Biotecnología animal II Conceptos y Técnicas en Biotecnología 2015 Flávio S. J. de Souza Manipulación genética molecular de mamíferos Aplicaciones potenciales - producción de proteinas recombinantes (p. ej: hormonas de mamifero en leche, etc) - mejoramiento de la calidad nutricional de carne o leche (p. ej: leche con más proteinas, carne de cerdo con omega-3 etc) - generación de mejores modelos de enfermedades humanas (p. ej: cerdos con fibrosis quistica, monos con enfermedad de Huntington) - modelo de fibrosis quística: knockout del gen CFTR en cerdos - deleción del exon 10 por un cassette de neo - manipulación de fibroblastos fetales seguido de clonación - cerdos tienen los mismos síntomas de humanos con fibrosis quística sintomas en humanos: - obstrucción del intestino - insuficiencia pancreatica - deformidades en el higado - inflamación crónica del pulmón modelos de ratón: - fenotipo suave cerdo modelo: - obstrucción del intestino - insuficiencia pancreatica - deformidades en el higado - modelo de fibrosis quística: knockout del gen CFTR en el hurón - deleción del exon 10 por un cassette de neo utilizando un vector viral (virus adeno-asociado) para la recombinación homóloga - manipulación de fibroblastos fetales seguido de clonación - fenotipos semejantes a humanos en pulmón, páncreas, obstrucción del intestino (menos grave que en cerdos) - alta incidencia de infecciones pulmonares posnatales (como humanos) distribuidor de hurones CFTR knockout - knockout del gen del low-density lipoprotein receptor (LDLR) en cerdos - hetero- y homocigotas para la mutación desarrollan altos niveles de coleterol en sangre seguido de arterosclerosis Transgénesis con vectores virales - transgenes de interés insertados en vectores derivados de lentivirus lentivirus: retrovirus (RNA) capaz de insertarse en el genoma : capaz de infectar tanto células en división (p. ej. cigota) como células que no se dividen (p. ej. ovocito) - alternativa a la inyección pronuclear vantajas: alta eficiencia de transgénesis : alta supervivencia de embriones manipulados desvantajas: baja capacidad para inserto (c. 10 kb) : bioseguridad con lentivirus Transgénesis con vectores virales LTR: long terminal repeats Transgénesis con vectores virales Transgénesis con vectores virales inyección pronuclear x vectores lentivirales Transgénesis con vectores virales vectores lentivirales: especies e eficiencia Transgénesis con vectores virales - primates transgénicos: hair placenta nails Transgénesis con vectores virales - Huntington's: enfermedad genética degenerativa dominante no tratable; causada por repeats de CAG (glutamina) en la huntingtina human huntingtin with Q CAG-repeats GFP - 130 oocitos tratados con retrovirus - 5 nacimientos de transgénicos (100%) Transgénesis con vectores virales - monos transgénicos con sintomas semejantes a Huntington's: distonia, corea, dificultad de deglutición Transgénesis con vectores virales anti-HTT polyQ immunostaining nuclear inclusions neuropils (array-like) Transgénesis con vectores virales Callithrix jacchus Transgénesis con vectores virales Callithrix jacchus Macaca sp. (Rhesus) -gestation time: 144 days -gestation time: 135-195 days -sexual maturity: 12-18 months -sexual maturity: 3 years -offspring per female lifespan: 40-80 -offspring per female lifespan: 10 Transgénesis con vectores virales lentiral injection into: oocytes followed by intracytoplasmic sperm injection : zygotes from natural mating EGFP transgenic Transgénesis con vectores virales transgenic blastocysts born transgenic pup (F1) transgenic skin Animales transgénicos comerciales productos comerciales de la biotecnología moderna (organismos geneticamente modificados - GMO) - 1982: insulina humana recombinante de E. coli (Genentech) (primer producto derivado de un GMO aprobado para consumo humano) - 1994: tomate Flavr Savr (Calgene) - 1994: soja Roundup Ready (Monsanto) - 2003: GloFish zebrafish (pez ornamental fluorescente - EEUU) - 2003: TK-1 medaka fish (pez ornamental fluorescente - Taiwan) - 2006: ATryn anti-trombina de la leche de cabras transgénicas (GTC Biotech; aprobado en Europa 2006; EEUU 2009) - 2013: salmon transgénico de crecimiento rápido (no aprobado aun) Peces transgénicos - microinyección en embrión de 1-célula: plásmido con gen de interés flanqueado con sitios Tol2 mRNA de transposasa - transposasa integra gen de interés al genoma de las células del embrión (se genera un pez mosaico); - peces transgénicos pueden ser usados para generar una linea estable si el transgén se encuentra insertado en la linea germinal. Kawakami Genome Biology 2007 8(Suppl 1):S7 Peces transgénicos Alexandra Almeida triple transgenic zebrafish embryo Crx-CFP (photoreceptor and bipolar cells); Ath5-RFP (retinal ganglion cells, projects into the brain); Ptf1a-GFP (horizontal and amacrine cells, hindbrain neurons). Confocal fluorescence Peces transgénicos - enhancers del gen de Pomc de ratón dirigen la expresión de GFP a neuronas hipotalámicas de embriones de zebrafish embryonic hypothalamus & pituitary Pomc/ACTH (endogenous) x EGFP (transgene) adult brain - modelo de melanoma en zebrafish transgénico para BRAF (MAP kinasa) con una mutación activante (gain-of-function) encontrada en melanomas humanos - BRAF mutante (BRAFV600E) expresada con promotor de mitfa (específico de melanocitos) origina tumores benignos en melanocitos (nevi) - zebrafish transgénicos para BRAF mutado y además p53-/- desarrollan melanomas como los humanos - screening de genes que aceleran el desarrollo de melanoma en zebrafish transgénicos para el BRAF mutado (BRAFV600E) y p53-/- - la metiltransferasa de histonas SETDB1 estimula la formación de melanomas en los peces... y está aumentada en 70% de los melanomas humanos Peces ornamentales fluorescentes (GloFish) tetra (Gymnocorymbus ternetz) zebrafish (Danio rerio) primer animal transgénico comercial en Ocidente (2003) Salmón transgénico - salmón transgénico que sobreexpresa hormona de crecimiento (crece 2x más rápido) - US$ 60 milliones invertidos 1989 - generación de salmón del Atlántico transgénico para hormona de crecimiento (Canada) 1995 - empiezan los trámites en el FDA (Food and Drug Administration) de EEUU (empresa AquaBounty) 2001 - AquaBounty somete el primer estudio regulatorio al FDA 2009 - AquaBounty termina la aplicación al FDA 2010 - FDA dictamina que el salmón GM es seguro como alimento 2012 - FDA termina el examen de impacto ambiental si es aprobado, sería el primer animal transgénico para consumo humano Salmón transgénico ATryn: anti-trombina humana - anti-trombina: proteina glicosilada de 432 aa con 3 puentes disulfuro : agente anticoagulante; : usada para tratar pacientes con deficiencia hereditaria de anti-trombina - ATryn: anti-trombina humana extraida de la leche de cabras transgénicas - cabras transgénicas desarrolladas en 1993 (por microinyección pronuclear) - aprobada en 2006 (EMA - Unión Europea) y 2009 (FDA - EEUU) - primera proteina recombinante para uso humano producida en animales transgénicos Células-madre humanas (puede originar todo el organismo) (ICM: puede originar las 3 capas germinales) (originan celulas de un linaje limitado) Células-madre humanas - células-madre hematopoyeticas: usadas en el tratamiento de ciertos cánceres (leucemia, linfoma) por transplante de médula osea Células-madre humanas y terapia génica Dec 2006 - epidermolisis bulosa: enfermedad de adhesión de la epidermis : deficiencia en el gen de laminina 5-3 (LAMB3) - aislamiento de células-madre de keratinocitos (holoclones) Células-madre humanas y terapia génica - vector retroviral para expresión de LAMB3 - transducción de células-madre de keratinocitos del paciente - verificación de la expresión del transgén Células-madre humanas y terapia génica - transplante al paciente: experimentos fueron cancelados por el uso de vectores retrovirales Células-madre humanas y terapia génica April 2000 - tratamiento de SCID (immunodeficiencia combinada severa) ligada al X en humanos - enfermedad causada por deficiencia en la subunidad c de receptores de interleukinas 2, 4, 7, 9 y 15 - falla en la diferenciación de linfocitos T y Natural Killers (NK) Células-madre humanas y terapia génica April 2000 - pacientes: P1 y P2 (11 y 8 meses de edad) - tratamiento: transducción de células-madre hematopoyeticas (CD34+) de los pacientes con un vector retroviral (MMLV) con el gen corregido : transferencia de las células transducidas a los pacientes - pacientes: después de 90-95 días dejaron el aislamiento y se fueron a casa Células-madre humanas y terapia génica April 2000 primer caso de terapia génica claramente exitosa Células-madre humanas y terapia génica Oct 2003 - pacientes: 2 de 11 desarrollaron leucemia - causa: inserción del vector retroviral cerca del protoncogén LMO2 Células-madre humanas y terapia génica - pacientes: 2 de 11 desarrollaron leucemia - causa: inserción del vector retroviral cerca del protoncogén LMO2 : tropismo del vector derivado de MMLV por cercanía a oncogenes : MMLV - Moloney murine leukaemia virus Células-madre humanas y terapia génica - solución: uso de vectores basados en virus que NO estén asociados a cancer : lentivirus - HIV - Human immunodeficiency virus Células-madre humanas y terapia génica Nov 2009 - Adrenoleucodistrofia ligada al X: deficiencia en un transportador de membrana que une ATP (ALD, codificado por el gen ABCD1) - falta del gen en microglia (células inmunes del sistema nervioso central) causa desmielinación en varones afectados - síntomas empiezan a los 6-8 años, causa muerte antes de la adolescencia Nov 2009 - agregado del gen ABCD1 a HSCs del paciente - vector basado en HIV (lentivirus) - células derivadas de las HSCs modificadas migran al sistema nervioso (microglia) - 2 pacientes tratados (7 & 7.5 años de edad), seguimiento por 20 meses demostró arresto casi total de los síntomas