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Conceptos y Técnicas de
Biotecnología I, CTBT
Bloque BASH (Biotecnología Animal
y en Salud Humana)
VACUNAS
SANDRA RUZAL
Sandra Ruzal CTBT 2012
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• VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición
voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa.
Generaba Protección a reinfección
• Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico
→ memoria inmunológica
Edward Jenner (médico británico)
inventó en 1796 la primera vacuna
contra la viruela.
El experimento consistió en inyectar
a un niño de 8 años la vacuna
procedente de una pústula del
brazo de una ordeñadora
(contagiada x VACA) a través de
dos cortes superficiales en el brazo,
consiguiendo inmunizar al niño ante
la viruela humana.
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Aparición principales vacunas de uso humano:
- 1796: Vacunación contra la viruela
- 1885: Vacuna contra la rabia Pasteur
- 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa
- 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla
cultivo celular y
- 1943: Vacuna contra influenza
desarrollo de virus
- 1954: Vacuna inactivada contra virus polio
humanos fuera del
- 1956: Vacuna viva atenuada contra virus polio
organismo vivo
- 1960: Vacuna contra el sarampión
Edad de oro
- 1966: Vacuna contra la rubeóla
- 1975: Vacuna contra hepatitis B→subunidades
- 1980: Viruela erradicada
- 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B)
- 1988: Vacuna contra H. influenzae B → conjugada
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Vacunas:
Inmunización: procedimiento para generar
inmunidad adquirida: Especificidad y Memoria
Antígeno: molécula Inmunogénica, se aisla
del agente patógeno → identificar antígenos
responsables y eliminar componentes
patogénicos
Inmunogénica: molécula capaz de despertar una
respuesta en el sistema inmune y producir memoria
inmunológica
Qué son las vacunas: Preparados de antígenos que
introducidos en el organismos son capaces de estimular el
sistema inmunitario e inducir una respuesta protectora
Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN
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Respuesta primaria
5-10 días
Menor Intensidad
IgM>IgG
Respuesta secundaria
1-3 días
Mayor Intensidad
IgG, IgA, IgE
Mayor Afinidad de los Ac
Inmunnógeno Sólo proteínas
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Respuestas inmunes que confieren protección:
Microorganismos extracelulares con una fase en sangre
crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia):
Respuesta Humoral
Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción
de IgA secretoria neutralizante
Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y
humoral.
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¿Que tipos de vacunas existen?
modificados para
que no puedan
generar enfermedad
Patógenos muertos
Sólo componentes
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Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades?
imitan a la infección, son baratos de producir y administrar
vía oral menor número de dosis requeridas
persisten en el organismo, hay una inmunización mantenida
que pasa progresivamente de vacunación primaria a
secundaria.
Desventajas
costos de almacenamiento y conservación, deben
mantener a 4°C, riesgo afecte al personal
riesgo potencial que revierta
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VACUNAS Atenuadas o Vivas: Microorganismos vivos que
multiplican con reducida patogenicidad (infección leve)
inmunidad humoral y celular
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BCG
Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce
Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También
CD8+ y CD1.
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VACUNAS Inactivadas o Muertas:
Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos
físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo
capacidad inmunogénica
Inmunidad generada sólo humoral,
Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de
dosis
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Subunidades procedimientos de fermentación y
purificación que han permitido la producción de vacunas a
base de subunidades o antígenos purificadas
· Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados,
· Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi,
· N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares,
· Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos
capsulares,
· Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad
polisacárido incrementada unida a proteína transportadora,
· N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacaridos
capsulares conjugados con proteínas antigénicas
(meningococo, neumococo)
TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica)
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Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y
vacunas conjugadas, son débilmente
inmunogénicas
Adyuvantes
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Monovalentes: una única
especie un antígeno
Polivalentes: única especie
de distintos antígenos
Combinadas: varias especies
• Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos.
• Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria +
tétanos +pertussis.
• Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria +
tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b.
• Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa +
Hib + poliomelitis inactivada.
• Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Sandra
HibRuzal
+ CTBT
hepatitis
B.
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Instalaciones de producción
1) Debe limpiarse fácilmente y
completamente;
2) Tienen ventilación adecuada y
aire filtrado;
3) tienen abundante agua limpia
caliente y fría y drenaje eficaz
4) tienen vestuarios y otras
instalaciones para el personal
que es accesible sin pasar a
través de áreas de preparación
de productos biológicos.
5) tienen diseño que evita
contaminación ambiental.
Material utilizado en producción
tiene que hacerse seguro antes
de salir de la instalación.
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Los virus se cultivan tanto en las células
primarias, tales como huevos de gallina (xej
influenza), o en líneas celulares continuas,
tales como cultivos de células humanas (x ej
hepatitis A). Las bacterias son cultivadas en
biorreactores
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http://www.anmat.gov.ar/Medicamentos/Medicamentos.asp
Disposición ANMAT 705/2005
Requisitos para la inscripción de vacunas.
1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales
2. Estudios clínicos en humanos:
• Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área
endémica. evalúa la seguridad y potencia de la vacuna.
• Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios.
• Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que
habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos
vacunados.
3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir
de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación
(licencia) y registro de la vacuna.
4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años.
Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la
transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo
después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los
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planes de vacunación de la región.
inoculo
semilla
biorreactor
centrifugación
estabilizador liofilizada
molienda
encapsulado
las bacterias deriva de lote de semillas de trabajo son inoculadas en
frasco de cultivo, seguido por el crecimiento en medio en biorreactores a
gran escala. Las bacterias son cosechadas por centrifugación. Para el
procesamiento las bacterias se mezclan con un estabilizador, liofilizadas
y encapsuladas a concentración de 2–10 x 109 bacterias
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Bondades de una vacuna ideal
•
•
•
•
Precio competitivo.
Inocuidad.
Estabilidad física y genética.
Posible inmunización simultánea contra múltiples
componentes protectores de diversos patógenos.
• Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía
Oral
• Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2
semanas.
• Estimulación de respuesta inmune humoral y
celular a nivel sistémico.
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El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Problemas
i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en
las condiciones normales de cultivo
ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de
medidas de seguridad muy elevadas
iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles
por este tipo de vacunas;
iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la
vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o
muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la
vacuna;
v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar
completamente inactivados y mantener la toxicidad en la
vacuna final
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vacunas recombinantes
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El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Soluciones
a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su
deleción en los agentes infecciosos creando clones
avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular
la respuesta inmune;
b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los
determinantes antigénicos de un patógeno específico o de
varios;
c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden
aislar los genes de las proteínas que contienen los
determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y
expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento
(bacteria)
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•Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para
producir alguno de los componentes del patógeno
4 subtipos
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Las vacunas recombinantes de tipo subunidad
producto del gen expresado en bacteria, es cosechado,
purificado y administrado como una vacuna
Ej: lipoproteína superficie externa OspA de Borrelia
burgdorferi
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proteínas L1 (capside mayor)
recombinantes forman
partículas “tipo-virus” (VLPs,
virus-like particles), carentes del
genoma viral, y por lo tanto no
infectivas
Segunda generación
XBio-Leloir
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Las vacunas recombinantes de gen deletado
vacunas con genes deletados asociados con la virulencia
o patogenicidad de una bacteria patógeno;
Ej: ensayos clínicos vacuna de cepas estables del agente
del cólera (Vibrio cholerae).
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Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de
organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se
inserta un material genético específico de otro patógeno
Utilizan virus o bacterias vivos como vectores
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Ej: Salmonella,
Mycobacterium
• HIV, Helicobacter
• La Salmonella entérica
viva atenuada es útil
como portadora de
antígenos heterólogos
para la vacunación,
capacidad de invadir
células de mucosa
• la eficacia fue
demostrada con
experimentos de
vacunación usando
antígenos protectores
con Listeria
monocytogenes.
Multiplicación si es en intracelular puede integrarse en el
genoma recombinación genética
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• Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva
2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):
• Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en
diferentes especies
• Estudio de posible transmisión horizontal y
recombinación potencial del vector vacunal o de parte
de él.
• Estudio de especificidad de especie
• Estudio de la posible instalación en el ambiente.
• Método validado para poder distinguir entre vacuna y
microorganismo “salvaje”, especialmente en
situaciones de planes de control y erradicación de la
enfermedad.
• Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados
con el mismo vector pero acompañado de otras
secuencias.
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Differentiating Infected From Vaccinated Animals
Problema: Recombinantes
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Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el
antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado
y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen
inyectado directamente
en las células, in vivo,
donde luego es
traducido y expresado
induciendo la respuesta
inmune
•Efecto adyuvante
•5´-purina-purina-CGpirimidina-pirimidina-3´
• > Frecuencia en bacterias
•Metilados en C vertebrados
Experimental
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Gene-gun
Inmunización
Transcutánea
intramuscular
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• Existen riesgos asociados:
• Existen beneficios asociados:
• Integración potencial del
• Efectivas en modelos
animales sin necesidad de
plásmido en el genoma de
adyuvantes o sistemas de
las células hospedadoras.
administración.
• Inducción potencial de
anticuerpos contra ADN del
• Solo expresan genes que
plásmido inyectado.
inducen inmunidad.
• Problema de conformación
• Las produce el mismo animal,
no nativa de proteinas
siguiendo las instrucciones
bacterianas en vacunas con
del gen insertado en el
ADN inoculadas en
plásmido de expresión.
animales.
• Liberación accidental de las
• Menor dependencia de la
cadena de frío que las
construcciones de ADN
vacunas con proteínas.
desnudo pueden favorecer
• Bajo Costo
transferencia horizontal de
genes
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Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas
genéticamente que actúan como bioreactores de
antígenos
Experimental
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VACUNAS COMESTIBLES
Vacunas orales
Vehículos: células enteras LAB
o esporas Bacillus
sobrevivir aparato gastrointestinal
•retención de 2 a 3 días
•Vehículo de baja inmunogenicidad
•propiedades adyuvantes
•Sistemas genéticos (Food-Grade)
•No necesita aislamiento y purificación del antígeno
•producción IgA
•administración fácil, evita uso agujas
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Por qué aún no es posible?
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Por qué aún no es posible?
Transferencia Horizontal con bacterias intestinales
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La vacunología reversa
consiste en una búsqueda de
secuencias de genoma para la
identificación de putativos
antígenos proteicos de
superficie que podrían
utilizarse como candidatos
para vacunas
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