Clase 16 AGBT 2015 Las plantas como biorreactores Alicia Zelada_ByN.pdf
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Agrobiotecnología Curso 2015 Las plantas como biorreactores Dra. Alicia M. Zelada Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Sumario Las plantas como biorreactores - Sistemas de expresión - Las plantas como sistema alternativo - Ventajas - Costos comparativos entre distintos sistemas Elementos a considerar en una estrategia de expresión - Nivel de expresión - Sistemas de expresión integrativos y no integrativos - Optimización de costos de purificación Aplicaciones Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores - Expresión de antígenos para la producción de vacunas - Producción de anticuerpos - Producción de proteínas de interés farmacológico - Otras aplicaciones Referencias Las plantas como biorreactores Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores PROCARIOTA Sistemas de expresión de proteínas recombinantes Bacterias: E. coli Plataformas establecidas Levaduras: Saccharomyces - Metilotróficas EUCARIOTAS Células animales Células de insectos Plataformas emergentes Animales transgénicos Plantas Limitaciones de las plataformas de producción en Bacterias, Levaduras y Células animales El plegamiento de proteínas de origen eucariótico sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto Los costos para aumentar la escala de producción son altos en los tres casos Requieren de personal técnico especializado Pueden causar grandes pérdidas económicas por contaminación en la línea de producción Riesgo biológico: presencia de contaminantes en el producto final ENDOTOXINAS / PRIONES VIRUS Algunas ventajas de la utilización de las plantas como biorreactores Permiten una alta producción de biomasa El aumento en la escala de la producción es sencillo y requiere bajos costos de inversión No requieren de personal técnico especializado No implican riesgos de contaminación con patógenos animales o toxinas microbianas Algunas ventajas de la utilización de las plantas como biorreactores Los mecanismos de síntesis y secreción de proteínas y las modificaciones posttraduccionales son las células eucariotas Permiten el almacenamiento estable de la proteína recombinante en semillas y tubérculos Gozan de una mayor aceptación pública respecto de la manipulación de animales. Los costos de producción de proteínas recombinantes en plantas son potencialmente menores que en otros sistemas % Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001. Estimación de los costos de producción en función del nivel de expresión de IgA en distintos sistemas. Elementos a considerar en una estrategia de expresión Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Factores a considerar en el diseño de una estrategia de expresión en plantas • La producción competitiva de proteínas recombinantes en plantas requiere el diseño de estrategias de expresión que cumplan con tres premisas fundamentales: - Obtener altos niveles de expresión. - Disminuir los costos de purificación. - Conseguir un producto de características idénticas al sintetizado en el sistema de . origen. La expresión de la proteína recombinante puede optimizarse mediante diversas estrategias • Elección del sistema de expresión: sistemas integrativos y no integrativos. • Elección de secuencias promotoras de la transcripción adecuadas (promotores tejido específicos, inducibles, constitutivos, etc.). • Utilización de secuencias reguladoras y regiones no traducidas 5´ y 3´ apropiadas. • Eliminación de secuencias desestabilizantes del ARN mensajero. • Optimización del uso de codones (“vegetalización” de la secuencia). • Utilización de secuencias señal para la localización en distintos espacios subcelulares o extracelulares. • Co-expresión de chaperonas para facilitar el plegamiento proteico. Sistemas de expresión en plantas Sistemas de expresión en plantas Integrativos y no integrativos Plantas transgénicas nucleares Plantas transplantómicas Integrativos (cloroplastos) Expresión estable heredable a la progenie No integrativos Expresión transitoria Vectores virales Sistemas de expresión integrativos Plantas transgénicas nucleares La estrategia a elegir debe considerar las ventajas y limitaciones de cada sistema de expresión Sistemas de expresión integrativos Plantas transgénicas nucleares • Ventajas - Expresión estable heredable por la progenie. - Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño de la secuencia a introducir. - Modificación postraduccional de proteínas propia de células eucariotas (glicosilación-fosforilación). • Limitaciones - Niveles de expresión relativamente bajos. - Niveles de expresión afectados por silenciamiento génico postranscripcional. El nivel de expresión depende de la utilización adecuada de las regiones reguladoras La acertada elección y combinación de las secuencias promotoras y reguladoras de la transcripción y de la traducción puede determinar variaciones importantes en los niveles de expresión de la proteína recombinante Contrucciones utilizadas para transformar plantas de Arabidopsis thaliana Nivel de expresión (% de la proteína total soluble) Parc 5’UTR ar ss G4 myc KDEL 3´arc 10% Parc Ω ss G4 myc KDEL 3´arc 5% Pphas 5’UTR ar ss G4 myc KDEL 3´arc 36% P35S 5’UTR ar ss G4 myc KDEL 3´arc 1% Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris. Pphas: promotor de β-faseolina de Phaseolus vulgaris. Ω: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus. ss: secuencia señal de envío a retículo endoplásmico. KDEL: secuencia de retención en retículo endoplásmico G4 myc: secuencia que codifica un anticuerpo de simple cadena Los costos de purificación pueden reducirse explotando características propias de las plantas • Rizosecreción en cultivos hidropónicos y secreción en células en cultivo. • Acumulación en las semillas u otros órganos de almacenamiento para la co-extracción con productos convencionales como almidón o aceites. • Proteínas de fusión que facilitan su purificaciòn: oleosinas-liquenasa termoestable Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores •Producción directa en las partes comestibles de la planta. La rizosecreción permite reducir los costos de purificación • El gen de interés se fusiona a una secuencia señal de . transporte al retículo endoplasmático para direccionar . el producto correspondiente a la vía de secreción. Sitio de procesado de la señal secuencia señal secuencia de interés Inicio de la traducción • La proteína recombinante se obtiene por purificación a partir de la solución hidropónica que circula en torno a la rizósfera. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999. Rizosecresión de la xilanasa de Clostridium thermocellum en tabaco transgénico • La expresión de la xilanasa de Clostridium thermocellum se utilizó como un modelo de producción por rizosecreción. Construcción utilizada para la transformación de plantas de tabaco p35SCaMV secuencia señal Planta no transformada xilanasa Planta transgénica Halo de degradación del sustrato generado por la xilanasa rizosecretada Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999. Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo Remazol Brilliant Blue-xilano como sustrato para la xilanasa. Aumento del rendimiento de rizosecreción por infección con Agrobacterium rhizogenes Las fusiones a oleosinas permiten reducir los costos de purificación • La proteína de interés se fusiona a una oleosina, proteína que normalmente forma parte de los cuerpos grasos de las semillas. Oleosina Gen de interés Sitio de reconocimiento para una proteasa Cuerpos grasos Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Cuerpos proteicos Adaptado de: www.sembiosys.com La purificación a partir de los cuerpos grasos es un proceso sencillo Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Purificación de la proteína recombinante a partir de los cuerpos grasos La producción de hirudina fusionada a oleosinas en plantas de Brassica napus permite purificar la proteína activa HIRUDINA: péptido presente en la saliva de la sanguijuela= actividad anticoagulante Promotor de Oleosina Oleosina Xa Hirudina Xa: sitio de reconocimiento para el factor Xa Trypsin like serine protease Actividad anti-trombina de la fase acuosa luego de la purificación Localización por inmunofluorescencia de la hirudina expresada en los cuerpos grasos aislados Control no transgénico Cuerpos grasos transgénicos sin tratar con proteasas Xa: tratamiento con factor Xa NT: planta no transformada T: planta transgénica Cuerpos grasos transgénicos + factor Xa La hirudina presente en la fase acuosa inhibe la actividad de la trombina Luz blanca Luz UV Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995. Producción de proteínas fusionada a oleosinas en plantas de cártamo (Carthamus tinctorius)- Tecnología patentada por Sembiosys Porqué cártamo? CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos periodos CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fácilmente separada de otras producciones de cártamo CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas Proteínas en desarrollo INSULINA Diabetes Ensayos clínicos Fase I y II APOLIPROTEÍNA A Enfermedades cardiovasculares Ensayos preclínicos en modelos animales OLEOSOMAS Estética Comercialización Producción de insulina humana fusionada a oleosinas en plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) Izquierda: Separación en PAGE-SDS de extractos proteicos totales de plantas transformadas con la fusión oleosina/insulina y de la fracción de oleosinas de las mismas plantas. Wt: control no transformados; 4405-4, 15 y 19: distintas fracciones de purificación de muestras de plantas transformadas. La flecha señala la posición del estándar de insulina. Abajo: Cambios temporales en los niveles de glucosa en ratones tratados con placebo salino (cuadrados abiertos), extracto de plantas no transformadas (círculos llenos), insulina humana estándar (triángulos y círculos abiertos) e insulina derivada de plantas que producen fusiones oleosina/insulina (cuadrados llenos). Arriba: Análisis comparativo por de insulina humana (hIN) y de insulina fusionada a oleosina (OB-hIN) obtenidas por separación en cromatografía líquida de alto rendimiento. Humanización de las glicoproteínas recombinantes • Los patrones de N-glicosilación en plantas difieren de los presentes en mamíferos. • Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la degradación proteolítica y actividad biológica de la proteína expresada, particularmente en anticuerpos. Asn α -1,3 NAcGlc Asn Fuc NAcGlc NAcGlc Man Man Man NAcGlc Xyl Las plantas como biorreactores α-1,6 Fuc Glicanos complejos en mamíferos Man Man Man NAcGlc NAcGlc NAcGlc NAcGlc Gal Gal Gal AcNeu AcNeu AcNeu Glicanos complejos en plantas Agrobiotecnología NAcGlc • Se están ensayando diversas estrategias para humanizar las glicoproteínas recombinantes expresadas en plantas: - Expresión de la β(1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas transgénicas. - Retención de la proteína en el retículo endoplásmatico. - Inactivación de la α(1,3)-fucosiltransferasa y la β(1,2)-xilosiltransferasa de plantas. La especie a utilizar debe seleccionarse de acuerdo con las necesidades de producción de la proteína a sintetizar Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tabaco Sistema de transformación bien establecido. Producción de abundante biomasa. Papa Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en tubérculos. Procesamiento industrial de los tubérculos bien establecido. Contenido proteico en tubérculos relativamente bajo. Tomate Consumo de los frutos crudos. Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en frutos. Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido. Contenido proteico en frutos relativamente bajo. Cereales Tecnología de producción ampliamente establecida. Almacenamiento estable de la proteína recombinante en las semillas. Procesamiento industrial de las semillas bien establecido. Alfalfa Alto contenido proteico en hojas. Producción de biomasa abundante. Lemna Alta eficiencia de proliferación clonal. Alta tasa de duplicación de la biomasa. Rizosecresión muy eficiente. Sistemas de expresión integrativos Sistema de expresión en Lemna Planta acuática comestible (Lemnaceae) • Rápido y flexible • Alta productividad debido alta tasa de crecimiento y altos niveles de expresión (35-40% peso seco) • Bajos costos • Bioseguridad se realiza en confinamiento y no hay riesgo de contaminación con patógenos humanos Sistemas de expresión integrativos Sistema de expresión en Lemna • Lemna Gene TM Tecnología de produción basada en Lemna • Proteínas recombinantes para industria veterinaria y farmaceutica • Vacunas recombinantes humanas y animales •Anticuerpos monoclonales •Aditivos como enzimas y probióticos IFN-alpha2b BLX-301, anti-CD20 non-Hodgkin's B-cell linfoma humanizado BLX-155, a trombolítico Los productos puede ser producidos: Puro: el ingrediente activo puede ser purificado Seco: las plantas pueden ser deshidratadas y presentadas como cápsulas, tabletas o polvo Fresco: puede ser utilizadas directamente para alimentación Sistemas de expresión integrativos Plantas transplantómicas La estrategia a elegir debe considerar las ventajas y limitaciones de cada sistema de expresión Sistemas de expresión integrativos Plantas transplastómicas (cloroplastos) • Ventajas - Niveles de expresión potencialmente altos. - Expresión estable heredable por la progenie. - Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño de la secuencia a introducir. - No hay efectos de posición (transformación por recombinación homóloga). - Ausencia de silenciamiento génico. - Introducción de policistrones. - Transferencia horizontal del transgén escasa o nula. - Formación de puentes disulfuro y menor complejidad de proteasas • Limitaciones - No existen mecanismos de glicosilación. Sistemas de expresión integrativos Plantas transplastómicas (cloroplastos) Proteínas terapeuticas y antibióticos producidas en cloroplastos 2008-2011 Sistemas de expresión integrativos Plantas transplastómicas (cloroplastos) Antígenos producidos en cloroplastos 2008-2011 Sistemas de expresión integrativos Plantas transplastómicas (cloroplastos) Limitación: altos costos de purificación de las proteínas a partir de extractos de plantas Sistemas de expresión no integrativos Vectores virales Sistemas de expresión no integrativos Vectores virales Ventajas - Niveles de expresión potencialmente altos - No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento - Corto tiempo de desarrollo y producción - Permite el direccionamiento de proteínas a compartimiento subcelulares o al espacio apoplástico. - Permite la modificación postraduccional de proteínas Limitaciones - Limitaciones en el tamaño de la secuencia introducida - Inestabilidad genética de la secuencia introducida. - Silenciamiento génico Sistemas de expresión no integrativos Vectores virales PVX 1. Infección inicial 2. Movilización viral célula a célula 3. Movilización sistémica TMV Potexvirus. Potato virus X Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor T7 Genoma viral ARN Obtención del ADNc del genoma viral completo ADNc del genoma viral ADNc Clonado del ADNc en un plásmido. Introducción de un sitio de clonado múltiple Vector viral T7 ADNc SCM Clonado del gen de interés Vector viral recombinante T7 Gen X Transcripción in vitro Infección mecánica con transcriptos de ARN Expresión transitoria Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor para expresión en plantas Genoma viral ARN Obtención del ADNc del genoma viral completo ADNc del genoma viral ADNc Amplicón viral 35SCaMV Clonado del ADNc en un vector binario para expresión en plantas. Introducción de un sitio de clonado múltiple ADNc t-nos SCM Clonado del gen de interés Amplicón viral recombinante 35SCaMV Gen X Bombardeo del ADN infectivo Agroinfiltración Agrospray Expresión transitoria t-nos Los vectores y los amplicones virales amplifican la expresión de los genes foráneos Esquema de la expresión de un gen foráneo a partir de un vector y de un amplicón viral de un virus a ARN en comparación con la expresión de un gen foráneo por expresión nuclear. Se pueden utilizar diferentes estrategias para expresar genes foráneos en vectores virales Virus representativo Reemplazo génico Inserción génica Presentación de epitopes A * B Complementación A: Fusión traduccional de una pequeña secuencia dentro del gen de la proteína de la cápside. B: Translectura traduccional de un codón de terminación ámbar (*) en el extremo 3´ Genes virales Reemplazo génico Genes foráneos Bromovirus Caulimovirus Complementación Furovirus Alfamovirus Geminivirus Caulimovirus Inserción génica Hordeivirus Dianthovirus Caulimovirus Geminivirus Presentación de epitopes Potexvirus Geminivirus Potexvirus Potexvirus Comovirus Tobamovirus Tobamovirus Potyvirus Tobamovirus Tobravirus Tobamovirus Tombusvirus Tombusvirus Tombusvirus Vectores virales de 1era y 2da generación Vectores de 1era generación o ‘’Virus completo” Infecta sistémicamente Agroinfiltración o Agrospray Bioseguridad baja Agroinfiltración por jeringa Rápida: la proteína recombinante puede obtenerse en aproximadamente una semana. Simple: sólo se requiere equipamiento básico. Flexible: puede utilizarse para producir proteínas de membrana, enzimas o virus quiméricos. Laborioso: no compatible con una producción a gran escala Vectores virales de 1era y 2da generación Vectores de 2da generación o “Virus desarmado” No infectan sistémicamente Método de inoculación: Magnifection Permite expresar transgenes de mayor tamaño Mayor estabilidad de los transgenes Bioseguridad alta Magnifection. Agroinfiltración por vacío. Rápida 6-10 días. Eficiente: 1-5 g proteína/kg hoja Escalable Complejo Se requiere equipamiento específico y standard Flexible: puede utilizarse para producir proteínas de membrana, enzimas o virus quiméricos. Companias de base biotecnológica para la producción de proteínas en plantas Icon Genetics. Alemania. Vector TMV 2da generación Magnifection Companias de base biotecnológica para la producción de proteínas en plantas Large Scale Biology Corp. EEUU. 2006 Vector TMV 1era generación Inoculación mecánica KBP 2008 Nuevas tecnologías Companias de base biotecnológica para la producción de proteínas en plantas KBP, Kentucky 2012 NUCLEAR CLOROPLASTOS VECTORES VIRALES Bajos niveles de expresión (0,01-0,1 % TPS) Altos niveles de expresión (1-10%) Altos niveles de expresión (1-10%) Largo 6-24 meses Mediano 3-12 meses Corto 1-2 semanas Efecto posicionamiento génico Si No No Estabilidad de las secuencias Alta Alta Baja Plantas en que se puede expresar Limitado a la disponibilidad de protocolos de transformación Muy limitado a la disponibilidad de protocolos de transformación Limitado al rango de hospedante Si, PTGS No Si, VIGS Si No Si Media Alta Baja Niveles de expresión Tiempo de evaluación de construcciones Silenciamiento post-transcripcional Modificaciones posttransduccionales Bioseguridad Expresión de antígenos para la producción de vacunas Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Las plantas constituyen un sistema alternativo para la producción de vacunas a subunidad Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Vacunas a subunidades: • Seguras • Poco inmunogénicas • Inyección Ventajas de las vacunas en plantas: • Bajo costo de producción. • Eliminación de la cadena de frío durante el transporte. • Expresión de múltiples antígenos y adjuvantes en un mismo sistema. • Posibilidad de inmunización oral por producción de antígenos en plantas comestibles Vacunas orales en plantas VENTAJAS •Menores requerimientos de asistencia médica para su administración. • Menor riesgo de transmisión de enfermedades asociadas a la indebida reutilización de jeringas y agujas. • Inducción de respuesta inmune a nivel sistémico y de mucosas. DESVENTAJAS •Supervivencia del antígeno en el tracto digestivo •Inducción de una respuesta inmune •Promoción de una protección adecuada • Ausencia de efectos de tolerancia • Ausencia de inmunogenicidad del vehículo vegetal Aunque originariamente se pensó en emplear el tejido vegetal sin procesar, actualmente se considera utilizar el tejido liofilizado. Esto permitiría controlar mejor la dosis ingerida y evitar efectos de tolerancia Vacunas basadas en vectores virales • Partículas virales quiméricas son potentes inmunógenos (humoral y celular) • Los agregados de proteínas virales son buenos adjuvantes • La expresión de epitopes como fusiones a las proteínas de cápside permite una abundante producción. • El proceso de purificación de las partículas virales quiméricas es un proceso simple y de alto rendimiento. • Los viriones purificados pueden ser establemente almacenados. Vacunas en fase clínica: hepatitis B Importancia epidemiólogica de la hepatitis B • Es una viremia persistente con 300 millones de portadores en el mundo. • La vacuna actual se produce en levaduras que expresan el antígeno de superficie HBsAg. Es efectiva, pero costosa, por lo que se distribuye poco en los países subdesarrollados. • Se ha reportado la expresión de HBsAg en plantas de tabaco, papa, lechuga y se encuentra en estudio su expresión en tomates y bananas. Expresión de HBsAg en tubérculos de papa. El antígeno recombinante forma estructuras vesiculares similares a las observadas en el suero de pacientes infectados con HBV. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001. Expresión de HBsAg en plantas transgénicas de Solanum tuberosum Se compararon los niveles de expresión de HBsAg del virus humano de hepatitis B en tubérculos de papa utilizando distintas construcciones genéticas. HBsAg en tubérculos HB103 P35S TEV HBsAg 0,33 µg/g NOS 3’ SEKDEL HB105 P35S TEV HBsAg NOS 3’ 1,25 µg/g NOS 3’ 0,80 µg/g VspaS HB106 P35S TEV HBsAg VspaL HBsAg 2,40 µg/g HB107 P35S TEV NOS 3’ HB104 P35S TEV HBsAg VSP 3’ 6,50 µg/g HB114 P35S TEV HBsAg Pin2 3’ 16,00 µg/g HB111 P35S Ω HBsAg NOS 3’ 0,33 µg/g Tomado de: Richter et al., Nat. Biotech., 2000. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores TEV:secuencia enhancer traduccional de Tobacco etch virus. Ω: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus. vspαS: péptido señal de la proteína VSP de soja. vspαL: señal de transporte vacuolar de la proteina VSP de soja. NOS 3’: terminador de nopalina sintetasa. VSP 3’: terminador de la proteína VSP de soja. Pin2 3’: terminador del inhibidor de proteinasa II de papa. SEKDEL : señal de retención en RE. La inmunización oral con tubérculos HB114-16 es comparable a la obtenida con la vacuna producida en levaduras Imnunización oral con rHBsAg purificado de levaduras Se suministraron 2 dosis de 150 mg de rHBsAg cada una, en las semanas 0 y 1, y una dosis de 0,5 mg en la sexta semana (dosis subinmunogénica). CT: adyuvante, toxina del cólera Se señala el título del antisuero obtenido. Línea anaranjada: control de ratones no inmunizados Inmunización oral con HBsAg Imnunización oral con HBsAg expresado en tubérculos previamente expresado en tubérculos de papa inmunizados con rHBsAg purificado de levaduras Se suministraron tres dosis orales de 5 g de tubérculos de papa transgénica (HB114-16), conteniendo un promedio de 42 mg de HBsAg cada una, antes o después de una inmunización con 0,5 mg de antígeno purificado de levaduras (rHBsAg). Se señalan los títulos de los antisueros obtenidos en cada caso. Línea anaranjada: controles de ratones alimentados con papas no transgénicas. Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001. La respuesta inmune disminuye con la eliminación del adyuvante o la cocción de los tubérculos La eliminación del adjuvante (CT: toxina colérica) en los esquemas de inmunización lleva a una fuerte disminución de la respuesta inmune La cocción previa de los tubérculos disminuye pero no elimina la respuesta inmune. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001. Inmunización oral de humanos con lechuga transgénica que produce HBsAg En 2 de los 3 voluntarios inmunizados con hojas de lechuga transgénica se detectó un título de anticuerpos anti-HBsAg protectivo luego de la segunda dosis Esquema de inmunización: Primera dosis: 200 g de hojas Segunda dosis (a las 8 semanas): 150 g de hojas Concentración del HBsAg en tejido de lechuga: 1 a 5 ng/g tejido fresco Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Kapusta et al., FASEB J., 1999. Para conferir protección en humanos deben registrarse en sangre niveles de anticuerpos anti-HBsAg de al menos 10 mUI/ml Comovirus. Cowpea mosaic virus Presentación de epitopes de Human Rhinovirus (HRV) en Cowpea mosaic virus Potexvirus. Potato virus X PVX. Producción de vacunas contra la tuberculosis Vacuna terapeutica: Producción de anticuerpos scFV para el tratamiento del linfoma non-Hodgkins-TMV vector TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors Pathogen or Disease Antigens References Insertion vectors Foot and mouth disease virus Hepatitis C virus Bovine herpes virus Colorectal cancer Human immunodeficiency virus-1 Human immunodeficiency virus-1 Dengue virus Mycobacterium bovis VP1 protein Hypervariable region I Glicoprotein D Ga733-2 antigen Tat protein p24 protein Domain III of E protein ESAT6-Ag85 antigens Wigdorovitz et la. 1999 Nemchinov et al. 2000 Perez Filgueira et al. 2003 Verch et al. 2004 Karasev et al. 2005 Perez Filgueira et al. 2004 Saejung et al. 2007 Dorokhov et al. 2007 Replacement vectors Human papilloma virus Yersinia pestis Bacillus anthracis Influenza E7 protein F1 and V proteins PA and LF domains Hemoagglutinin Massa et al. 2007 Mett et al. 2007 Chichester et al. 2007, 2009 Shoji et al. 2008, 2009 Modular vectors Yersinia pestis Smallpox virus F1 and V proteins pBS antigen domain Santi et al. 2006 Golovkin et al. 2007 Peptide display vectors Human immunodeficiency virus-1 Influenza virus Plasmodium falciparum Pseudomonas aeruginosa Canine oral papilloma virus Melanoma Mycobacterium bovis Pseudomonas aeruginosa Glicoprotein 41 HA epitope Several epitopes F protein epitopes L2 protein p15-Trp2 epitopes ESAT6-Ag85 antigens F protein epitopes Durrani et al. 1998 Sugiyama et al. 1995 Turpen et al. 1995 Staczek et al. 2000 Smith et al. 2006 Mc Cormick et al. 2006a, 2006b Dorokhov et al. 2007 Gilleland et al. 2000 Vectores basados en TMV Agrobiotecnología Vectores basados en virus vegetales TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors Vectores basados en Pathogen or Disease PVX Insertion vectors Human papilloma virus Avian Influenza A virus Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii Hepatitis B virus Transmissible gastroenteritis virus Antigens or Antibodies References E7 protein M2 protein ectodomain SAG1 protein Gra4 peptide nucleocapsid protein derivate antibody Franconi et al. 2002 Nemchinov and Natilla 2007 Clemente et al. 2005 Ferraro et al. 2008 Mechtcheriakova et al. 2006 Monger et al. 2006 capside epitopes Several epitopes E7 protein E2 glicoprotein peptides ESAT6 antigen E7 and L2 epitopes F protein epitope VP6 protein Marusic et al. 2001 Turpen et al. 1995 Franconi et al. 2002 Marconi et al. 2006 Zelada et al. 2006 Cerovská et al. 2008 Natilla et al. 2006 O' Brien et al. 2000 Peptide display vectors Agrobiotecnología Vectores basados en virus vegetales Human immunodeficiency virus-1 Plasmodium falciparum Human papilloma virus Classical Swine Fever virus Mycobacterium tuberculosis Human papilloma virus-16 Newcastle disease virus Murine rotavirus Ejemplos de antígenos expresados en plantas transgénicas Producción de anticuerpos Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores La producción de anticuerpos en plantas transgénicas permite ensamblar moléculas de Ig complejas Los genes que codifican los cuatro polipéptidos de las inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma planta por cruzamientos sucesivos entre plantas transgénicas individuales y sus descendientes recombinantes PLANTIBODIES Cadena liviana (κ) Cadena J (J) X X Cadena pesada (α) Ig monomérica (Ig) Ig dimérica (dIg) X Componente Secretorio (SC) Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Ig secretoria (sIg) Expresión del anticuerpo monoclonal anti-AgI/II en plantas de tabaco La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales agentes causales de la caries dental. El antígeno de superficie AgI/II participaría en la interacción hidrofóbica entre S. mutans y un complejo de glicoproteínas de alto peso molecular presente en la superficie dental. Estrategia: Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en Nicotiana tabacum con el fin de obtener grandes cantidades del mismo. N. tabacum que expresa las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo monoclonal anti AgI/II N. tabacum que expresa la cadena J murina Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores N. tabacum que expresa el componente secretorio de conejo Adaptado de: Ma et al., Science, 1995. Cruzamientos Se obtuvieron plantas de N. Tabacum que expresan las cuatro proteínas juntas. Estas cadenas se ensamblan para dar lugar a una inmunoglobulina secretoria funcional que reconoce al antígeno nativo AgI/II El anticuerpo anti Agl/II actuaría alterando la dinámica de repoblación de la superficie dental Luego del tratamiento con un agente antiséptico, la presencia del anticuerpo anti AgI/II evitaría la recolonización de los nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Adaptado de: www.planetbiotechnology.com CaroRxTM Planet Biotechnology La inmunización pasiva local de humanos con anti-AgI/II producido en plantas otorga protección contra S. mutants Recolonización de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos previamente tratados con gluconato de clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral Tomado de: Ma. et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com • Protocolo de inmunización: Aplicación directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de tabaco (SIgA/G, línea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se realizaron controles con solución salina (línea verde claro), con un anticuerpo bovino no relacionado producido en plantas (línea azul) y con el anticuerpos murino (Guy’s 13, línea verde oscuro). n: número de voluntarios RinoRxTM = Fusión ICAM-q a IgA Tratamiento preventivo de la gripe causada por Rhinovirus DoroRxTM IgA monoclonal contra dorocina Tratamiento de efectos secundarios de la quimioterapia con dorocina Expresión de proteínas heterooligoméricas por coexpresión de vectores no competitivos Expresión de anticuerpo moconoclonal A5 por coexpresión TMV y PVX Expresión de HC y LC del A5 mAB Purificación de mAb por A-Sefarosa PAGE TMV-LC No desnaturalizante + PVX-HC SDS-PAGE TMV-HC + PVX-LC Westen blot Producción de proteínas de interés farmacológico y medicinal Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Producción de Galactosidasa A humana- Enfermedad de Fabry TMV vector-Geneware system Enfermedad de Fabry = deficiencia de la enzima alfa-galactosidasa A 1: 60000 hombres-ligada a cromosoma X Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system Rápida optimización de la expresión del gen que codifica la GalA Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system Control de calidad del la enzima GalA producida •Pureza por SDS-PAGE •Determinacion del amino-terminal y la secuencia completa por Madi-tof •Esterilidad •Endotoxina •ADN residual •Impurezas residuales de la planta •Concentración proteica •Actividad específica Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system Modelo de enfermedad = ratón knockout GalA Acumula lípido GB3 en varios órganos Medición de la eficacia de la enzima GalA producida • Medición de la acumulación de GB3 en ratones wt y en ratones knockout GalA • Clearance plasmático • Organo blanco Producción de factor de crecimiento epidérmico humano en plantas de tabaco Construcciones usadas para transformar Nicotiana tabacum: Versiones citoplasmáticas P 35S CaMV hEGF tNOS P 35S (L) CaMV Ω hEGF tNOS p35(L)EGF hEGF tNOS p35(L)APEGF Versión P 35S (L) CaMV Ω apoplástica ss p35EGF Cuantificación por ELISA de los niveles de hEGF expresado en plantas transgénicas 104 103 0,11% proteína total soluble (33 µg/g de hoja) 102 10 Agrobiotecnología 1 Las plantas como biorreactores Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004. El hEGF producido en tabaco es biológicamente activo Ensayo de expansión de células del cumulus de ovocitos bovinos Control hEGF st10ng Planta no tranformada Extracto 35S (L) AP EGF (10ng por ELISA) Extracto planta infectada PVX control Extracto planta infectada con PVXAPEGF Ensayo de unión a radioreceptor Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004. Proteínas terapeuticas producidas en plantas en el mercado o fase clínica Otras aplicaciones: producción de enzimas de interés industrial, suplementos alimenticios y biopolímeros Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores La avidina de pollo fue la primera proteína recombinante comercializada obtenida en plantas Construcción usada para transformar plantas de maíz: Pr Ubiquitina Intron Ubi α-amilasa ss avidina Pin II 3’ El uso de codones de la secuencia señal de la α-amilasa de cebada y de la secuencia codificante de la avidina de pollo se optimizó para su expresión en plantas de maíz. • El nivel de expresión de la avidina extraída de semillas de maíz fue 2,3% de la proteína total extraída (230 mg/Kg de semillas) Grano de maíz transgénico incubado con un anticuerpo antiavidina. La interacción se evidencia por una reacción colorimétrica. Notar la alta concentración de avidina en el embrión (E). En: endosperma Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997. Características de la avidina producida en maíz Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la estabilidad de la avidina expresada en semillas de maíz Características físicas de la avidina recombinante producida en maíz Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de : Hood et al, Mol. Breed. 1997. Producción de brazzeína en plantas de maíz Las proteínas edulcorantes tienen gran demanda para productos dietéticos y para enfermos de diabetes. La brazzeina es una proteína producida por la planta africana Pentadiplandra brazzeana que posee un poder edulcorante 1.200 veces más alto que el azúcar. Su producción en la planta nativa es impráctica debido a los altos volúmenes de producción requeridos. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Se transformaron plantas de maíz con dos variantes de la secuencia de brazzeína y se la expresó en las semillas a nivel del embrión y del endosperma. Se obtuvieron niveles de acumulación en semilla de hasta 4% de la PST. Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005. Constitutive w/ intron: promotor de tipo poliubiquitina Embryo-preferred: promotor de globulina 1 de maíz Endosperm-preferred: promotor de α-zeína de 22kD BAASS: secuencia señal de la α-amilasa de cebada Pin II: Terminador del inhibidor de proteasas II de Solanum tuberosum TEV y MDMV: enhancers traduccionales de Tobacco etch virus y Maize dwarf mosaic virus Expresión promotor embrión + secreción es màs eficiente * Brazzeína (% (% PST) PST) Producción de brazzeína en plantas de maíz Expresión embrión + citoplasma ineficiente * * * Las plantas como biorreactores * µg ( Agrobiotecnología Brazzeína (µ µg/g de peso seco) Construcción genética Maíz entero Grano entero Grano molido endosperma embrión Germen pericarpio Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005. Niveles de expresión de brazzaína en semillas T1 para los mejores transformantes obtenidos con las construcciones 1-8 detalladas en la transparencia anterior Contenido de brazzeína en fracciones obtenidas por molienda seca de las semillas de la línea 5 (promotor para embrión). Producción de brazzeína en plantas de maíz Extracción a pH 4 Tratamiento de calor Esquema de los pasos de purificación seguidos para el aislamiento de brazzeína expresada en maíz (maíz transformado con la construcción 5). Intercambio catiónico Filtración en geles Desalado Freeze Drying Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Muestras tomadas en los distintos pasos de purificación analizadas por PAGE-SDS. Las proteínas fueron visualizadas por tinción con Comassie Blue. Se embraron 5 µg en todos los casos. 1: extracto crudo; 2: extracto calentado y filtrado; 3: fracción pico de la cromatografía de intercambio catiónico; 4: fracción pico de la cromatografía de tamaño de exclusión. Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005. Síntesis de plásticos biodegradables en plantas Envases de shampoo hechos de un copolímero de polihidroxibutirato y polihidroxivalerato a 0, 3 y 9 meses de permanecer en compost. Producción de PHB en plantas por transferencia de la vía metabólica bacteriana • El polihidroxibutirato o PHB constituye una fuente . renovable de material termoplástico biodegradable. • En Alcaligenes eutrophus la síntesis a partir de acetil CoA . ocurre en tres pasos catalizados por distintas enzimas. O Acetil-CoA C H3C S H3C 3-cetotiolasa (phbA) O O C CoA C S CH2 OH O C C CoA Acetoacetil-CoA-reductasa (phbB) S CH2 H3C Ruta bioquímica de la síntesis de PHB en bacterias CoA PHB sintasa (phbC) Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores CH2 O CH3 O CH3 C CH C CH O O CH2 n PHB Las plantas de A. thaliana transformadas con los genes phbA, phbB y phbC acumulan gránulos de PHB en los cloroplastos • La vía completa de síntesis de PHB en Arabidopsis thaliana se obtuvo por transformación con los genes phbA, phbB y phbC de Ralstonia eutropha. • Las tres enzimas se fusionaron a péptidos de tránsito a cloroplastos para lograr su acumulación en estas organelas. Esto se hizo porque los niveles de acetil-CoA son mucho más altos en los plástidos que en el citoplasma. p35S TPSS phbB NOS 3’ p35S TPSS phbA NOS 3’ p35S TPSS phbC NOS 3’ phbABC Microscopia electrónica de una célula del mesófilo de una hoja madura de una línea de A. thaliana que expresa las enzimas responsables de la síntesis de PHB. Se muestra un cloroplasto conteniendo gránulos de PHB. Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000. Producción a-amilasa en semilla de maíz para bioetanol 2011 Usda-Aphis aprueba Enogen-Syngenta Enzimas industriales Avidina: kit de diagnóstico β-glucuronidasa: kit de diagnóstico Trypsin: wound care Celulasa: producción de etanol Xilanasa: procesamiento de biomasa Fitasa: procesamiento de alimentos (1-3)(1-4)β-glucanasa: Brewing Lignin peroxidasa: Paper manufacture Biopolímeros proteínas de la seda de araña polipéptidos tipo elastina colágeno Companias que utilizan tecnologías para la producción de proteínas en plantas Tomado de: Biotecnologìa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010 Tomado de: Biotecnologìa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010 Aspectos de bioseguridad • Bioseguridad: En el caso de producción de proteínas terapéuticas o con actividad biológica, se deben establecer condiciones de bioseguridad aún más estrictas que las adoptadas para otros OGMs, ya que éstas no deben ingresar bajo ningún punto de vista a la cadena alimentaria humana. • Riesgos y desventajas para la producciòn de medicamentos en plantas Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores Dispersión de los transgenes por polen, semilla o frutos Riesgo de contaminación de la cadena alimentaria; Impacto en especies no blanco: pájaros, mariposas, insectos etc. Reproducibilidad en proceso de purificaciòn Uso inapropiado de los productos derivados de OGM Temas regulatorios complejos Aspectos de bioseguridad • Algunas recomendaciones para la contenciòn biològica: - Utilizar sistemas cerrados para el crecimiento de plantas. - Utilizar cultivos que no participen de las cadenas alimentarias humana o animal. - Utilizar cultivos de estructura floral cerrada (autopolinización). Agrobiotecnología Las plantas como biorreactores - Tener en cuenta el aislamiento temporal (época de polinización diferente en cultivos relacionados) y espacial (barreras de cultivos no transgénicos). - Si la expresión es en hojas, cosechar las plantas antes de la floración.
