Clase 5 Transformacion de cloroplastos AGBT2015.pdf

AGROBIOTECNOLOGIA
CURSO 2016
TRANSFORMACION DE CLOROPLASTOS
FERNANDO BRAVO ALMONACID
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
-
Sumario
Estructura y genética del cloroplasto
Ingeniería genética en cloroplastos
- Métodos de transformación
- Vectores
- Sistemas de selección
Ejemplos de genes expresados en cloroplastos
Otras aplicaciones de la transformación de
cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
Referencias
Estructura y genética del cloroplasto
Transformación
de cloroplastos
La teoría de la endosimbiosis explica el origen de los plástidos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Endosimbiosis secundaria
Placida dendritica
Ciertos protistas, como Placida
dendritica y Elysia chlorotica,
capturan plástidos de las algas
y los mantienen fotosintéticamente
activos durante meses.
Elysia chlorotica
A partir de los proplástidos se diferencian
plástidos con funciones específicas
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del cloroplasto
núcleo
Espacio
apoplástico
vacuola
cloroplasto
pared
citosol
Microscopía de una célula vegetal
Microscopía de un cloroplasto
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Los genomas
plastídico
y nuclear de
Arabidopsis
thaliana
contienen
genes
de origen
bacteriano
Las líneas en verde
muestran las
proteínas de origen
procariota.
Las líneas rojas
muestran el destino
de las proteínas
codificada en el
núcleo. Los números
entre paréntesis en
negro indican el
número total de
proteínas con un
determinado destino
y en verde las de
origen procariota.
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Leister, Trends in Genetics, 2003.
Las proteínas
plastídicas se
sintetizan en
el propio
plástido
o son
importadas
desde
el citoplasma
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Mecanismos de importación de proteínas al cloroplasto
Una vez en el interior
del cloroplasto,
las proteínas pueden
tener tres destinos
diferentes:
- Estroma
- Membrana tilacoidea
- Lumen
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del genoma plastídico
• Es un genoma circular
de ~120 a 160 Kb.
• Tiene alrededor de 150
genes codificados
en ambas cadenas.
• Los genes pueden
clasificarse en dos grupos:
- Genes involucrados
en la fotosíntesis
- Genes involucrados
en los procesos
de replicación, transcripción
y traducción
• Posee genes organizados
en operones.
Tomados de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Organización de los
genomas plastídicos de
distintas especies
vegetales
Flujo de la información genética en el cloroplasto
El genoma plastídico codifica mensajeros monocistrónicos o policistrónicos.
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Los genes platídicos son transcriptos por dos tipos de polimerasas: una monomérica
codificada por el genoma nuclear, y una multimérica codificada por el genoma plastídico.
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Flujo de la información genética en el cloroplasto
Los ARNm generados
en el cloroplasto
presentan estructura
con forma de horquila
en el extremo 3’.
En los ARNm del
cloroplasto existen
secuencias
reconocidas por
los ribosomas que
favorecen la iniciación
de la traducción;
este reconocimiento
depende de las
secuencias que
flanquean al sitio
de reconocimiento
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles
Regulación
de la síntesis
proteica en el
cloroplasto
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Regulación de la síntesis proteica en el cloroplasto
Ambiente reductor [ADP] baja
Ambiente oxidante [ADP] alta
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Ingeniería genética en cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
El genoma
plastídico
se puede
transformar por
recombinación
homóloga
ADN pt
Gen A
Gen B
Gen B
Gen C
aadA
Gen D
Gen C
Vector de transformación
ADN pt transformado
Transformación
de cloroplastos
Gen A
Gen B
aadA
Gen C
Gen D
Métodos de
transformación:
biobalística
Transformación
de cloroplastos
Cañón génico
comercial
(izquierda) y
detalles del
dispositivo de
impulsión de los
microproyectiles
(abajo)
Métodos de
transformación:
transformación
de protoplastos
Transformación
de cloroplastos
Se obtiene
homoplastía
por sucesivas
rondas de
regeneración
en medio de
selección
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Bock, JMB, 2001.
Heteroplastía
a homoplastía
Transformación
de cloroplastos
La homoplastía se obtiene por sucesivas rondas
de regeneración en medio de selección
Primera ronda de regeneración
Control de regeneración
Control de selección
Transformación
Segunda ronda de regeneración
Planta
transplastómica
Especies vegetales en que se logró
la transformación de plástidos
Especie
Explanto utilizado y Método
de transformación
Agente de selección
Lechuga
Biobalística
Espectinomicina
Tomate
Biobalística
Espectinomicina
Plantas regeneradas mediante organogénesis a partir de hojas
Tabaco
Papa
Petunia
Álamo
Biobalística
Biobalística
Biobalística
Biobalística
Plantas regeneradas mediante embriogénesis
Zanahoria
Suspensión celular Biobalística
Soja
Callos embriogénicos Biobalística
Algodón
Arroz
Espectinomicina
Espectinomicina
Espectinomicina
Espectinomicina
Espectinomicina
Callos friables Biobalística
Kanamicina
Callos obtenidos a partir de
semillas maduras Biobalística
Estreptomicina
Espectinomicina
Especies vegetales en que se logró
la transformación de plástidos
Especies
Método
Resultado
Arabidopsis
Biobalística
Homoplasmía
Zanahoria
Biobalística
Transitorio
Nicotiana plumbaginifolia
Protoplastos
Transitorio y homoplasmía
Tabaco (suspensión celular)
Biobalística
Transitorio
Caléndula
Biobalística
Transitorio
Papa
Biobalística
Transitorio y homoplasmía
Pimiento
Biobalística
Transitorio
Arroz
Biobalística
Heteroplasmía
Tomate
Biobalística
Homoplasmía
Tabaco (Petit Havana, Xanthi)
Biobalística y protoplastos
Homoplasmía
Nabo
Biobalística
Heteroplasmía
Adaptado de: Maliga, Ann.Rev.Plant Biol., 2004.
Diseño de vectores para la transformación de cloroplastos
Vector de clonado procariota
Diseños opcionales:
Genes selectores usados en la transformación de plástidos
Genes selectores: betaína aldehido deshidrogenasa
betaína aldehido
a
Control
b
1o selección
BADH
c
2o selección
espectinomicina
glicinabetaína
d
f
e
Control
1o selección
2o selección
betaína aldehido
- La actividad enzimática de BADH
es dosada por formación de NADH.
- Y, D, M y O representan las hojas
jóvenes, en desarrollo, maduras
y viejas, respectivamente.
Tomados de: :Daniell et al., Curr. Genet., 2001.
Genes
selectores:
aminoglicósidofosfotransferasa
(aphA-6)
Selección y análisis de plantas
transplastómicas resistentes a kanamicina
100
75
50
Colonias derivadas de protoplastos
en distintas concentraciones de
kanamicina (mg/L) .
0
Transformación
de cloroplastos
25
10
0
25
Selección no estricta
(5 semanas de cultivo
en kanamicina 25 mg/L).
Selección estricta
(5 semanas de cultivo
en kanamicina 50 mg/L).
Tomado de: Huang et al., Mol. Genet. Genomics, 2002.
- Kan
200
200
Control no
transgénico
Control no
transgénico
plCF637
plCF637
plCF6061
Explantos luego de 4 semanas de cultivo en
distintas concentraciones de kanamicina (mg/L).
plCF599
Progenie T1 creciendo en ausencia
o presencia de kanamicina (mg/L).
Selección
fenotípica por
restauración
de la
pigmentación y
la fotosíntesis
Brote reconstituído
(verde) obtenido de hoja
de DrpoA bombardeada.
Planta mutante DrpoA
empleada para
transformación.
Estrategia:
Transformación
de cloroplastos
Reconstituir el fenotipo fotosintético
en plantas mutantes deficientes en
fotosíntesis (DpetA, Dycf3 y DrpoA)
por transformación de cloroplastos
(selección fenotípica).
Tomado de: Klaus et al., The Plant Journal, 2003.
Planta DrpoA reconstituída
fenotípicamente normal.
Eliminación
de genes
selectores por
recombinación
Deleciones observadas
P1
P1 y T1:
secuencias
cortas repetidas
directas
s1: selección con
espectinomicina
s2: selección con
glufosinato
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.
Eliminación de genes selectores mediante el sistema cre/loxP
replicación
+
recombinación
+
recombinación
asistida por Cre
Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.
Características comparadas de los sistemas
de transformación nuclear y plastídica
Genomas
Número de copias
Niveles de expresión
Genes y expresión
Efectos de posición
Silenciamiento génico
Transferencia horizontal
Plegamiento y formación
de puentes disulfuro
Glicosilación
Plastídico
Nuclear
~10.000/célula
Pocas copias
Altos
Entre el 2-7% (hasta 47%)
Por lo general bajos
Entre 0,001-0,1%
Inserción en sitio conocido
elimina este problema
Inserción al azar
(expresión variable)
Operones
Monocistrónicos
No se ha reportado
TGS y PTGS afectan
la expresión
Herencia materna
Sí
Correcto
Correcto
(pasando por retículo
endoplasmático)
NO
SI
Aplicaciones / Genes expresados
Transformación
de cloroplastos
Aplicaciones biotecnológicas
de la transformación de cloroplastos
La transformación
de cloroplastos
permite
sobrexpresar
y simplificar
la purificación
de albúmina
sérica humana
Albúmina sérica humana (HSA)
- Constituye el 60% de la proteína total en el suero.
- Es la proteína intravenosa más usada para reemplazar volúmen
sanguíneo en situaciones de trauma.
- Actualmente es obtenida de la sangre.
- Se expresó en sistemas microbianos y en plantas transgénicas
(transformación nuclear) y se obtuvieron muy bajos niveles proteicos.
- La HSA es muy susceptible a la degradación proteolítica en los sistemas
recombinantes y su purificación es muy costosa.
16S
trnI
trnA
23S
Prrn
Construcciones empleadas
para transformar cloroplastos
de Nicotiana tabacum.
Prrn
Transformación
de cloroplastos
aadA
ó
aadA
Prrn
SD
HSA
3´psbA
HSA
P5´UTR psbA
3´psbA
Análisis de la expresión de HSA en plantas transgénicas
Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos
Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos
luego de exposición diferencial a la luz (pLDApsbAHSA)
Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003.
Análisis de la acumulación de HSA en cuerpos de inclusión
Micrografías electrónicas de tejidos
(hojas maduras) marcados con anticuerpos
anti-HSA conjugados con oro.
A: control no transformado
B-D: hojas de plantas transformadas
con pLDApsbAHSA.
A
B
A pesar de los altos niveles de
expresión las plantas
transgénicas mostraron un
fenotipo normal.
1 y 2: plantas no transformadas.
3: pLDAsdHSA
4: pLDApsbAHSA.
Extracción de HSA de cuerpos de inclusión
66 KDa
45 KDa
pLDApsbAHSA
pzrcialmente
parcialmente
purificado
pLDApsbAHSA
purificado
pLDApsbAHSA
al comienzo
40 ng HSA
control
pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA
97 KDa
97 KDa
Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003
control
D
MM
C
500 ng HSA
Fracción Precipitado
soluble solubilizado
control
Durante el proceso
de solubilización
66 KDa
HSA
LSU
Inmunodetección de HSA en
extractos vegetales
SDS-Page
revelado con plata
Producción de hormona de crecimiento humana (hGH)
en cloroplastos de tabaco
Expresión de los genes quiméricos hGH
en plantas transgénicas
Plásmido
Localización
del gen
Localización
de la proteína
Wrg4747
Núcleo
Cloroplasto
Wrg4838
Cloroplasto
Cloroplasto
pMON38794
Cloroplasto
Cloroplasto
Wrg4776
pMON38755
Tomados de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.
Núcleo
Cloroplasto
Concentración de
proteína
expresada (% pts)
ND - 0,025 a
RE
0,004 - 0,008 a
Cloroplasto
1,0 b
0,2 a
7,0 b
Producción
de hormona
de crecimiento
humana (hGH)
en cloroplastos
de tabaco
Transformación
de cloroplastos
Herencia materna de los transgenes plastídicos
Tomado de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.
NT: no transgénico Nt-4838: planta transplastómica expresando hGH
♀: planta receptora ♂: planta donora de polen
Expresión
plastídica
de un péptido
antimicrobiano
para el control
de bacterias
y hongos
fitopatógenos
• Péptidos antimicrobianos
- Son péptidos con estructuras a-hélice componentes del
sistema de defensa innato de los animales.
- Participan en el control de la flora bacteriana normal
y en la defensa contra patógenos.
- Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos,
células de mamíferos).
- El péptido MS1-99 es un análogo de la magainina-2
secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.
• La acción de los péptidos antimicrobianos es concentracióndependiente. Los cloroplastos son un sistema atractivo para
lograr altos niveles de acumulación.
Construcción empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum
trnI
Transformación
de cloroplastos
16SrDNA
trnV
MS1-99
Prrn
Orf131
Orf70B
aadA
TpsbA
rps12
Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos de actividad antibacteriana
in vitro de extractos vegetales sobre
Pseudomonas syringae pv tabaci
Resistencia in planta a
Pseudomonas syringae pv tabaci
TransgénicaT0
Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.
Se cuantificó por DO el crecimiento bacteriano
T1 y T2: generaciones de plantas transgénicas
10A, 11A y 13A: líneas de plantas transgénicas.
No transformada
Se inocularon las hojas con distinto número
de células de Pseudomanas syringae pv tabaci;
se evaluaron los síntomas a los 5 días.
Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos in vitro de actividad
antifúngica de extractos vegetales
Resistencia antifúngica in planta
No transformada
Transgénica
Se inocularon las hojas con Colletotrichum destructivum
y se observó la aparición de lesiones. Las plantas controles
desarrollaron lesiones entre 48-72 h post-inoculación,
mientras que las transformadas no desarrollaron lesiones
aún después de una semana.
Resultados:
Inhibición de conidios germinados
UFC: unidades formadoras de colonias.
- 96% de inhibición de Pseudomonas syringae pv tabaci.
- >95% de inhibición de las especies fúngicas
- Ausencia de lesiones antracosas frente a Colletotrichum
destructivum.
- Ausencia de anomalías en plantas transgénicas
Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.
La expresión de toxina Cry de Bacillus thurigiensis
en cloroplastos confiere amplia resistencia contra insectos
• Proteínas Cry de Bacillus thuringiensis
- Poseen potente actividad insecticida contra
insectos lepidópteros, dípteros y coleópteros.
• La transformación de cloroplastos podría
ser un sistema apropiado para acumular
altos niveles de la -entomotoxina Cry
debido al origen procariota del gen.
Resultados:
Se obtuvieron altos niveles de expresión
de la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso
total soluble) asociados a una alta tasa de
mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens,
Helicoverpa zea y Spodoptera exigua en los
ensayos de infestación.
Tomado de: Kota et al., PNAS U.S.A., 1999.
La expresión del operón Cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis
en cloroplastos induce la formación de cristales insecticidas
Cuantificación de la
proteína Cry2Aa2 por
ELISA
- El gen cry2Aa2 es uno de los tres
marcos abiertos de lectura del operón
cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis.
- El ORF2 codifica una chaperona
que guía el plegamiento de Cry2Aa2.
- Se expresaron policistrones
conteniendo estos genes en
cloroplastos para aumentar la
acumulación de entomotoxina.
Cristales de Cry2Aa2
en cloroplastos
Tomado de: De Cosa et al., Nature Biotechnology, 2000.
Construcción empleada para transformar
cloroplastos de Nicotiana tabacum
16S
trnI
aadA
Prrn
trnA
orf1 orf2
- Expresión de Cry: 45,3% de PTS (hojas
maduras y hojas viejas).
cry2Aa2
Operón cry2Aa2
Resultados:
TpsbA
- Provocó una mortandad del 100% en insectos
normalmente difíciles de controlar.
Transformación genética estable de cromoplastos de
tomate con el gen selector aad-A
Construcción empleada para transformar
cloroplastos de Lycopersicum esculentum
psaB
rps14
trnfM
trnG
ycf9
B
A
trnS
aadA
Prrn
TpsbA
Acumulación de aadA en hojas, frutos verdes y rojos
(maduros) de plantas transplastómicas de tomate
Frutos
dilución
1:8
Propagación de líneas
de tomate resistentes a
espectinomicina
D
C
Le-aadA
rojos
Le control
1:4
Le-aadA
1:2
Le control
Le-aadA
Le-aadA
verdes
Le-aadA
Le-aadA
Le control
Nt iycf9
Nt control
Hojas
Selección primaria de
callos de tomate
resistentes a
espectinomicina
Regeneración de plantas
a partir de callos
transplastómicos
homoplásticos
Enraizamiento de
brotes de tomate
transplastómicos
Tomado de: Ruf et al., Nature Biotechnology, 2001.
Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)
1
ss
22
D. extracelular
971
hEGF
53
1033 1053
1023
Tr
hEGF maduro: 6,2 Kda
D. citoplasmático
1207
N-glic.
pre-pro-hEGF
(114 Kda)
•Une a un receptor tirosina-quinasa presente
en casi todos los tipos celulares.
•Factor mitogénico. Interviene en el
desarrollo, diferencianción, reparación y
protección de tejidos epiteliales.
Puentes -SH
Tratamiento de heridas y quemaduras
Agente reparador en transplantes de córnea
Tratamiento de úlceras gástricas y otras
afecciones gastrointestinales
Construcción del vector:
clonado de las secuencias flanqueantes
Sitio de inserción
Secuencias flanqueantes
Nicotiana tabacum
cloroplasto
155.393 pb
Procesamiento y splicing del operon de los ARN ribosomales
Plásmidos para la transformación de
cloroplastos de tabaco
Sac II
Sac II
16S
Prrn
aadA
pBSWGUS
(8163 pb)
trnA
Sac I
trnI
Prrn
16S
RBS
Nde I
uidA
Trps16
Xba I
5’ UTR
(psbA)
pBSWUTRGUS
(8357 pb)
trnA
Sac I
trnI
aadA
5’ UTR
Nde I
uidA
Trps16
Xba I
Análisis de las plantas: PCR
Verificación de la homoplastía por Southern blot
pBSWUTREGF
Niveles de expresión :Coomasie
M
WT
Nu
R1
GUS
R3
R5
P1GUS
R1
BSA
0,1
SUBUNIDAD
MAYOR
RUBISCO
20 ug de proteínas totales de hojas de tabaco
1
2 ug
Virus de la
fiebre aftosa
Virus de la
fiebre aftosa
Caracterización molecular de las plantas VP-βGUS
Northern blot
Southern blot
<
<
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Virus de la
fiebre aftosa
Expresion de VP-βGUS en las plantas transplastómicas
Coomasie
Western blot
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Virus de la
fiebre aftosa
Cuantificación de la expresión
VP- βGUS
Rubisco L
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Virus de la
fiebre aftosa
Fenotipo de las plantas VP-βGUS
<
<
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Virus de la
fiebre aftosa
vacuna VFA
Inmunización
wild-type
transplastómica
VP-βGUS
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Virus de la
fiebre aftosa
Análisis de los sueros
transplastómica
VP-βGUS
control
p135-160
Tomado de Lentz et al Planta 2010
Rotavirus
bovino
Responsable del 60% de las
Gastroenteritis de bovinos
Genoma mulipartito (11dsRNA)
VP5*
VP8*
Rotavirus
bovino
VP8*
Inmunización y
desafío
Anticuerpos en las hembras
Protección de
los lactantes
Otras aplicaciones de la transformación
de cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
RESISTENCIA A PATOGENOS
Transformación de plástidos de tabaco con genes antimicrobianos
Construcciones utilizadas
Ensayos en invernáculo con Rizoctonia solani
wt
gluc
GUS
AP+Gluc7
AP+Gluc2
Ensayos a campo (condiciones infección naturales) con Phytophthora
parasitica var. nicotianae y Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina
Monitoreo visual de la
enfermedad
Rhizoctonia solani
Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina
Phytophthora parasitica
var. nicotianae
Biomasa del patógeno
qPCR
Rhizoctonia solani
Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina
Phytophthora parasitica
var. nicotianae
AP15
Glu4
Glu7
Der21
AP/Glu6 AP/Glu2 AP/Glu7 Der/Glu5 Gus
PH/WT
María Eugenia Segretin
Mauro Miguel Morgenfeld
Ezequiel Matías Lentz
Federico Alfano
Sonia Wirth
Noelia Boccardo
Federico Mirkin
Fernando Bravo Almonacid
INGEBI-CONICET
María
María José
José Dus
Dus Santos
Santos
Marina
Valeria
Moz
Marina Mozgovoj
Demian
Demian Bellido
Bellido
Andrés Wigdorovitz
Wigdorovitz
Andrés
Ingrid Hernández
Osmany Chacón
Yunior López
Orlando Borrás-Hidalgo
INTA-CASTELAR
INTA-CASTELAR
Instituto
Instituto de
de Virología
Virología
CIGB-HABANA-CUBA
CIGB