Ruzal Vacunas 2014[1].pdf
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Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT Biotecnología Animal y en Salud Humana) VACUNAS SANDRA RUZAL Departamento de Química Biológica FCEN-UBA IQUIBICEN-CONICET sandra@qb.fcen.uba.ar Sandra Ruzal CTBT 2014 1 • VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa. Generaba Protección a reinfección • Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico → especificidad y memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico) inventó en 1796 la primera vacuna contra la viruela. El experimento consistió en inyectar a un niño de 8 años la vacuna procedente de una pústula del brazo de una ordeñadora (contagiada x VACA) a través de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al niño ante la viruela humana. Sandra Ruzal CTBT 2014 2 Aparición principales vacunas de uso humano: - 1796: Vacunación contra la viruela - 1885: Vacuna contra la rabia Pasteur µorg atenuados - 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa - 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla cultivo celular y - 1943: Vacuna contra influenza desarrollo de virus - 1954: Vacuna inactivada contra virus polio - 1956: Vacuna viva atenuada contra virus polio humanos fuera del organismo vivo - 1960: Vacuna contra el sarampión Edad de oro - 1966: Vacuna contra la rubeóla - 1975: Vacuna contra hepatitis Bsubunidades - 1980: Viruela erradicada - 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B) - 1988: Vacuna contra H. influenzae B conjugada Sandra Ruzal CTBT 2014 3 esperanza media de vida al nacer en el mundo es de 69 años en las mujeres y 65 años en los varones. Vacunas “A excepción del agua limpia, ningún otro factor, ni siquiera los antibióticos, ha ejercido un efecto tan importante en la reducción de la mortalidad...” Nivel más bajo de mortalidad de niños menores de 5 años. Sandra Ruzal CTBT 2014 4 Incidencia pre- y post- vacunación Nuevas vacunas que protegeran contra tres organismos: el neumococo, el rotavirus y el VPH. Las vacunas evitan más de 2,5 millones de muertes de niños al año. Las nuevas vacunas disponibles podrían evitar otros dos millones de muertes al año entre niños menores de cinco años. Aún así, hay 24 millones de niños que quedan sin vacunar: en 2007, más del 10% de los niños menores de un año de los países en desarrollo no recibieron ni siquiera una dosis de DTP, frente al 2% en los países industrializados En 2000, el costo medio de inmunizar a un niño nacido vivo era de US$ 6 y aumenta hasta US$ 18 en 2010. Para 2015 sería de US$ 30 ¿Merece la pena la inversión? Los datos sobre la costo-eficacia de la inmunización muestran que por ejemplo, la erradicación mundial de la viruela, que costó US$ 100 millones a lo largo de 10 años hasta 1977, ha permitido ahorrar US$ 1300 millones al año sólo en costos de tratamiento y prevención Sandra Ruzal CTBT 2014 6 Sandra Ruzal CTBT 2014 7 Qué son las vacunas Un preparado complejo Formado por microorganismos completos atenuado o inactivado o bien parte o fracción del mismo Capaz de inducir una respuesta inmune Protectora especifica y duradera frente al mismo microorganismo virulento u otros patógenos, previniendo la infección y enfermedad que estos causan Antígeno: molécula Inmunogénica Inmunogénica: molécula capaz de despertar una respuesta en el sistema inmune y producir memoria inmunológica Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN más efectivo y menos costoso Sandra Ruzal CTBT 2014 8 ¿Que características debe tener? - Segura - Evita la enfermedad - Protege a una proporción alta de quienes la reciben - Induce protección duradera - Carece de efectos secundarios - Estable - Bajo costo por dosis Sandra Ruzal CTBT 2014 9 Tipos de inmunidad Natural Natural PASIVA ACTIVA Artificial Inducción de respuesta Artificial Sueroterapia o Inmunoglobulina Sí No Inicio Tardío Inmediato Duración Larga Transitoria Memoria Sí No Respuestas inmunes que confieren protección: Microorganismos extracelulares con una fase en sangre crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia): Respuesta Humoral Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción de IgA secretoria neutralizante Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y Sandra Ruzal CTBT 2014 humoral. 11 Respuesta primaria 5-10 días Menor Intensidad IgM>IgG expansión clonal de células T y/o B específicas, dan lugar a formación de población de células de memoria. Respuesta secundaria 1-3 días Mayor Intensidad IgG, IgA, IgE Mayor Afinidad de los Ac Sandra Ruzal CTBT 2014 12 ¿Que tipos de vacunas existen? modificados para que no puedan generar enfermedad Patógenos muertos o inactivados Sólo componentes subunidades Las vacunas inactivadas, de subunidades y las de DNA se consideran seguras, debido a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo Sandra Ruzal CTBT 2014 13 VACUNAS Atenuadas: Microorganismos vivos que multiplican con reducida patogenicidad (infección leve) inmunidad humoral y celular Formas de atenuación de virus: Aislamiento de virus patógenos de una especie pero que no lo son para otra (viruela bovina, rotavirus bovino). Pasajes sucesivos en cultivo celular o en embriones de pollo (sarampión, rubéola) Pasajes en otro hospedador (Sabin se hace en células de mono) Por mutagénesis química o térmica o manipulación por técnicas de ingeniería genética Sandra Ruzal CTBT 2014 Recombinación entre cepas virales 14 Bacillus Calmette Guerin BCG Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También CD8+ y CD1. Sandra Ruzal CTBT 2014 15 VACUNAS Inactivadas o Muertas: Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo capacidad inmunogénica Timerosal, mercurial, no muy efectivo, es tóxico, prohibido en humanos. Betapropionolactona, efectiva en bajas concentraciones, alto costo. Bromoetileimida (BEI), cancerígeno. Inmunidad generada es sólo humoral, requieren adyuvantes Ventajas: Son más estables que las vacunas vivas Desventajas: Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de dosis, pueden alterar epítopes Sandra Ruzal CTBT 2014 16 Sandra Ruzal CTBT 2014 17 Respuesta inmune en la vacunación contra polio dosis inyectada de poliovirus inactivados o muertos vacuna oral poliovirus atenuados Subunidades procedimientos de fermentación y purificación que han permitido la producción de vacunas a base de subunidades o antígenos purificadas · Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados, · Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi, · N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares, · Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos capsulares, · Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad polisacárido incrementada unida a proteína transportadora, · N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacáridos capsulares conjugados con proteínas antigénicas (meningococo, neumococo) TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica) Sandra Ruzal CTBT 2014 19 Vacunas conjugadas Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades? imitan a la infección, son baratos de producir y administrar vía oral, menor número de dosis requeridas asemeja in vivo vacunación primaria a secundaria. Desventajas: costos de almacenamiento y conservación, deben mantener a 4°C, riesgo afecte al personal, riesgo potencial que revierta Sandra Ruzal CTBT 2014 21 BACTERIANAS Vivas Atenuadas Células enteras BCG(*), Anticolérica (oral)(**), Antitifoidea (oral). Inactivadas Células enteras Antipertussis de células enteras (Pw), Anticolérica (parenteral)(**), Antitifoidea (parenteral). Toxoides Antitetánica, Antidiftérica. Polisacáridos capsulares Antimeningocócica A-C, Antineumocócica 23 valente, Polisacáridos capsulares conjugadas Anti Haemophilus influenzae b, Antimeningocócica C, Antineumocócica 7 valente Acelulares Antipertussis acelular (Pa) VÍRICAS Vivas atenuadas Virus enteros Antisarampión, Antirrubéola, Antipolio oral (Sabin) Antiparotiditis, Antivaricela, Antifiebre amarilla (**), Inactivadas Virus enteros Antigripal, Antipolio parenteral (Salk), Antirrábica (**), Antihepatitis A, Antiencefalitis centroeuropea (**) Antiencefalitis japonesa (**) Subunidades Antigripal (virus fraccionado) Antihepatitis B (plasma o recombinación genética) Sandra Ruzal CTBT 2014 22 Componentes de una vacuna Antígeno: molécula capaz de inducir una respuesta inmune (virus, parte de virus, células infectadas). Adyuvante: Sustancias que potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica. Particulados Solubles • Sales de Al • Copolímeros no-iónicos • Emulsiones W/O • Saponinas • Liposomas • Citoquinas • Sales de Ca • Toxinas • Micropartículas<10 um • Vitamina D3 Estabilizantes: Sustancias que confieren protección frente a factores que degradan el antígenos. Diluyente: Soluciones a base de ¨buffers¨ que ajustan la concentración Sandra Ruzal CTBT antigénica a la dosis de uso o sirven para la reconstitución de2014 liofilizados.23 Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y vacunas conjugadas, son débilmente inmunogénicas Requieren Adyuvantes Potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica, estimulan la producción de citoquinas. Sandra Ruzal CTBT 2014 24 Inmunógeno Adyuvante Inmunidad Adaptativa (linfocitos) Inmunidad Innata (macrófagos) especificidad Respuesta vacunal intensidad duración orientación En vacunas multi-componentes (más de un antígeno) se debe probar que no existe interferencia entre los componentes. Otra interferencia común son los agentes inactivantes de vacunas de virus inactivados cuando se aplican con otras vacunas que poseen antígenos vivos Combinadas: varias especies • Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos. • Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria + tétanos +pertussis. • Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria + tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b. • Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa + Hib + poliomelitis inactivada. • Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B. Monovalentes: una única especie un antígeno Polivalentes: única especie de distintos antígenos Sandra Ruzal CTBT 2014 26 Vías: practicidad + eficacia + inocuidad oral: cebos o agua intranasal: Gotas o aerosoles parenterales: Intradérmica subcutánea intramuscular endovenosa Sandra Ruzal CTBT 2014 27 PRODUCCIÓN DE VACUNAS Requisitos generales: pura, segura, potente y efectiva Instalaciones adecuadas con personal capacitado GMP (buenas prácticas de manufactura) uniformidad y consistencia Registro del producto y control lote a lote. Factores a considerar: •Diseño del producto (tipo de vacuna, modo de producción, eficiencia, control) • Registro, Semilla, banco maestro • Materias primas, medios y soluciones, calidad del agua, suero y aditivos de origen biológico. • Sistemas de cultivo celular, Infección, Cosecha • Concentración y/o purificación • Inactivación • Formulación • Envase y acondicionado: Presentaciones • Almacenamiento • Control de calidad y cadena de frío • Presentación ante organismos oficiales Sandra Ruzal CTBT 2014 28 • Seguimiento de la conformidad del cliente Instalaciones de producción 1) Diseñadas para garantizar la pureza del producto en todas las etapas de producción como también proteger la salud del personal. 2) Fácil limpieza siguiendo normas bioseguridad y contención de patógenos para evitar contaminaciones cruzadas y prevenir la contaminación del personal y los equipos. 3) Cada proceso limitado a un área definida 4) Con adecuada ventilación y aire filtrado, temperatura y suministro de agua.y drenaje 5) vestuarios y otras instalaciones para el personal accesibles sin pasar a través de áreas preparación de productos biológicos. 5) Diseño que evita contaminación ambiental. Material utilizado en producción tiene que hacerse seguro antes de salir de 29 la instalación. Sandra Ruzal CTBT 2014 inoculo semilla biorreactor centrifugación estabilizador liofilizada molienda encapsulado Sandra Ruzal CTBT 2014 30 Los virus se cultivan tanto en las células primarias, como huevos de gallina embrionados (x ej influenza, rabia, sarampión), Producidas en órganos: Producidas en organismos Cerebro de cordero (rabia), recombinantes: bacterias, Cerebro de ratón (encefalitis levaduras. japonesa) Producidas en cultivos celulares: primarios, secundarios o líneas celulares continuas, tales como cultivos de células humanas (x ej hepatitis A). . Sandra Ruzal CTBT 2014 31 http://www.anmat.gov.ar/Medicamentos/Medicamentos.asp Disposición ANMAT 705/2005 Requisitos para la inscripción de vacunas. 1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales 2. Estudios clínicos en humanos: • Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica. evalúa la seguridad y potencia de la vacuna. • Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios. • Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados. 3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y registro de la vacuna. 4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años. Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los planes de vacunación de la región. Sandra Ruzal CTBT 2014 32 Bondades de una vacuna ideal • • • • • • • • • Precio competitivo. De fácil producción y económica Ser inocua y segura, pocos o ningún efecto adverso. Estabilidad física y genética. Ideal a temperatura ambiente Posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos patógenos. Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía Oral Disparar una respuesta inmune de memoria. Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2 semanas. Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico. Sandra Ruzal CTBT 2014 33 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Problemas i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en las condiciones normales de cultivo ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de medidas de bioseguridad muy elevadas iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles por este tipo de vacunas; iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la vacuna; v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar completamente inactivados y mantener la toxicidad en la vacuna final Sandra Ruzal CTBT 2014 34 Sandra Ruzal CTBT 2014 35 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Soluciones a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su deleción en los agentes infecciosos creando clones avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular la respuesta inmune; b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los determinantes antigénicos de un patógeno específico o de varios; c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden aislar los genes de las proteínas que contienen los determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento (bacteria o levadura) Sandra Ruzal CTBT 2014 36 vacunas recombinantes Sandra Ruzal CTBT 2014 37 Sandra Ruzal CTBT 2014 38 Sandra Ruzal CTBT 2014 39 Sandra Ruzal CTBT 2014 40 La vacunología reversa consiste en una búsqueda de secuencias de genoma para la identificación de putativos antígenos proteicos de superficie que podrían utilizarse como candidatos para vacunas Sandra Ruzal CTBT 2014 41 •Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para producir alguno de los componentes del patógeno El primer antígeno recombinante comercial para humanos es el de la proteína de la cápside del virus de la hepatitis B (HBsAg). Se produce en Pichia pastori y se purifica con técnicas de precipitación de proteínas y columnas de afinidad con Anticuerpos monoclonales, también el antígeno L1 de HPV 4 subtipos Sandra Ruzal CTBT 2014 42 Las vacunas recombinantes de tipo subunidad producto del gen expresado en bacteria, es cosechado, purificado y administrado como una vacuna Antígenos recombinantes producidas en bacterias o levaduras, en plantas. Sandra Ruzal CTBT 2014 43 proteínas L1 (capside mayor) recombinantes forman partículas “tipo-virus” (VLPs, virus-like particles), carentes del genoma viral, y por lo tanto no infectivas Segunda generación XBio-Leloir Sandra Ruzal CTBT 2014 44 Las vacunas recombinantes de gen deletado vacunas con genes deletados asociados con la virulencia o patogenicidad de una bacteria patógeno; Sandra Ruzal CTBT 2014 45 Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se inserta un material genético específico de otro patógeno Utilizan virus o bacterias vivos como vectores Sandra Ruzal CTBT 2014 46 • Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ): • Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies • Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él. • Estudio de especificidad de especie • Estudio de la posible instalación en el ambiente. • Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo “salvaje”, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad. • Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias. Sandra Ruzal CTBT 2014 47 Differentiating Infected From Vaccinated Animals ¨Marker vaccines¨ Se deletean genes no esenciales inmunogénicos Problema: Recombinantes permiten diferenciar la respuesta a la vacuna de aquellos de animales infectados Sandra Ruzal CTBT 2014 48 Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen inyectado directamente en las célula muscular, in vivo, donde luego es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune •Efecto adyuvante •5´-purina-purina-CGpirimidina-pirimidina-3´ • > Frecuencia en bacterias •Metilados en C vertebrados Sandra Ruzal CTBT 2014 49 Inmunización intradérmica Gene-gun intramuscular Vacunas ADN son plásmidos altamente purificados producidos en alta cantidad (g/L) liofilizado y luego inyectados codifican para antígenos que se expresan in situ El plásmido se mantiene por un tiempo como episoma en citoplasma. Sandra Ruzal CTBT 2014 50 Existen riesgos asociados: Existen beneficios asociados: • Efectivas en modelos • Integración potencial del animales sin necesidad de plásmido en el genoma de las adyuvantes o sistemas de células hospedadoras. administración. • estimulación de la respuesta • Inducción potencial de humoral y celular. anticuerpos contra ADN del • Solo expresan genes que plásmido inyectado. inducen inmunidad. • Problema de conformación • Las produce el mismo animal, no nativa de proteínas bacterianas en vacunas con siguiendo las instrucciones ADN inoculadas en animales. del gen insertado en el plásmido de expresión en la • Liberación accidental de forma nativa . las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de • Menor dependencia de la genes cadena de frío que las vacunas con proteínas. • Bajo Costo y menor tiempo Sandra Ruzal CTBT 2014 51 de preparación Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas genéticamente que actúan como bioreactores de antígenos Experimental Sandra Ruzal CTBT 2014 52 Experimental Sandra Ruzal CTBT 2014 53 VACUNAS COMESTIBLES Vacunas orales Vehículos: células enteras LAB o esporas Bacillus sobrevivir aparato gastrointestinal •retención de 2 a 3 días •Vehículo de baja inmunogenicidad Experimental •propiedades adyuvantes •Sistemas genéticos (Food-Grade) •No necesita aislamiento y purificación del antígeno •producción IgA •administración fácil, evita uso agujas Sandra Ruzal CTBT 2014 54 Por qué aún no es posible? Sandra Ruzal CTBT 2014 55 Por qué aún no es posible? Transferencia Horizontal con bacterias intestinales Alternativas??? Status GRAS como carrier no recombinante Sandra Ruzal CTBT 2014 56 Altas inversiones en I+D resultan en altos precios Existencia de “vacunas huérfanas” Diferencia genética de patógenos puede resultar en efectividad relativa Las vacunas tradicionales “baratas” están comenzando a escasear Vacunas tradicionales: disponibilidad vs. demanda Fuente: GAVI Immunization Focus Para pensar…..y resolver ? ¿Qué tipo de vacuna emplearía para proteger un animal contra: -una enfermedad ocasionada por una bacteria de vida intracelular? Ej: Brucella, Mycobacterium tuberculosis y Lysteria monocytogenes,. -una bacteria toxigénica. Ej: Clostridium.
