MANTENIMIENTO CELULAR Una de las principales características de una célula viva es su capacidad de multiplicarse y ésta fue muchas veces el criterio para decidir si el microorganismo estaba vivo o no. Los primeros trabajos realizados sobre cultivos de microorganismos se llevaron a cabo en sistemas batch en los cuales la población crece durante gran parte del cultivo a su máxima velocidad y en un ambiente que cambia permanentemente. Bajo estas condiciones y en presencia de una única fuente de C y energía los microorganismos toman dicha fuente de C a una velocidad que es proporcional a la de crecimiento : qs 1 Yx / s (1) Sin embargo estudios posteriores realizados en sistemas de cultivo continuo permitieron establecer dos aspectos importantes respecto a la ecuación (1). En primer lugar se observó que Yx/s es constante con una única fuente de C y energía y creciendo a fija, utilizando distintos sustratos y distintos microorganismos, pero varía con las condiciones del entorno y con , de modo que no es un parámetro realmente constante. En segundo lugar según la ecuación (1) una gráfica de qs Vs debería resultar una recta que pasara por el origen, de modo que qs debería ser igual a 0 cuando = 0. Sin embargo en la gráfica como puede verse en la Fig. 1 el valor de la extrapolación de qs para =0 es distinto de 0. qs Vs. D g sust/g biom/h 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 D (h'1) Fig. 1 El consumo de sustrato observado cuando la velocidad de crecimiento es nula representaría la fracción de la fuente de C y energía destinada a producir energía no asociada al crecimiento. La misma representa el consumo de sustrato que no redunda en un aumento de biomasa sino en el mantenimiento de otras funciones vitales. Según Fig. (1) qs podría entonces expresarse como: qs qcrecimiento qmantenimiento (2) 1 qs Y x / s ms x (3) donde, Y’x/s = rendimiento teórico ms = coeficiente de mantenimiento celular, [g sustrato/g biomasa/h] Los destinos de esta energía de mantenimiento constituyen: el recambio de ARN (se recambia hasta 4 veces en un t g) recambio de enzimas, proteínas, componentes de pared celular, transporte de iones, mantenimiento de gradientes de concentración (pH o presión osmótica), movilidad, etc. Dividiendo la ec. (3) por se obtiene 1 1 ms + Yx / s Y x / s (4) donde Yx/s es el valor del rendimiento medido experimentalmente. De modo que una gráfica de 1/Yx/s Vs. 1/ (1/D en sistemas de cultivo continuo) debería dar una línea recta de pendiente ms y ordenada al origen 1/Y’x/s. Esta es la ecuación conocida como “Ecuación de Pirt”, que fue el primero en proponer el uso de la doble recíproca para el cálculo del mantenimiento celular. En bibliografía a Y’x/s suele llamársele “rendimiento verdadero o máximo”, sin embargo es importante señalar, que tanto Y’x/s como ms son esencialmente constantes matemáticas derivadas de un modelo, por lo que es más conveniente la utilización del término “rendimiento teórico” ya que resulta menos ambiguo ya que el único rendimiento “verdadero” es aquel que se mide experimentalmente. También debemos tener en cuenta que aún, a pesar que se observe una relación lineal de 1/Yx/s Vs. 1/D que indicaría que el rendimiento es una constante a lo largo del cultivo, y que el crecimiento es igualmente eficiente para todas las , no significa que esto resulte fisiológicamente cierto. Es sabido que tanto la composición de las células, como el metabolismo, y el mantenimiento celular se modifica con la velocidad de crecimiento. De modo que, si bien la ecuación (2) formalmente es correcta y se utiliza para cálculos a nivel tecnológico de Y’ x/s y ms, no resulta una acertada interpretación en términos fisiológicos. El crecimiento microbiano involucra el consumo y la transformación química de unos pocos compuestos y elementos. La energía para este proceso proviene principalmente de la oxidación de la fuente de C y energía. Si consideramos entonces, el rendimiento en el contexto del metabolismo principalmente de la fuente de C, los procesos involucrados en la conversión en biomasa podrían esquematizarse del siguiente modo: 2 O2 H2O poder reductor ATP Otras funciones Fte. de C y Energ esqueletos carbonados polímeros biomasa fte. N sales vitaminas, etc. El ATP representado en el esquema de la Fig. (2) es el proveniente tanto de las reacciones de fosforilación a nivel de sustrato, como de la fosforilación oxidativa (cadena respiratoria). Este esquema sugiere que la fuente de C y energía que entra a la célula es catabolizada para producir poder reductor y esqueletos carbonados (metabolitos intermediarios). Una porción de los equivalentes de reducción es oxidado por los componentes de la cadena respiratoria resultando la síntesis de ATP, y parte de éste junto con otra fracción de poder reductor, es utilizado para convertir los metabolitos intermediarios en polímeros y biomasa. Otra fracción del ATP formado es destinado a otras funciones vitales. Este modelo demuestra también que solo cuatro componentes medibles experimentalmente están asociados a la formación de energía que son: la fuente de C y energía, el O2, el ATP y el CO2. De modo que existen tres sustratos a los cuales es posible aplicarles las ecuaciones (3) y (4): rs = rx ms X Y x / s rO2 = rATP = rCO2 = rx + mo X Y x / o rx Y x / ATP rx Y x / CO2 (5) (6) mATP X (7) + mCO2 X (8) Debemos recalcar que la ec. de Pirt no es válida para representar la velocidad de consumo de la fuente de Nitrógeno u otros sustratos distintos a los tres arriba mencionados. En estos casos la velocidad de consumo estará representada por la ec. (1). Teniendo en cuenta el balance energético y la ecuación de Pirt es 3 posible obtener una expresión de ms en función de mo. mo = ms s 4 (9) Hasta el momento hemos considerado el crecimiento de microorganismos en aerobiosis y hemos despreciado la formación de productos. Los productos que pueden formarse pueden ser clasificados en (a) los que se encuentran asociados a la formación de biomasa, es decir son productos finales del catabolismo o metabolismo energético y (b) aquellos que no están asociados al crecimiento. Los productos del tipo (a) (generalmente producidos en anaerobiosis) no requieren gastos extras de consumo de sustrato para la formación del producto, por lo que la ecuación de Pirt sigue siendo válida. Para los productos del tipo (b) (producidos por lo general en aerobiosis) la ec. (3) debe ser corregida: rs = rx rp + + ms X Y x / s Y p / s (10) donde Y´p/s es el rendimiento teórico para la formación de producto. Son los g producto / g sustrato consumido, si todo el sustrato se transforma en producto. Factores que afectan el mantenimiento celular El valor del mantenimiento celular depende del microorganismo utilizado y puede ser modificado por factores del entorno como, pH, fuerza iónica, temperatura. En la Tabla 1 se encuentran algunos ejemplos de cómo varía el mantenimiento celular con algunos parámetros del entorno. Como se mencionó anteriormente, si bien m s se considera desde el punto de vista tecnológico como un parámetro constante, es importante señalar que desde el punto de vista fisiológico no es así, ya que varía con la velocidad de crecimiento. Despejando y´x/s de la ec. (4), se obtiene: yx / s = y´x/s + y x / s + ms y x / s Es importante observar que el mantenimiento celular se hace importante a velocidades espec. de crecimiento bajas. Es decir que la fracción de fte de C y E destinada a la formación de biomasa es menor a bajos valores de . y´x/s (h-1) 4 Tabla 1. Factores que afectan el mantenimiento celular Factor Microorganismo Condiciones de cultivo ms (g sust./ g biom/h) Aerobacte cloacae aerobio. Glucosa como sust. limit. 0.094 Saccharomices cerviceae aerobio. Sacarosa como sust. limit. 0.036 Saccharomices cerviceae Sacarosa. NaCl 1M 0.36 Azotobacter vinalandii PO2= 0.021 at. 0.15 PO2= 0.21 at 1.5 pH= 6.5 0.025 pH=4.5 0.089 T = 18 C 0.022 T = 21 C 0.052 T = 27 C 0.078 Microorganismo Presión osmótica Presión Parcial de O2 (fijador de N2) pH Temperatura Klebsiella pneumoniae Kluiveromyces lactis 5 Otros destinos de la energía de mantenimiento Hasta el momento hemos descripto los principales destinos de la energía de mantenimiento. Sin embargo, bajo ciertas condiciones del entorno la célula debe disponer de mecanismos adicionales para disipar continuamente excesos de energía que la células no puede usar inmediatamente. Es sabido que deben existir un número de funciones no asociadas al crecimiento cuyas actividades pueden servir para consumir ATP a altas velocidades cuando las condiciones para la síntesis de material celular es impedida. Cuál puede ser la naturaleza de estas reacciones? Cómo están reguladas? Se ha encontrado dentro de una misma célula un número de enzimas que si actúan de manera concertada, podrían causar la hidrólisis de ATP sin producir ninguna cambio neto en otros componentes. En la literatura este tipo de reacciones en las que el balance neto es la hidrólisis de ATP a ADP se las conoce como ¨ciclos fútiles¨. Un ejemplo clásico de un ¨ciclo fútil¨ constituye la siguiente secuencia de reacciones observadas en cultivos de K. Pneumoniae limitados en amonio. Los mismos son ricos en glutamina sintasa y glutamato sintasa que, junto con 2-oxoglutarato producen glutamato. glutamina sintasa Glutamato + NH3 + ATP Glutamina + 2-oxoglutarato + NADHPH2 glutamina + ADP + Pi glutamato sintasa2 2-oxoglutarato+ NH3 + ATP + NADHPH2 glutamato + NADP glutamato + NADP +ADP+Pi Sin embargo cultivos limitados en amonio también contienen una glutaminasa activa que escinde la glutamina en amonio y glutamato, de modo que bloquea la síntesis neta de glutamato provocando la hidrólisis neta de ATP. Glutamato + NH3 + ATP glutamina sintasa glutaminasa Glutamina ATP glutamina + ADP + Pi glutamato + NH3 ADP + Pi Todavía no se sabe qué mecanismo activa la actividad de la glutaminasa durante el crecimiento de células en cultivos limitados en NH4.+ Sin embargo, sería razonable suponer que el ¨ciclo fútil¨ funcionaría como un sensor del amonio disponible manteniendo la enzima asociada con su asimilación (glutamina sintasa) activamente funcionando en ausencia de sustrato exógeno. El funcionamiento de este ciclo fútil seria “el precio la célula que debe pagar” para mantenerse en un estado en el que puede responder rápidamente a cambios bruscos en la disponibilidad del sustrato limitante (amonio). 6 De modo que, el término ¨ciclo fútil¨ describe una situación en la cual la célula posee la maquinaria para llevar a cabo una transformación irreversible de un proceso de transformación en una dirección y en la dirección opuesta. Si ambas funcionan a distinto tiempo, el metabolismo es eficiente. Sin embargo si actúan simultáneamente no habrá ninguna transformación neta, más que la disipación de energía. Otro gasto de fuente de C y energía no destinada al crecimiento es lo que se conoce como el metabolismo de sobreflujo (¨overflow metabolism¨, o ¨spilling reactions¨ o ¨spillover¨). Existen entornos bajo los cuales los microorganismos actúan como si el entorno en el que se encuentran representara un suministro permanente de recursos, y la “filosofía” es “gastar los recursos más que conservarlos para el futuro”. Las células toman las fuentes de C y E la utilizan hasta cierto grado y luego la excretan aún cuando no ha sido utilizada completamente. Por ejemplo, si a cultivos limitados en glucosa los liberamos de dicha limitación temerariamente, no habrá una inmediata aceleración de la velocidad de crecimiento, sin embargo el exceso de glucosa es oxidado parcialmente y se liberan al medio un número importante de metabolitos intermedios. El hecho que las bacterias no siempre regulan precisamente la velocidad de consumo de los excesos de fuente de carbono se observa más claramente en el crecimiento de bacterias en cultivos continuos limitados por otros sustratos distintos a la fuente de C y energía. La Tabla 2 muestra las velocidades de consumo de glucosa y formación de algunos productos en cultivos de Klebsiella pneumoniae limitados por distintos sustratos operados Este llamativo consumo de fuente de C y eliminación de intermediarios que aún podrían ser utilizados es un modo económico de defensa desde la perspectiva que es rápido, sencillo. Existen otros destinos para la energía de mantenimiento que el bioquímico o fisiólogo podría encasillar dentro de lo que se denomina mantenimiento celular. Uno de ellos es la puesta en marcha por parte de la célula de mecanismos que le permiten mantenerse ¨en guardia¨ frente a posibles ¨ataques¨ de otras bacterias, virus, compuestos químicos tóxicos, etc...También frente a importante fluctuaciones del entorno, las bacterias pueden desarrollar modos de protegerse a si mismas, por ejemplo a través de la formación de endosporas. No importa cuál sea el costo energético que represente este proceso, la bacteria lo llevará a cabo aún a costa de sacrificar su crecimiento, es decir, gastará energía a fin de proteger la longevidad de la especie. 7 Tabla 2. Velocidades específicas de consumo de glucosa y formación de distintos productos en cultivos continuos de K. pneumoniae operados en sistema de cultivo continuo a D 0.17 h-1, 35 C, y pH 6.8. sustrato limitante Velocidades específicas Carbono Nitrógeno Azufre Biomasa (h-1) 0.17 0.17 0.17 Glucosa qs (mmol/g/h) 2.1 6.1 5.6 CO2 qCO2(mmol/g/h) 5.3 6.9 7.1 Acetato qp(/g/h) 0 0.7 1.6 Piruvato qp2(g g/h) 0 0.6 2.5 Succinato qp3mmol/g/h) 0 0 0.2 8