Clase 9 Resistencia a hongos AGBT 2015 BYN.pdf

06/09/15 AGROBIOTECNOLOGÍA 2015 Resistencia a hongos y oomicetes fitopatógenos mediante ingeniería gené6ca María Eugenia Segre3n 1. Roya del tallo del trigo: pasta y pan 2. Tizón tardío: papas fritas Phytophthora infestans Puccinia graminis f. sp. tri0ci 3. Enfermedad de Panamá: bananas 4. “Escoba de bruja” y monilia (o vaina escarchada): chocolate Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Fusarium oxysporum Moniliophthora sp. 7. Roya del café: café Hemileia vastatrix 6. “Downy mildew” (mildiú lanoso): quinoa 8. Mildiús (downy y powdery mildew): vino y cerveza 5. “Greening” de los cítricos: Jugo de naranja y Mojitos Peronosporaceae y Erysiphales 9. Aflatoxinas: manteca de maní Peronosporaceae Aspergillus sp. Candidatus liberibacter 1 06/09/15 10. Marchitez del Laurel: Guacamole 11. Cadang-­‐cadang: leche de coco 36,5% de los cul3vos a nivel mundial afectados por enfermedades (Agrios, 2005) Raffaelea lauricola Cadang-­‐cadang viroid Agrios, 2005
Hongos y oomicetes: parecidos pero diferentes Relación filogené6ca entre hongos y oomicetes Pared celular con celulosa y beta glucanos (muy poca qui6na) Muchos hongos y oomicetes desarrollan estructuras especializadas para penetrar y colonizar los tejidos de la planta Pared celular con qui6na (raramente hay celulosa) Los haustorios aumentan el intercambio de sustancias entre el hongo y las células del huésped. Los apresorios son estructuras especializadas en atravesar la cuAcula. Gen3leza Dr. A. Vojnov Micelio de Peronspora parasi6ca desarrollando haustorios en células de Arabidopsis thaliana (40x) 2 06/09/15 Estrategias de patogenia: hemibiotroja Hongos y oomicetes de importancia agronómica Infección por Phytophthora infestans. van Damme et al.,
Effectors in Plant-Microbe Interactions, 2011
Top 10 Hongos y oomicetes fitopatógenos Dean et al., Mol Plant Pathol. 2012 Kamoun et al., Mol Plant Pathol 2015 Seguridad alimentaria y pérdidas de cul3vos debidas a hongos y oomicetes MC Fisher et al. Nature 484, 186-194 (2012) doi:10.1038/nature10947
3 06/09/15 Reportes de alertas por enfermedades causadas por hongos Daños causados por hongos fitopatógenos Arriba izquierda: Infección por Puccinia polysora en hojas de maíz (roya) Arriba derecha: Síntomas provocados por Us0lago maydis en mazorcas de maíz (carbón del maíz) Abajo izquierda: Infección con Gibberella zeae (Fusarium graminearum) en espigas de cebada y en granos de maíz (inserto) MC Fisher et al. Nature 484, 186-194 (2012) doi:10.1038/nature10947
Daños causados por oomicetes fitopatógenos Necrosis y colapso de las hojas de Solanum tuberosum provocado por Phytophthora infestans P. infestans es un patógeno devastador que afecta la producción del
cultivo de papa
ü  P. infestans es un oomicete, causante de la Gran
hambruna irlandesa (1845-1851)
ü  P. infestans puede destruir un campo en 1 semana.
Su control implica el uso de químicos costosos
ü  Ha resurgido en varias partes del mundo
Tizón tardío de la papa provocado por Phytophthora infestans 4 06/09/15 Daños causados por Phytophthora sp. Daños causados por Phytophthora sp. P. parasi6ca P. capsici P. sojae Kamoun et al., Mol Plant Pathol, 2015 Daños causados por oomicetes fitopatógenos hnp://www.fieldcroppathology.msu.edu/ Kamoun et al., Mol Plant Pathol, 2015 Muerte súbita de roble causada por el oomicete Phytophthora ramorum Pérdidas en cul6vos de pimientos por Phytophthora capsici 5 06/09/15 Daños causados por hongos fitopatógenos Lesiones concéntricas causadas por Colletotrichum gloeosporioides (izquierda arriba) y manchas causadas por Podosphaera leucotricha (izquierda abajo) en frutos de durazno. Centro: pudrición en pepinos causada por Rhizoctonia solani. Derecha Arriba: Manchas necró6cas en papaya causadas por Stemphylium lycopersici. Derecha abajo: infección por Botry6s cinerea en frambuesas. Daños causados por hongos fitopatógenos Enfermedad resultante de la infección de arroz y trigo con Magnaporthe oryzae. Dean et al., Mol Plant Pathol. 2012 Daños causados por hongos fitopatógenos en trigo Daños causados por hongos fitopatógenos Infección provocada por Sigatoka Negra en plátano (Mycosphaerella fijiensis) Dis6ntos estadios de infección en Vi0s vinifera por Guignardia bidwellii Izq: trigo infectado con Puccinia graminis f. sp. tri0ci (roya negra del tallo). Der. arriba: trigo infectado con Puccinia striiformis f. sp. tri0ci (roya estriada amarilla de la hoja); derecha abajo: 3zón ocasionado por Fusarium graminearum Dean et al., Mol Plant Pathol. 2012 6 06/09/15 El manejo de enfermedades fúngicas se basa en las prác3cas preven3vas y en la aplicación de fungicidas •  Prác6cas tradicionales de prevención -­‐ Selección de variedades naturalmente resistentes -­‐  Empleo de técnicas de mejoramiento tradicional (introducción de genes de resistencia) Las enfermedades de origen fúngico ocasionan fuertes pérdidas produc3vas y grandes gastos en fitosanitarios -­‐ Rotación de cul6vos y manejo de rastrojos -­‐ Uso de condiciones de almacenamiento controladas -­‐  Uso intensivo de fungicidas: Introduce costos de producción. Afecta el medio ambiente. Es riesgoso para los operarios. Puede ser neutralizado por el riego o la lluvia. Puede originar fungoresistencia. Tomado de: Smarter Pest Control, Special Issue Science 2013 La interacción planta-­‐patógeno no siempre determina el desarrollo de una enfermedad •  No se produce enfermedad cuando: Eventos desencadenados durante el proceso de Interacción -­‐  La planta atacada no puede proveer los requerimientos necesarios para la mul3plicación del patógeno (resistencia de no-­‐hospedante) -­‐ La planta posee defensas estructurales o bioquímicas preformadas. Sólo los patógenos especializados completan una infección exitosa -­‐ Se ga3llan los mecanismos defensivos inducibles de la planta y el patógeno resulta restringido en la zona inicial de la infección (resistencia específica) -­‐ Las condiciones externas cambian y el patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la infección es irreversible •  Se produce enfermedad cuando: -­‐ Las condiciones externas son desfavorables -­‐ Las defensas preformadas son inadecuadas -­‐ La planta no detecta al patógeno y por ende no se producen respuestas defensivas inducidas (o se producen tardíamente) 7 06/09/15 Los productos de los genes R y Avr desencadenan las respuestas defensivas de las plantas Modelo simplificado de la interacción entre productos de genes R y Avr Los genes Avr codifican factores (elicitores específicos) que interaccionan directa o indirectamente con los productos de los genes R. El modelo gen por gen explica los casos de compa3bilidad e incompa3bilidad planta-­‐patógeno El modelo de resistencia gen por gen (Flor, ca. 1940) Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990. Para que exista resistencia (incompa3bilidad) se requiere un gen Avr del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compa3bilidad) La planta y su sistema defensivo Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) en el sistema de genes RPS2-­‐avrRPt2/RPM1-­‐avrRPM1 Si el patógeno infecta y cumple su ciclo vital, se dice que es virulento y la planta suscep3ble (huésped). La interacción se denomina COMPATIBLE Si el patógeno es reconocido y la infección no prospera, se dice que es avirulento y la planta resistente (no huésped). La interacción se denomina INCOMPATIBLE Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003. 8 06/09/15 Estrategias de patogenia: biotroja Patógenos biotróficos: Parásitos obligados que se nutren de células vivas. Crecen en el espacio intercelular, invadiendo sólo unas pocas células mediante estructuras de absorción llamadas haustorios. Las royas, oídios y mildius están comprendidos dentro de este grupo de hongos. Estrategias de patogenia: necrotroja Patógenos necrotróficos: Invaden agresivamente los tejidos de la planta y matan a las células para obtener nutrientes mediante toxinas o enzimas. Infección de trigo por Erysiphe graminis Infección de Solanum tuberosum por Fusarium spp. islotes verdes
Infección de soja por Phakospora pachyrhizi Infección de vid por Peronospora farinosa (izquierda) y Erysiphe necator (derecha) Infección de Solanum tuberosum por Alternaria spp. Infección de trigo por Erysiphe graminis Estrategias de patogenia: hemibiotroja Tomado de: Redepapa Infección de Solanum tuberosum por Phytophthora infestans. Estrategias de patogenia: hemibiotroja Infección de frutos de tomate por Phytophthora infestans Patógenos hemibiotróficos: Se comportan como parásitos biotróficos durante los primeros estadios de la infección. Al avanzar la colonización, el tejido muere y con3núan su ciclo como necrotróficos. Entre ellos, el de mayor importancia agronómica es Phytophthora infestans. Infección por P. infestans. 9 06/09/15 En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Estrategias de patogenia: hemibiotroja Infección por Phytophthora infestans. van Damme et al.,
Effectors in Plant-Microbe Interactions, 2011
En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013
Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013
En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013
10 06/09/15 En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013
En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013
Interacción planta-­‐patógeno: modelo ZIG-­‐ZAG-­‐ZIG Selección natural: favorece que el patógeno pierda o cambie , o adquiera . Por su parte, la selección natural favorecerá nuevos NB-­‐LRR que reconozcan  PAMPS: microbial/pathogen-­‐associated molecular panerns PRR: Panern recogni3on receptor PTI: PAMP-­‐triggered immunity Jones and Dangl, Nature 2006
ETS: effector-­‐triggered suscep3bility ETI: effector-­‐triggered immunity (versión amplificada de PTI que supera el umbral para desencadenar HR) 11 06/09/15 En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Wirthmueller et al. Nature Rev. Microbiol., , 2013 En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” (sistema secreción Tipo III) Ejemplo de supresión de la inmunidad por Albugo laibachii: A. thaliana Col-­‐0 es resistente a Hyaloperonospora arabidopsidis Emoy2 via RPP1 (gen R) pero, cuando es pre-­‐infectada con A. laibachii, permite ahora el crecimiento de ambos patógenos Kay y Bonas, Curr. Op. Microb., 2009 Wirthmueller et al. Nature Rev. Microbiol., , 2013 Kamoun et al., Mol Plant Pathol, 2015 12 06/09/15 En la interacción con la planta los microorganismos secretan “efectores” Mime6smo floral (pseudo-­‐flores) ocasionado por el hongo Puccinia monoica. Genes involucrados en resistencia local a patógenos Cano LM, Raffaele S, Haugen RH, Saunders DGO, et al. (2013) Major Transcriptome Reprogramming Underlies Floral Mimicry
Induced by the Rust Fungus Puccinia monoica in Boechera stricta. PLoS ONE 8(9): e75293. doi:10.1371/journal.pone.0075293
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0075293
Biotechnological strategies for
improving plant immunity. (A)
Microbial pattern (PAMPs/MAMPs)
or effector recognition through plant
patternrecognition receptors
(PRRs) or resistance proteins (Rproteins) triggers plant immune
responses. Improving microbe
recognition capacities in
plantsboosts plant immune
pathways in their entirety. (B)
Activating intermediate components
of plant immune signaling pathways
provides another way
ofengineering enhanced plant
immunity. Activated immune
signaling pathways are indicated in
red (A, B). (C) During infection,
plant pathogens deliver a
multitude of effectors into host,
many of which suppress host
immunity. Interference by genetic
engineering or by chemicals with
the activities of
microbial effectors may open a
novel route towards improving
disease control in crops. (D)
Beneficial soil microbes and
diverse chemicals are able to
sensitize plants for follow-up
infections without triggering plant
immune responses themselves.
This process is referred to as
‘priming’ and results in amore rapid
and/or stronger immune response
to infection.
Adaptado de: Hammond-­‐Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003. Estrategias para obtener resistencia mediante ingeniería gené3ca §  Expresión de genes de Receptores de PAMPs (PRRs) heterólogos §  Expresión de genes R (NB-­‐LRR) §  Expresión de genes S (suscep6bilidad) §  Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal §  Expresión de proteínas an6microbianas de otros organismos §  Sobre-­‐expresión de genes que regulan respuestas defensivas §  Inducción de respuestas defensivas §  Modulación de la respuesta oxida6va §  Interferencia con el proceso de patogénesis §  Detoxificación de toxinas fúngicas/bacterianas §  Silenciamiento de genes del patógeno 13 06/09/15 Interacción efectores-proteínas R
Hipótesis:
1) Interacción
directa
Estrategias para obtener resistencia Transformación con genes de resistencia (NB-­‐LRRs) El uso con3nuado de cul3vos portadores de genes R puede originar la aparición de patógenos resistentes Efector
(patógeno)
Molécula
blanco
del efector
Proteína R
Molécula
señuelo
2) Hipótesis
del guardián
3) Hipótesis
del señuelo
¿Cómo evitar la aparición de resistencia? Un cultivo homogéneo favorece
la aparición de resistencia.
El uso de variedades con distintas
resistencias aumenta la heterogeneidad.
El uso de múltiples líneas transgénicas
permite utilizar un fenotipo homogéneo.
La introducción de varios genes R en la
misma línea simplifica el manejo agronómico.
El ciclo ú6l de un gen de resistencia dura entre 8 y 12 años Buchanan et al., Plant Molecular Biology and Biochemistry, 2001
14 06/09/15 El feno3po de resistencia puede u3lizarse para clonar nuevos genes de resistencia Clonado del gen RB de Solanum bulbocastanum Rpi-­‐vnt1.1 (de Solanum venturii) confiere resistencia a Phytophthora infestans mediante transformación gené6ca de cul6vares suscep6bles de papa y tomate Se transformaron plantas suscep3bles (Solanum tuberosum cv. Katahdin) con dis3ntas secuencias de ADN genómico provenientes de una especie (Solanum bulbocastanum) resistente al patógeno Phytophthora infestans. Estas especies no pueden cruzarse para obtener híbridos Luego se evaluó la adquisición de resistencia en las líneas transgénicas en ensayos controlados. Foster et al., MPMI 2009 Tomado de: Song et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003. Papas transgénicas que expresan el gen Rpi-­‐vnt1.1 (de Solanum venturii) son resistentes a Phytophthora infestans en ensayos a campo Estrategias para obtener resistencia Genes de suscep3bilidad Plantas de papa transgénicas expresando Rpi-­‐vnt1.1 (izq.) y no transgénicas Desiree (der.) en ensayos a campo. La fotograja se tomó al mes de los primeros síntomas de infección. Jonesr et al.,Phil Trans Roy Soc 2015 15 06/09/15 Genes de Suscep3bilidad (S) Genes de Suscep3bilidad (S) ü  Genes de la planta que facilitan la infección y posibilitan la compa6bilidad ü  Las mutaciones o pérdidas de genes S limitan la habilidad del patógeno de causar enfermedad Genes R: wpicamente dominantes Genes S: resistencia conferida por mutación o pérdida es generalmente recesiva ü  un gen S mutado puede causar resistencia específica a un patógeno cuando: * interfiere con la pre-­‐invasión (ej: reconocimiento del huésped) * interfiere con mantenimiento post-­‐invasión (ej: disponibilidad de nutrientes) ü  un gen S mutado puede causar resistencia de amplio espectro cuando: * posibilita defensas prolongadas o cons3tu3vas, aunque pueden traer asociados problemas de “autoinmunidad” con penalidad para el fitness de la planta Genes contribuyendo a la suscep3bilidad: MLO Figure 1. The host plant promotes suscep3bility to pathogen infec3on at several key steps: (i) anrac3ng pathogens by plant-­‐derived molecules and s3mula3ng their anachment and development on the host surface, (ii) accommoda3ng pathogen infec3on structures, for example, haustoria, and (iii) feeding the uninvited guests. Lapin and Van den Ackerveken, Trends in Plant Science 2013 Figure 2. Changes in plant physiology during infec3on by biotrophic and hemibiotrophic pathogens. Leaves infected with oomycete, fungal, bacterial, and pro3st pathogens show elevated expression of SWEET sugar transporters and cell wall-­‐bound and vacuolar invertases that facilitate phloem unloading and the flux of sugars to the infec3on site. ‘Green islands’ are known to surround rusts and powdery mildew infec3on sites and maintain photosynthesis in the otherwise senescing host 3ssues. Powdery mildew infec3on ac3vates host alcohol dehydrogenases (ADHs) that might play a role in the synthesis of specific metabolites beneficial for the fungus and induces increased DNA ploidy levels in mesophyll cells underneath the infected epidermal cells that could contribute to increased metabolite produc3on. Successful infec3on can also lead to systemic changes in plant physiology, for example, by s3mula3ng photoassimila3on in uninfected leaves. Genes contribuyendo a la suscep3bilidad: MLO hnp://www.bio1.rwth-­‐aachen.de/PlantMolCellBiology/research.html Barley mlo mutants are broad-­‐spectrum resistant to powdery mildew. Phenotype of a suscep3ble (Mlo , le|) and a mlo -­‐resistant (right) barley genotype inoculated with Blumeria graminis f. sp. hordei K1 conidia and photographed at six days a|er inocula3on. Reinstädler et al. BMC Plant Biology 2010, van Schie and Takken, Annu. Rev. Phytopathol. 2014 van Schie and Takken, Annu. Rev. Phytopathol. 2014 16 06/09/15 Genes S y efectos pleiotrópicos asociados a sus alteraciones Esquema clasificatorio para determinar u3lidad de genes S en mejoramiento First, recessive resistance is observed (mutant with reduced suscep3bility). Second, pleiotropic effects should be monitored (growth, yield, fer3lity, senescence, and abio3c stress tolerance). If a deleterious phenotype is present, it is important to test whether it can be alleviated in a different gene3c background. Third, the plant response to pathogens with a different lifestyle (biotroph versus necrotroph) should be evaluated. Lastly, plant performance should be tested in field condi3ons, as interac3ons with beneficial microbes, such as rhizobia and mycorrhiza, may be affected. van Schie and Takken, Annu. Rev. Phytopathol. 2014 Hückelhoven et al., Plant Pathology 2013 Estrategias para obtener resistencia Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal Compuestos que par3cipan de las respuestas defensivas de las plantas •  Proteínas relacionadas a patogénesis (proteínas PR): Proteínas que se inducen frente al ataque de un patógeno. Expresadas individualmente, proveen resistencia parcial. Muestran efectos sinérgicos expresadas en combinación. -­‐ Defensinas: Pép6dos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. Muestran ac6vidad an6fúngica in vitro. Extracelulares (PR12). -­‐ Tioninas: Pép6dos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. An6fúngicos y an6bacterianos. Son secretadas a vacuolas, cuerpos proteicos y pared celular (PR13). •  Fitoalexinas: Compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con ac6vidad an6bacteriana y/o an6fúngica. Se sinte6zan rápidamente en respuesta a la infección con patógenos o al tratamiento con elicitores. Ej: capsidiol •  RIPs: Proteínas inac6vadoras de ribosomas, actúan depurinando el ARNr 28S. Clasificadas en dos 6pos (I y II). El Tipo I suele ser el menos tóxico. 17 06/09/15 Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal Familias de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR) Familia
Miembro tipo
Características
PR-1
PR-1a de tabaco
Antifúngica, antioomycete
PR-2
PR-2 de tabaco
Glucanasa ß 1→3
PR-3
P, Q de tabaco
Quitinasa
PR-4
R de tabaco
Antifúngica
PR-5
S de tabaco
Antifúngica, antioomycete
PR-6
Inhibidor I de tomate
Inhibidor de proteinasas
PR-7
P69 de tomate
Endoproteinasa
PR-8
Quitinasa de pepino
Quitinasa
PR-9
Peroxidasa de tabaco
Peroxidasa
PR-10
PR-1 de perejil
Tipo ribonucleasa
PR-11
Quitinasa clase V
de tabaco
Quitinasa
PR-12
Defensinas
Antifúngica
PR-13
Tioninas
Antifúngica
PR-14
Proteínas de transferencia
de lípidos
Antifúngica
Expresión del gen de glucanasa Gns-­‐1 en arroz WT
GNS-1
3 mm
WT
GNS-1
Reducción del índice de enfermedad (DI) esperada y medida para líneas transgénicas que expresan GLU/CHI y RIP/CHI Co-­‐transformación de Nico0ana tabacum con genes de qui6nasa, glucanasa y RIP de cebada Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995. Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995. Planta
No
infectada
Wt no inoculado SR1
Apariencia de plantas transgénicas y control que co-­‐expresan altos niveles de RIP y qui3nasa (CHI) a los 18 d de desarrollo en un ensayo de infección con Rhizoctonia solani Nivel de expresión
Reducción de DI (esperada)b
GLUa
CHIa
GLU
CHI
Suma
Reducción de
DI (medida)
pGJ40-1
5,9
0,3
20 %
10 %
30 %
49 %
pGJ40-2
2,0
1,1
5%
20 %
12 %
60 %
pGJ40-3
0,25
0,1
0%
0%
0%
25 %
Planta
Infectada
Wt inoculado SR1
Sin embargo, la sobrexpresión no regulada afecta la fisiología de la planta y provoca la aparición espontánea de puntos necró3cos (feno3po lession-­‐mimic) Tomado de: Nishizawa et al. Plant Mol. Biol., 2003. Expresión combinada de genes an3fúngicos Infectada
RIP+CHI inoculado CHI / RIP
El gen Gns-­‐1 de arroz es análogo a genes de glucanasa de otros organismos. Su sobrexpresión acelera la aparición de Respuesta Hipersensible frente a Magnaporthe grisea. Nivel de expresión
Reducción de DI (esperada)b
RIP
Suma
Reducción de
DI (medida)
0%
0%
26 %
14 %
40 %
55 %
29 %
50 %
RIPc
CHIc
CHI
pGJ40-1
0,005
0,1
0%
pGJ40-2
0,10
0,5
26 %
pGJ40-3
0,07
0,2
22 %
7%
a % de proteína de fluido apoplás6co. b Basados en datos de plantas transgénicas portando construcciones para un solo gen. c % de proteína foliar total. 18 06/09/15 Los pép3dos an3microbianos poseen una estructura similar en moluscos, insectos, plantas y mamíferos s
Las defensinas se sinte3zan abundantemente durante la germinación de las semillas Las defensinas son pép6dos pequeños ricos en cisteína que se acumulan durante la germinación de las semillas y en el transcurso de reacciones defensivas de plantas en crecimiento. Cons6tuyen la versión vegetal de los pép6dos lí6cos involucrados en la respuesta innata en animales. -­‐ La mayoría de las defensinas vegetales presentan ac3vidad an3fúngica. -­‐  Su ac3vidad estaría dada por la formación de poros en las membranas o por la alteración de la distribución de cargas. -­‐ Otras defensinas son capaces de inhibir α-­‐amilasas, sugiriendo un rol en la defensa frente a insectos. Liberación de compuestos an6fúngicos por semillas de rábano en germinación En la posición 1 se aplicó 1 µg de Rs-­‐AFP1; en la posición 2 se aplicaron semillas intactas de rábano; en la posición 3 se aplicaron semillas con una incisión en su cubierta. Para el ensayo se usó el hongo Pyrenophora tri0cirepen0s A: Ensayo con agar control; B: Ensayo con agar complementado con 50 µg/ml de pronasa E; C: Ensayo como en A, pero autoclavando la defensina Rs-­‐AFP1 y las semillas; D: Ensayo con agar complementado con 100 µM de ácido abscísico Tomado de: Thomma et al. Planta, 2002. Secuencia pepwdica de dos defensinas de rábano. Las líneas de conexión indican puentes disulfuro. Sobrexpresión de una defensina de Nico6ana megalosiphon en solanáceas Sobrexpresión de una defensina de Nico6ana megalosiphon en solanáceas Por3eles et al., Plant Biotechnology Journal 2010 Por3eles et al., Plant Biotechnology Journal 2010 Plantas transgénicas de papa en ensayos a campo para evaluar resistencia a Phytophthora infestans 19 06/09/15 Expresión del gen de endoqui3nasa de Trichoderma harzianum Resistencia a Alternaria alternata de plantas de tabaco transformadas con un gen de endoqui6nasa de Trichoderma harzianum Estrategias para obtener resistencia Expresión de proteínas an3microbianas de otros organismos Síntomas de enfermedad a los 15 días de la inoculación y ac6vidad de endoqui6nasa en extractos de hojas de líneas transgénicas representa6vas. La ac6vidad endoqui6nasa se expresa como pmoles de 4-­‐me6lumbiliferona liberados de 4-­‐me6lumbeliferil-­‐β-­‐D-­‐N-­‐N -­‐N -­‐triace6lquitotriosa/min/µg de proteína Expresión de qui3nasa de Trichoderma harzianum Resistencia a Rhizoctonia solani en plantas transgénicas de tabaco A 1 2 A) Plántulas cul3vadas por 5 días en agar 3 4 B 1: controles sin patógeno 2: controles infectados 3: plantas transgénicas sin patógeno 4: plantas transgénicas con patógeno B) Plantas transgénicas y controles cul3vadas en suelo inoculado con Rhizoctonia solani. Las plantas más erguidas son transgénicas (cajas de la derecha). En la esquina inferior izquierda se muestran plantas control no inoculadas. Las cajas centrales y la superior izquierda corresponden a controles no transgénicos inoculados La estructura
anfipática
de los péptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
acción
Mecanismos de acción postulados
para péptidos antimicrobianos
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Tomado de: Lorito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 20 06/09/15 Las glándulas dorsales de los anfibios son una fuente rica en pép3dos an3microbianos Esquema radial de la magainina, pép6do obtenido de Xenopus laevis Modelo de acción de pép6dos 6po magainina en asociación con la membrana Los pép3dos lí3cos se unen inicialmente a la membrana plasmá3ca (A), En etapas sucesivas, forman poros en la misma (B) y desestabilizan la estructura de la bicapa lipídica (C) . Expresión
plastídica
de un péptido
antimicrobiano
para el control
de bacterias
y hongos
fitopatógenos
•  Péptidos antimicrobianos
- Son péptidos con estructuras α-hélice componentes del
sistema de defensa innato de los animales.
- Participan en el control de la flora bacteriana normal
y en la defensa contra patógenos.
- Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos,
células de mamíferos).
- El péptido MSI-99 es un análogo de la magainina-2
secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.
•  La acción de los péptidos antimicrobianos es concentracióndependiente. Los cloroplastos son un sistema atractivo para
lograr altos niveles de acumulación.
Construcción empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum
trnI
16SrDNA
Orf131
trnV
rps12
Orf70B
MSI-99
Prrn
aadA
TpsbA
Tomado de: Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta,1998. Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos de actividad antibacteriana
in vitro de extractos vegetales sobre
Pseudomonas syringae pv tabaci
Resistencia in planta a
Pseudomonas syringae pv tabaci
Transgénica T0
Expresión del pép3do MSI-­‐99, en cloroplastos de tabaco Ensayo de infección con Colletotrichum destruc0vum Control Transgénica No transformada
Tomado de: De Gray et al.,Plant Physiol., 2001. •  Se transformó el genoma plaswdico con un gen sinté3co MSI-­‐99, el que codifica un análogo al de magainina (Xenopus laevis). Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.
Se cuantificó por DO el crecimiento bacteriano
T1 y T2: generaciones de plantas transgénicas
10A, 11A y 13A: líneas de plantas transgénicas.
Se inocularon las hojas con distinto número
de células de Pseudomanas syringae pv tabaci;
se evaluaron los síntomas a los 5 días.
•  Se observó ac3vidad in vitro contra Colletotrichum destruc6vum, Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme y Ver6cillium dahliae. 21 06/09/15 Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de dermasep3na, AP24 y lisozima Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de dermasep3na, AP24 y lisozima ApLyDe-­‐12 ApLy-­‐47 Ly-­‐55 NT Ap-­‐2 De-­‐8 Ensayos de infección in vitro con Phytophthora infestans Rivero et al., Journal of Biotechnology 2011 Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de dermasep3na, AP24 y lisozima Incremento de resistencia a Fusarium solani. A: minitubérculos de papa inoculados con 1x108 conidias de F. solani por ml. Se muestran lesiones representa6vas de muestras controles y de dis6ntas líneas transgénicas a los 7 d.p.i. B: Inhibición de F. solani en ensayos de crecimiento in vitro en presencia de extractos de hoja de plantas transgénicas y control. Foto tomada a los 7 d de adición de los extractos. Rivero et al., Journal of Biotechnology 2011 Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de dermasep3na, AP24 y lisozima Resistencia a Rhizoctonia solani. A; ensayos de infección en hojas aislada de plantas transgénicas y control. Las hojas fueron inoculadas con un tapón de micelio de 0,5 cm de diámetro. Los ensayos incluyeron 20 hojas de cada línea transgénica. B: Inhibición del crecimiento de R. solani en ensayos in vitro realizados en presencia de extractos de hojas de plantas transgénicas y control. Foto tomada a los 5 d de adición de los extractos. 22 06/09/15 Desarrollo de plantas transplastómicas de papa (Solanum tuberosum) resistentes a patógenos Grupo Bravo-­‐Almonacid Desarrollo de plantas transplastómicas de tabaco que sobreexpresen AP24 y glucanasa AP24 (osmo3na tabaco) PR-­‐5 básica; permeabilización membranas Dr. Lázaro Hernandez, CIGB, Cuba Dermasep3na S1 Wikispecies Phyllomedusa sauvagei Clonado por J.P. Luppi β-­‐1,3-­‐glucanasa clase I PR-­‐2; ruptura del glucano Dr. Lázaro Hernandez, CIGB, Cuba !
Ensayos de desajo de plantas transplastómicas de tabaco sobreexpresando AP24, Glucanasa o AP24+Glucanasa En colaboración con Orlando Borrás-­‐Hidalgo, CIGB, La Habana, CUBA Ensayos de desajo de plantas transplastómicas de tabaco sobreexpresando AP24, Glucanasa o AP24+Glucanasa En colaboración con Orlando Borrás-­‐Hidalgo, CIGB, La Habana, CUBA wt AP+Gluc2 AP+Gluc7 ✔ Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina (Moho azul) Oomicete biótrofo obligado ✔ Phytophthora parasi6ca var. nico6anae (Pata pietra o Pie/vástago negro) Oomicete hemibiótrofo AP24 Gluc AP24 Gluc 3,7 90,7 83,3 % supervivencia Control Ensayos en condiciones de infección a campo Ensayo de resistencia a Rhizoctonia solani en plantas transplastómicas de tabaco. Plantas transplastómicas obtenidas con la construcción pUTRAP24+Gluc (2 líneas independientes) o plantas controles no transformadas (wt) fueron crecidas en sustrato inoculado con micelio del hongo Rhizoctonia solani (hongo necrótrofo que causa damping off). Se incluyen los resultados expresados como % de supervivencia (n=50 plantas sembradas para cada línea evaluada). 23 06/09/15 Estrategias para obtener resistencia Expresión de genes relacionados con la regulación de la respuesta a patógenos El gen NPR1 coordina varios 6pos de respuesta de defensa Expresión de genes relacionados con la regulación de la respuesta frente a patógenos Adapado de: McDowell and Doffenden, Trends in Biotechnolgy, 2003. Sobrexpresión del gen NPR1 en Arabidopsis thaliana y ensayos de resistencia a Peronospora parasi6ca Control no
no transgénico
transgénico Control
Conidióforos
WT
Estrategias para obtener resistencia Ac3vación general de las defensas de la planta Línea transgénica
transgénica 335S-NPR1-H
5S-­‐NPR1-­‐H Línea
Tomado de: Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 24 06/09/15 Expresión de elicitores •  Elicitores -­‐ Son compuestos capaces de promover las respuestas de defensa de las plantas, aún en ausencia de patógenos. -­‐ Varios de ellos, como los oligogalacturonatos y las oligo-­‐N-­‐ace3l-­‐glucosaminas, son ac3vos en diversas especies vegetales; otros poseen ac3vidad específica (por ejemplo, β-­‐criptogeína). •  
•  Expresión en plantas transgénicas -­‐ Si la expresión es regulada por el promotor adecuado, es posible desencadenar una respuesta frente a un patógeno no reconocido habitualmente por la planta. a b a b Expresión en tabaco del elicitor cryptogeína de Phytophthora cryptogea bajo el promotor hsr203J inducible por patógenos -­‐ Es preferible la expresión bajo promotores inducibles por la presencia o la acción del patógeno. Tomado de: Keller et al., The Plant Cell,1999.
-­‐ La planta transformada debe poseer receptores adecuados para el reconocimiento del elicitor (genes R). c d c WT XPR24 d Tran s génicas XPR24 E8 E6 b12 E10 Expresión en tabaco del elicitor cryptogeína de Phytophthora cryptogea bajo el promotor hsr203J inducible por patógenos •  La cryptogeína es una proteína expresada por el patógeno Phytophtora cryptogea. Funciona como un factor de avirulencia y es capaz de inducir una Respuesta Hipersensible en tabaco, especie que posee el gen R correspondiente. •  Sin embargo, el tabaco es suscep3ble a Phytophtora parasi6ca var nico6anae, la que provoca graves lesiones necró3cas en esta planta. •  Al expresar a la crytogeína bajo el promotor hsr203J, inducible por patógenos, la infección por Phytophtora parasi6ca var. nico6anae es capaz de inducir la Respuesta Hipersensible. •  La estrategia se basa en disponer de un par Avr-­‐HR residente en la planta e inducir el producto del gen Avr en forma inespecífica. El promotor inducible debe estar rigurosamente apagado en condiciones de no inducción Necrosis local en hojas . Inoculaciones con: a) Phytophthora parasi6ca var. nico6anae virulenta . (lesión). b) Phythophthora cryptogea avirulenta (HR). c) Tratamiento con criptogeína pura (HR). d) Agua (sin efecto). Wild type Estrategias para obtener resistencia Modulación de la respuesta oxida3va Feno3pos inducidos en líneas de tabaco transformadas al infiltrar las hojas con Phytophthora parasi6ca var. nico6anae. También se observó resistencia a Thielaviopsis basicola,
Erysiphe cichoracearum y Botrytis cinerea
25 06/09/15 Modulación de la respuesta oxida3va Las especies reac6vas de oxígeno (ROS) cumplen varios roles de importancia en la defensa de la planta Es posible aumentar los niveles endógenos de H2O2 en la planta ¿Cómo lograrlo?
- Inhibiendo enzimas detoxificadoras de H2O2
(catalasa, ascorbato peroxidasa).
- Introduciendo enzimas productoras de H2O2
Ejemplo: glucosa oxidasa (GO).
COOH
COH
(CHOH)4 + O2
CH2OH
BA.2H: dehidrogensa del ácido benzoico GO
(CHOH)4
+
H2O2
CH2OH
- Es importante considerar que un incremento
excesivo de H2O2 puede resultar perjudicial
para las células vegetales.
Adaptado de: Buchanan et al. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000. Transformación de Solanum tuberosum con el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger Ensayo de infección con Ver0cillium dahliae Estrategias para obtener resistencia Interferencia con la patogénesis Tomado de: Wu et al., Plant Physiol. 1997. El hongo ataca las raíces y el sistema vascular. Las plantas no transformadas (Rus. Bur) o transformadas con el vector vacío (17227-­‐1) exhiben síntomas severos. Las líneas transgénicas (22587-­‐43 y 22587-­‐9) resultan resistentes. La foto fue tomada a los 40 días de la inoculación. También se obtuvo resistencia al inocular las plantas con Phytophthora infestans 26 06/09/15 Interferencia con el proceso de infección Los elicitores pueden ser moléculas producidas por el patógeno o productos de degradación de la planta: el modelo PG/PGIP PG Adaptado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000. Existen genes an3apoptó3cos que pueden interferir con el proceso de necrotroja 1: Las poligalaturonasas (PG) secretadas por la hifa del hongo interaccionan con los inhibidores de poligalacturonasas (PGIP) presentes en la pared celular. 2: Se liberan oligogalacturónidos que interaccionan con un receptor hipoté3co presente en la membrana de la célula vegetal. 3: La transducción de la señal producida a par3r de esta interacción provoca la liberación de compuestos de defensa, incluidos los PGIPs. 4: Las qui3nasas, glucanasas y fitoalexians son secretadas por la planta. 5: La hifa del hongo invasor es atacada por los compuestos defensivos. -­‐ La respuesta hipersensible (HR) se asemeja a la muerte celular programada (PCD) de mamíferos. -­‐ Es posible que algunos hongos necrotróficos operen u6lizando los mecanismos de muerte celular de la propia planta. -­‐ Se han inves6gado en plantas los efectos de genes inhibidores de apoptosis provenientes de especies no vegetales, entre ellos, Bcl-­‐2 y Bcl-­‐xl humanos, CED-­‐9 de nematodos, Op-­‐IAP y p35 de baculovirus. -­‐ El gen p35 de baculovirus codifica un inhibidor de cisteín proteasas que actúa sobre las capasas, uno de los componentes clave de los procesos apoptó6cos
Sobrexpresión de una proteína inhibidora de poli-­‐
galacturonasa de peral en plantas de tomate Tomado de: Powell et al., MPMI, 2000. Colonización por Botry6s cinerea en plantas de tomate control y transgénicas. Experimentos por duplicado inoculando conidias de las cepas de B. cinerea B05.10 (infec3va; mitad izquierda de las hojas) y ΔBcgp (no infec3va; mitad derecha de las hojas). Se obtuvo una reducción de síntomas de un 25% en las hojas y de un 15% en los frutos Resistencia a Alternaria alternata por expresión de proteína an3apoptó3ca p35 de baculovirus en plantas de tomate Respuesta al hongo Alternaria alternata de plantas controles y transgénicas en invernadero. Asc: Planta control resistente; asc: planta control suscep6ble; p35: planta transgénica Asc: gen de resistencia a Alternaria Tres frutos de un línea suscep3ble (asc-­‐asc, izquierda) y dos transgénicas con dis3ntos niveles de expresión, inoculadas con conidios de Alternaria alternata (centro y derecha). Lincoln et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. 27 06/09/15 Detoxificación de eu3pina mediante una enzima reductora aislada de Vigna radiata •  La eu6pina [4-­‐hidroxi-­‐3-­‐(3-­‐me6l-­‐3-­‐butene-­‐ 1-­‐inil) becil aldehído] es una toxina producida por Eutypa lata, agente causal de una grave enfermedad de la vid (Vi0s vinifera) Estrategias para obtener resistencia Detoxificación de toxinas fúngicas •  Las vides resistentes al hongo 6enen la capacidad de reducir eu6pina a eu6pinol, el cual no es tóxico •  Se aisló una aldehído reductasa-­‐NADPH dependiente de Vigna radiata (VR-­‐ERE) que es capaz de reducir eu6pina •  Se transformaron callos de Vi0s vinifera con este gen y se expresó la enzima en forma cons6tu6va Síntomas producidos por Eutypa lata (chancro de la vid). Detoxificación de eu3pina mediante una enzima reductora aislada de Vigna radiata Estrategias para obtener resistencia Silenciamiento de genes del patógeno Resistencia a eu6pina en diferentes líneas de callos transgénicos transformados con el gen VR-­‐ERE Los callos control y transgénicos se cul6varon en presencia de concentraciones crecientes de eu6pina. El peso del tejido se determinó a las 4 semanas de cul6vo. Cada punto representa 40 duplicados 28 06/09/15 Silenciamiento génico
y resistencia a hongos
Silenciamiento génico
y resistencia a hongos
Cul3vos transgénicos para resistencia a enfermedades en ensayos a campo o aprobados para su comercialización Estrategias para obtener resistencia Situación actual de cul3vos resistentes a patógenos Tomado de: Smarter Pest Control, Special Issue Science 2013 29 06/09/15 Ensayos a campo
autorizados para
eventos con
resistencia a
enfermedades en
USA desde 1987 a
2009
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