anotados como MT 89 genes homólogos a MHT 61 bacterias 14 plantas 13 hongos 1 arquea Especificidad de sustrato Producción de MHT en levaduras Transferencia a S cerevisiae direccionado a vacuola Producción de MHT en levaduras Respuesta del huésped a la toxicidad del producto Producción de MHT en levaduras inhibición Crecimiento de S cerevisiae c/ carboximetil celulosa Crecimiento de A fermentans en cocultivo Producción de MHT a partir de biomasa vegetal Co-cultivos inoculados a baja densidad, crecidos 36 h con el material (20 g/L) como única fuente de C. Se agregó ioduro de sodio y se midió la producción de CH3I por GC-MS Metagenómica sintética http://www.cazypedia.org/index.php/Glycoside_Hydrolases Enriquecimiento Incubación: 31 días Cambio en el perYil taxonómico Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos Expresión de la proteína pura en cantidades suficientes a un costo razonable Baja frecuencia de clones que son positivos en las bibliotecas metagenómica Acceso a expertise en bioinformática SIP/metagenómica Es una forma de caracterizar miembros ecológicamente relevantes de una comunidad, y sus funciones metabólicas, aunque no sean numéricamente dominantes SIP/metagenómica genes codificantes para la glicerol deshidratasa dependiente de coenzima B12 Frecuencia de detección: 2.1X - 3.8X mayor Schwartz et al. 2005 World J Microbiol Biotechnol 22, 363-368 SIP/metagenómica SIP/metagenómica BibliograYía adicional Metzker, M. L., Sequencing technologies -­‐ the next generation. Nat Rev Genet 11, 31 (2009) Taupp et al. The art and design of functional metagenomic screens. Current Opinion in Biotechnology 2011, 22: 465-­‐472 Schmelsser et al. Metagenomics, biotechnology with non-­‐culturable microbes. Applied Microbiology and Biotechnology 2007, 75: 955-­‐962 Simon, C. & Daniel, R. Metagenomic Analyses: Past and Future Trends. Applied and Environmental Microbiology 2011, 77: 1153-­‐1161 Ekkers et al. The great screen anomaly—a new frontier in product discovery through functional metagenomics. Applied Microbiology and Biotechnology 2012 93:1005–1020 Iqbal et al. Biocatalysts and small molecule products from metagenomic studies. Current Opinion in Chemical Biology 2012, 16: 109-­‐116
