Fitopatología Molecular Guía de Trabajos Prácticos 2014 Docentes responsables e invitados: Adrián Vojnov (F. Pablo Cassará) Alejandro Mentaberry (FCEN) Ana Julia Distéfano (INTA, FCEN) Andrea Puebla (INTA) Andrea Venturuzzi (INTA) Carolina Martínez (INTA, FCEN) Daniela Tosto (INTA, FCEN) Federico Ehrenbolger (INTA) Fernando Carrari (FAUBA, INTA) Gabriela Conti (INTA) Gustavo Gudesblatt (F. P. Cassará) Lorena Ingala (INTA) María José Diéguez (INTA) Marisa López Bilbao (INTA) Marta Rivera (FAUBA, INTA) Natalia Almasia (INTA) Paula Fernández (INTA) Sebastián Asurmendi (INTA) Sebastián Moschen (INTA) Silvia López (FCEN) Verónica Lía (FCEN, INTA) Página 1 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Referente a la permanencia y desarrollo del curso: El uso de guardapolvo es obligatorio en las áreas de laboratorio y prohibido en las áreas de comedor y administrativa. Los alumnos deberán traer sus propios guardapolvos. El uso de guantes descartables (serán provistos) es obligatorio al momento de realizar los experimentos pero deberán descartarlos al salir del laboratorio y/o al operar las computadoras afectadas a los equipos. No está permitido ingresar con alimentos o bebidas a los laboratorios ni a la sala de teóricos ni a la de computadoras. Está prohibido fumar en todas las áreas del instituto. Los alumnos deberán usar calzado cerrado adecuado. En las guías de cada trabajo práctico se detallan cuales reactivos serán manipulados solamente por los docentes y ayudantes a cargo. Prestar especial atención a estas notas. El uso del equipamiento de laboratorio se realizará solamente con supervisión de los docentes y ayudantes a cargo. Todos los solventes se manipularán solamente bajo campana. Los tips y tubos epps usados se descartan en botellas de plástico rotuladas para tal fin. Todos los elementos personales (por ejemplo: abrigos, mochilas, carteras, etc.) no deben ser ingresados a los laboratorios. Es fundamental lavarse las manos antes de ingresar y al salir de los laboratorios. Si bien es potable, se recomienda no beber agua de las canillas de los laboratorios. Usar los dispensadores que están en los pasillos. Los alumnos podrán traer sus propias computadoras (notebooks) para los trabajos prácticos que lo requieran. A fin de una mejor orientación de los alumnos, se incluyen en esta guía un esquema de la planta del edificio donde se desarrollará el curso indicando las aulas y laboratorios para tal fin. Información adicional acerca de los laboratorios de TP y aula de teóricos en el Instituto de Biotecnología. Se solicita permanecer en el auditorio o laboratorio destinado a las clases del presente curso durante los horarios establecidos. A los efectos de una mejor ubicación en el Instituto se recomienda consultar el esquema de la planta del Instituto. Cronograma tentativo Lunes 21 de julio 8.30- 8.45 hs Introducción general y presentación de los alumnos 9.00 – 13.00 hs Conceptos básicos de Fitopatología (Silvia López y Marta Rivera) 13.30 – 14.30 hs Biología molecular de virus (Esteban Hopp) 15.00 – 17.30 hs PCR Diagnóstica/PCR en tiempo real y digital (Paula Fernández o Viviana Pedroarias) Martes 22 8.30-12.30: Introducción teórica al TP Virología molecular (Ana Distéfano y Carolina Martínez) y TP Virología molecular: PCR diagnóstica del CLRDV (Ana Distéfano y Carolina Martínez) 13.30 – 15 hs TP Virología molecular: corrida de geles para diagnóstico de CLRDV (Carolina Martínez) 15.30 -17.30 hs Secuenciación de genomas virales (Ana Distéfano) Miércoles 23 8.30 – 12 hs Elementos de Bioinformática aplicada a la Fitopatología (Paula Fernández) 13.00 -17.30 TP Bioinformática: herramientas para análisis de secuencias virales. Consultas en Bases de datos (Carolina Martinez, Ana Distefano) Viernes 25 9.00 -11.00: Genómica aplicada al estudio de poblaciones de fitopatógenos: Marcadores Moleculares (Esteban Hopp) 11.30 -12.30 hs TP Marcadores y bioinformática: análisis bioinformático (D. Tosto, Cintia Acuña) 13.30 – 15.00: Introducción teórica al TP de Sclerotinia y PHC (Federico Ehrenbolger) 15.00-17.30: Extracción de ADN a partir de capítulos de girasol infectados con Sclerotinia (Federico Ehrenbolger, Ana Distéfano) Sábado 26 9 - 10 hs: Presentaciones formales de los temas de trabajo/tesis de los alumnos (10 minutos cada uno). 10 - 12:30 hs: Biología molecular de hongos fitopatógenos (Natalia Almasia) 13.30- 15.30: Estrategias biotecnológicas de resistencia a virus (Alejandro Mentaberry) Lunes 28 8.30-10.30 hs: Introducción al análisis de diversidad (Verónica Lía) 10.30 – 12.30 TP Sclerotinia, PCR (Federico Ehrenbolger, Ana Distéfano) 13.30 -14.30 hs: TP Sclerotinia, Siembra geles y corrida (Federico Ehrenbolger, Ana Distéfano) 14.30 -17.30: Discusión resultados TP Sclerotinia (Federico Ehrenbolger, Ana Distéfano) Martes 29 (en INTA) 8.30 – 10.30 Epidemiología molecular (Lorena Ingala, María José Diéguez) (I. de Genética) 10.30 – 13.00 Evaluación de variabilidad génica de roya de la hoja del trigo (Lorena Ingala, María José Diéguez) (I. de Genética) Visita al IGEAF 14.00-14.30 Introducción al TP Silenciamiento Génico (Gabriela Conti) (Instituto de Biotecnología) 2 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 15.00-17.30 TP Silenciamiento génico (1ra parte) Agroinfiltración (Gabriela Conti, Andrea Venturuzzi) Miércoles 30 (Fundación Pablo Cassará, http://www.fundacioncassara.org.ar/?es/investiga/lic/fitopatolo /) 9.00-10.30 Biología molecular de bacterias fitopatogénicas y estrategias biotecnológicas de resistencia a bacterias (Adrián Vojnov) 11.00-12.30 Entrada de patógenos por estomas e inducción de PAMPS (Gustavo Gudesblat) Tarde: Visita al Laboratorio de Fitopatología Molecular de la Fundación Pablo Cassará Viernes 1 de agosto 9.00 – 11.00: Estrategias biotecnológicas de resistencia a hongos (Marisa López Bilbao) 11.30 – 13.30 Biología molecular de la interacción H-P. Silenciamiento, microRNAs (Sebastián Asurmendi) 14.30-17.00 Seminarios de los alumnos Sábado 2 9.00-10.30 Transcriptómica (Sebastián Moschen) 11 – 12.30 Metabolómica (Fernando Carrari) 13.00 -17.00 Seminarios bibliográficos dados por los alumnos del curso. Lunes 4 (en INTA) 8.30 – 10.30 TP Silenciamiento génico (2a parte): análisis plantas (Gabriela Conti, Andrea Venturuzzi) 10.30 – 15.00: Técnicas de secuenciación convencional y NGS (Andrea Puebla) 15.00-16.30: Visita al secuenciador y TP de análisis de secuencias genómicas (Andrea Puebla) Martes 5 9.00 – 11.00 Mejoramiento genético para resistencia a enfermedades, Mapeo de Asociación, Selección Genómica (Esteban Hopp). Resto del día: Seminarios de los alumnos. Miércoles 6 Seminarios de los alumnos. Sábado 9 (en la EPG - FAUBA) Examen integratorio Contenido: 1 Silenciamiento 2 Secuenciación 3 Diagnostico de virus CLRDV 4 Bioinformatica viral 5 Detección Streptomyces 6 Marcadores y Diversidad 7 qPCR TP 1 Virología Molecular: RT- PCR diagnóstica del Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) en plantas de algodón. Ana Julia Distéfano Consideraciones generales Muchas enfermedades de importancia agrícola regional no son fácilmente diagnosticables por los síntomas producidos, sobre todo si son subclínicos o como en el caso de las enfermedades virales. Por otro lado, la sintomatología puede variar con el fondo genético del hospedante, las condiciones ambientales y la constitución genética del patógeno. La identificación rápida y precisa de los patógenos que afectan a los cultivos de interés agronómico es crítica para predecir y controlar las enfermedades y para seleccionar plantas tolerantes o resistentes en los programas de mejoramiento. Para el caso de infecciones virales, en los últimos años se han desarrollado y optimizado métodos de diagnóstico por RT-PCR de virus pertenecientes a la familia Luteoviridae (Singh y col., 1995, 1996, 2004) El algodón es un cultivo regional clave en el NEA. La enfermedad azul del algodón fue reportada en la Argentina durante la campaña agrícola 1982/83 y actualmente causa importantes pérdidas económicas en el cultivo, limitando su productividad si no se implementan medidas adecuadas de control. La enfermedad es producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) y el virus es transmitido exclusivamente por áfidos no siendo posible su transmisión mecánica. El genoma del CLRDV fue recientemente secuenciado por nuestro grupo y se desarrolló un método efectivo de diagnóstico de la enfermedad permitiendo realizar un diagnóstico temprano del virus en las zonas afectadas. Objetivo del TP: Discutir protocolos de extracción de ARN a partir de muestras de origen vegetal y la subsiguiente síntesis de ADN copia. Realizar el diagnóstico molecular del CLRDV mediante la detección de secuencias propias del virus en plantas de algodón infectadas mediante la técnica de RT-PCR (transcripción reversa y posterior PCR). Parte I: Discusión con los docentes del protocolo de extracción de ARN a partir de plantas del algodón y síntesis del ADN copia (ADNc), observando los detalles importantes para obtener de manera óptima estas moléculas. Extracción de ARN Consideraciones generales El primer paso en el diagnóstico basado en técnicas de detección a nivel de ARN es la purificación de esta molécula de los otros componentes de la muestra (ADN, proteínas, etc). Los sistemas de purificación de ARN a partir de tejidos permiten la obtención de un RNA de gran pureza e integridad. Partimos de dos grupos de plantas de algodón: no infectadas (sanas) y plantas con síntomas de infección por el CLRDV (infectadas). Ver Figura 1. Figura 1: Plantas sanas de G. hirsutum cv Banda 56 (izquierda) comparadas con plantas de la misma edad inoculadas con el áfido que presentan síntomas típicos de enfermedad azul (derecha). 3 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 te proteínas La mayoría de los protocolos de extracción de ARN involucran en general 4 etapas básicas: 1) Se aplica algún tipo de maceración mecánica para romper las paredes y membranas celulares del tejido. La maceración de tejido fresco se hace en presencia de nitrógeno líquido. 2) El tejido se resuspende en el buffer de extracción para la lisis del mismo y la solubilización de las membranas lipoprotéicas y desnaturalización de las proteínas, en tanto que el ARN es protegido de la acción de enzimas degradativas. 3) La suspensión se somete a una extracción con solventes orgánicos, como Fenol ácido (ph 4,5) y cloroformo, y las fases orgánica y acuosa se separan por centrifugación. En esta extracción, lípidos, proteínas, la mayoría de los polisacáridos y el ADN quedan retenidos en la fase orgánica en tanto que el ARN y algunos polisacáridos quedan en fase acuosa. A la fase acuosa obtenida en la etapa anterior se le adiciona alcohol (etanol o isopropanol). El ARN en presencia de alcohol forman un precipitado, que a veces es visible, que puede ser sedimentado por centrifugación. A este precipitado luego se lo lava con alcohol para eliminar las sales remanentes. 4) En la última etapa, el ARN es resuspendido en agua MiliQ libre de RNAsas (agua con Dietil Pirocarbonato). Protocolo de extracción de ARN utilizando TRIZOL Minipreparación de ARN en microtubos de 1,5 ml a partir de 100 mg de tejido de hojas de plantas de algodón sanas e infectadas con CLRDV. 1) Colocar el tejido en un mortero (previamente enfriado con nitrógeno líquido), agregar nitrógeno líquido y moler el tejido hasta que esté pulverizado. 2) Pasar 100 mg de tejido macerado a un tubo de 1,5 ml. Agregar 1 ml de TRIZOL (Invitrogen) y macerar el tejido utilizando un émbolo plástico durante 20-40 segundos. Se trabaja en campana. Aclaración: El TRIZOL es el nombre comercial de una solución de Tiocianato de guanidinio- Fenol. El TRIZOL mantiene la integridad del ARN durante la homogeneización del tejido fino, mientras que al mismo tiempo lisa las células y sus componentes. Precaución: es una sustancia muy tóxica 3) Dejar 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4°C durante 10 minutos a 12.000 rpm para obtener un sobrenadante limpio sin restos de material vegetal. 4) Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Agregar cloroformo frío hasta volumen final de 1,4 ml. Vortex 2 min y centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4°C durante 10 minutos a 12.000 rpm. La muestra se separará en dos fases y una interfase: la superior o acuosa que contiene el RNA, la interfase que contiene ADN y proteínas y la inferior u orgánica que contiene mayoritariamen- 5) Transferir cuidadosamente la fase acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml. Medir el volumen y adicionar 1 volumen de isopropanol. Dejar durante la noche a -20 °C 6) Centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4°C durante 30 minutos a 14.000 rpm 7) Descartar el máximo posible de sobrenadante sin perder el pellet (que en general estará difuso y suelto, encontrándose en el fondo o a lo largo de la pared del tubo dependiendo del ángulo de rotor utilizado). 8) Lavar el pellet con 250 μl de etanol 70% (generalmente, se observará el pellet más blanco en este punto). Centrifugar 10 min a 14.000 rpm a 4°C. 9) Repetir el paso 8. Dejar secar el pellet al aire por unos 20 minutos tomando las precauciones de no secarlo completamente (se dificulta su posterior resuspensión). 10) Resuspender el pellet en 50μl de agua libre de RNAsas (agua DEPC: Dietil Pirocarbonato) previamente calentada a 70°C dado que facilita la resuspensión del ARN. 11) Guardar el ARN a -80 °C El RNA es muy lábil y fácilmente degradado por la acción de RNAsas presentes en la piel y por temperaturas superiores a 4ºC, lo que constituye el principal problema de la extracción del RNA, por ello se utiliza inhibidores de RNasas (como el DEPC), guantes para su manipulación, se utiliza todo el material libre de RNAsas y se trabaja a temperaturas inferiores a 4ºC. Para verificar la calidad, integridad y cantidad del ARN obtenido se realiza una electroforesis en gel de agarosa 1%. Figura 2: Gel de agarosa 1%. Calle S: 1μl de ARN obtenido de hojas de plantas de algodón sanas. Calle E: 1μl de ARN obtenido a partir de hojas de plantas de algodón infecS E tadas con CLRDV. Método de tinción: bromuro de etidio. Soluciones Agua DEPC 0.1% Dietil Pirocarbonato 1 ml Agua c.s.p 1000 ml Síntesis de ADNc. Un ADN complementario (ADNc) puede ser sintetizado in vitro a partir de ARN total utilizando la enzima transcriptasa reversa (RT), la cual es una ADN polimerasa dependiente de ARN, que utiliza primers al azar (random primers o hexámeros al azar) ó un oligo- Página 4 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 nucleotido poly (dT) de 12-18 pb. Luego de desnaturalizar el ARN mediante calor, el primer actúa como iniciador para la síntesis 5`-3` de una molécula complementaria al ARN, la cual es un ADNc de simple cadena. El ADNc obtenido corresponde a la totalidad de la población de ARN presente al inicio de la síntesis. Para la síntesis de ADNc se utilizara el kit comercial SuperScript III (Invitrogen) ARN 1 g dNTPs (10 mM) 1 l Random primers (150 ng/l) 1 l H2O Depc X l Volumen 15 l Colocar 5 min a 70 C y luego inmediatamente en hielo. Hacer un spin. Agregar la siguiente mix: Buffer 1st strand 5x 4l DTT 0,1M (Dithiothreitol) 1l RNAse out (40U/l) 1l Transcriptasa reversa (200U/l) (Superscript II) 1l 22 Colocar en un termociclador con el siguiente programa: 25 ºC 2 min 50ºC 2 hs 70ºC 15 min 16ºC ON PARTE II: Detección de secuencias específicas del CLRDV mediante PCR para su diagnóstico molecular. Consideraciones generales Para la PCR diagnóstica del CLRDV se amplificarán dos regiones del genoma viral, una correspondiente al ORF0 y la otra correspondiente al ORF3. El ORF0 codifica para la proteína P0 que tiene función de supresor de silenciamiento génico y es una proteína que presenta considerable variabilidad entre los distintos aislamientos virales. El ORF3 codifica para la proteína P3 que corresponde a la cápside viral (CP) y es una proteína muy conservada entre los distintos aislamientos virales. En la figura 3 se indica la posición de los primers y el fragmento que se va a amplificar en cada caso. Figura 3: Esquema de la estructura genómica del CLRDV. Se indican los primers (flechas grises) utilizados para la amplificación mediante la técnica de PCR del ORF 0 (Primers 3 y 4) y ORF3 (primers 1 y 2) del CLRDV. Se indica el tamaño a amplificar en cada caso. Secuencia de los primers: Primer 1: CP up 5´ATGAATACGGTCGTGGGTAG 3´ (posición: 3630-3649) Primer 2: CP low 5´ CTATTTTGGATTGTGGAATT 3´ (posición: 4236- 4217) Primer 3: P0 up 5´ ATGTTGAATTTGATCATCTG 3´ Reactivos Concentración final H2O MilliQ Buffer 10X MgCl2 50mM dNTPs 10 mM ---1X 1,5 mM 0,4 M (posición: 71-90) Primer 4: P0 low 5´ TCAACTGCTTTCTCCTTCAC 3’ (posición: 856-837) Se realizará un control para confirmar que el ADNc obtenido es amplificable. Para ello utilizaremos un par de primers que amplifican un ARN mensajero que codifica para un gen endógeno:la Ubiquitina de algodón. Se obtendrá un producto de 500 pb. Primer 5: Gh UBI up 5´ CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC3’ Primer 6: Gh UBI low 5´ GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC3´ Se realizará otro control (control positivo) para confirmar que la reacción de amplificación por PCR funcionó. Para ello utilizaremos un plásmido que tiene clonado el ORF 0 (P0) y otro plásmido que tiene clonado el ORF 3 (CP) con los primers correspondientes. Protocolo experimental a) Material Cada grupo partirá del ADNc de las muestras a analizar y de los plásmidos control. Algunos grupos amplificarán la secuencia del ORF0 y otros grupos la secuencia del ORF3, sobre el ADNc de planta sana y planta enferma y los respectivos controles. También algunos grupos amplificarán la secuencia de la Ubiquitina de algodón sobre el el ADNc de planta sana y planta enferma y sobre un control de ADN de algodón. b) Protocolo experimental b.1.) Reacción de amplificación Se llevará a cabo el siguiente procedimiento: 1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con marcador de alcohol, (utilizar dos para cada ADNc: planta sana y planta enferma, uno para el control negativo de mix y otro para el plásmido control positivo o el ADN de algodón, según corresponda). Tubo 1: ADNc planta enferma con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 2: ADNc planta sana con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 3: plásmido CP con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 4: mix sin ADNc con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 5: ADNc planta enferma con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 6: ADNc planta sana con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 7: plásmido P0 con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 8: mix sin ADNc con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 9: ADNc planta enferma con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 10: ADNc planta sana con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 11: ADN algodón con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 12: mix sin ADNc con Primers 5 y 6 (Gh UBI) 2) Realizar una mezcla de reacción (Premix) según la siguiente tabla: Volúmen en l MIXADNc plásmido o ADN 16,45 2,5 0,75 1 Volúmen total l l l l Página 5 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Primer up 50 ng/l Primer low 50 ng/l Taq Platinum (10 U/l) ADNc ó plasmido (1 ng/l) Volúmen final 2 ng/l 0,08 U/l Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente, aplicar un spin de centrífuga y luego 3) Agregar 23 l de la Premix a cada tubo. 4) Pipetear el ADN (2 l en el caso del ADNc ó 1l en el caso de los pásmidos) en los tubos correspondientes y 2 l de H2O en el tubo “control negativo” o 1 l de H2O en el tubo “control negativo”, según corresponda. . 5) Luego, agregar una gota de aceite mineral. Tapar bien. Dejar los tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador. PRECAUCIÓN: Una vez que la Taq polimerasa fue agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya que la enzima pierde irreversiblemente actividad a temperatura ambiente. El programa de amplificación es el siguiente: 1 ciclo 94 C, 4 min (desnaturalización inicial) 35 ciclos 94 C, 1 min (desnaturalización) 55 C, 1 min (hibridación) 72 C, 1 min (extensión) 1 ciclo 72 C, 10 min (extensión final) 16 C, infinito (conservación de las muestras) 6) Una vez terminado el programa, agregar a la muestra 5 l de Buffer de Carga y guardar en freezer a -20C hasta el momento de la visualización de los resultados. 1 1 0,3 l l 2 (por tubo) 25 l 3) Una vez fundida la mezcla, agregar el volúmen necesario de una solución de bromuro de etidio para obtener una concentación final de 0,5 g/ml en el gel. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante la manipulación del gel. 4) Volcar la solución en la cama electroforética (ésta debe estar apropiadamente nivelada y tener el peine colocado). Eliminar toda burbuja. Esperar a que gelifique completamente antes de usar. 5) Sumergir la cama junto con el peine en la cuba electroforética, la cual debe poseer buffer TAE 1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Retirar cuidadosamente el peine y proceder a la siembra de las muestras (20 l por calle). 6) La corrida electroforética se llevará a cabo a voltaje constante (8 V/cm) y los productos de amplificación se visualizarán bajo luz UV. PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente dañina para los ojos. Para minimizar la exposición, asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también mutagénica y carcinogénica. 7) Observe y analice los resultados. c) Soluciones empleadas TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM EDTA Tris base (PM=121,10) 48,40 g/L Na2EDTA (PM=380,2) 2,92 g/L NaOAc (PM=82,03) 4,10 g/L Ajustar el pH en 8,0 con Ácido acético glacial b.2) Visualización de los productos de amplificación Los productos de amplificación serán resueltos por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Para ello, se procederá de la siguiente manera: 1) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria de agarosa en el volúmen apropiado de buffer TAE (TrisAcetato -EDTA) 1X para obtener una concentración Buffer de carga final de 1%. Xilenxianol 2 mg/ml 2) Colocar la mezcla de agarosa en el horno microonGlicerol 40% (v/v) das y calentar a baja potencia hasta el primer hervor. TP 2: Bases de datos para análisis de secuencias virales Ana Julia Distéfano y Carolina Martínez Las enfermedades de las plantas causan la pérdida de aproximadamente el 15% de la producción agrícola mundial. En particular, las infecciones virales producen perjuicios económicos significativos de manera directa, a través de una disminución del rendimiento por efecto de la enfermedad, e indirecta a través de un incremento en los costos debido a la utilización de semilla libre de virus (por ejemplo en plantas de propagación clonal como papa, ajo y batata). En este contexto, el estudio y caracterización de los virus vegetales desde el punto de vista clásico como molecular reviste de gran importancia para el desarrollo de nuevas y mejores estrategias de resistencia en los diferentes hospedantes vegetales. El Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) La enfermedad azul es considerada en la actualidad la principal enfermedad de origen viral que afecta al cultivo de algodón en la zona algodonera de la Argentina (NEA). Se determinó que la enfermedad es causada por el Cotton leafroll dwarf virus, y recientemente se obtuvo la Página 6 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 secuencia completa del genoma viral (Distefano AJ y col, Archieves of Virology, 2010). El virus es transmitido únicamente por un insecto vector: Aphis gossypii Glover. El CLRDV pertenece al género Polerovirus de la familia Luteoviridae. Su genoma es de ARN de simple cadena positiva, y el tamaño total es de 5866 bases. Taxonomía y filogenia moleculares La clasificación de los virus ha sido y sigue siendo un punto extremadamente confuso y sometido a constante revisión. No hay que olvidar que para su identificación y nomenclatura no son válidos los criterios utilizados con los organismos de estructura celular eucariótica, ni siquiera los seguidos en el caso de las bacterias. En virología no hay unanimidad acerca del concepto de especie, ya que los criterios a seguir para definirla pueden variar de una familia de virus a otra. En general se valoran: la naturaleza de su genoma (ARN/ADN), tamaño y morfología, la sensibilidad a solventes orgánicos, características antigénicas (muy utilizadas para el establecimiento de tipos dentro de las especies), formas de transmisión, rango de huésped y sintomatología. El concepto de especie, es muy importante desde un punto de vista taxonómico. Sin embargo, solamente en 1991, la ICTV aceptó la propuesta de Van Regenmortel, de considerarlo como un criterio válido para la taxonomía y nomenclatura de los virus. Las relaciones filogenéticas entre los virus han sido posibles de inferir a medida que se ha ido clonando, secuenciando y caracterizando genes estructurales de los mismos. Estos análisis constituyen una poderosa herramienta para realizar estudios de epidemiología molecular. Por otro lado también permiten analizar la evolución de los virus y eventualmente definir nuevas especies o grupos taxonómicos. En los últimos años, la implementación de las técnicas de secuenciación masiva junto con la consecuente producción de una gran cantidad de datos y el desarrollo de la bioinformática, hicieron posible la generación de bases de datos de secuencias de consulta diaria para toda la comunidad científica, permitiendo estudios comparativos de genomas. Estas herramientas, también son utilizadas para el estudio de los genomas pertenecientes a virus vegetales. Objetivo Familiarizarse con el uso de herramientas bioinformáticas y consulta de bases de datos disponibles a través de internet, empleadas frecuentemente en el estudio molecular de genomas virales. Desarrollo Se analizarán tres clones obtenidos a partir de la secuenciación del genoma del CLRDV, estudiando el nivel de identidad con otras secuencias depositadas en bases de datos públicas y ubicando la posición de los clones en el genoma del virus. Además, se realizará el mismo análisis para la secuencia traducida (secuencia aminoacídica) de dichos clones. Se compararán y discutirán los resultados obtenidos para cada una de ellas. Procedimiento 1. Identificar la carpeta virología molecular en el Escritorio de la computadora. Abrirla y localizar el archivo clones.doc, allí se encuentra la secuencia de tres clones correspondiente al CLRDV. Abrir el archivo con el Word o el WordPad. 2. Buscar en la base de datos Genbank utilizando el programa BLAST la identidad de los tres clones. A la secuencia enviada, la denominaremos secuencia query. Para ello acceder a través de la página del National Center for Biotechnology Information http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar Nucleotide blast (blastn). 3. Copiar la secuencia de cada archivo y pegarla en la ventana del BLAST “enter query sequence”. En programme selection elegir “somewhat similar sequence (Blastn)”. En Chose Search Set elegir “Others (nr etc)” Enviar la búsqueda (clic en “blast”). 4. Interpretar, analizar y discutir el resultado de las búsquedas con los docentes. 5. A partir de los resultados obtenidos mediante BLAST, acceder a alguna de las secuencias con mayor identidad. Discutir con el docente la información que se obtiene. Bajar y guardar alguna secuencia en formato fasta, siguiendo las instrucciones del docente. 6. Repetir del paso 2 al 4 pero utilizando la secuencia traducida de los tres clones que se encuentra en el mismo archivo clones.doc. Para ello acceder a través de la página del National Center for Biotechnology Information http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar Protein blast (blastp) ¿Qué diferencias se observan respecto a la comparación con la secuencia de nucleótidos realizada? 7. Realizar una búsqueda similar a la anterior (puntos 2, 3 y 4), empleando el programa FASTA. Para ello acceder a través de la página del European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/fasta33/. Para un desarrollo más dinámico de la práctica, el resultado de esta búsqueda se encuentra guardado en la carpeta virología molecular con el nombre de fasta n clones 1, 2 ,3.doc. ¿Qué diferencias observa con el programa Blast? 8. Entrar a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ y discutir con los docentes las herramientas disponibles y la utilidad de este sitio. 9. Entrar a la página http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version= 2011 y discutir con los docentes la utilidad de este sitio Página 7 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 TP 3: Marcadores Moleculares y Diversidad genética: La detección y cuantificación de la variación genética, generada por las modificaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos del ADN, ha progresado gradualmente desde las evaluaciones biométricas, los análisis fisiológicos, los estudios bioquímicos isoenzimáticos, el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), hasta el advenimiento de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que permitió la incorporación de diversos métodos de detección del polimorfismo genético, directamente sobre la molécula de ADN. Esta clase de marcadores podrían definirse como los fenotipos/genotipos moleculares, generados por el polimorfismo genético específico de una secuencia conocida o desconocida de ADN, que puede o no ser codificante. Por consiguiente, los marcadores moleculares permiten examinar el polimorfismo en regiones codificantes, no codificantes y altamente variables de los genomas, tanto nucleares como de organelas, proporcionando con un alto grado de precisión, el perfil genético de cada individuo analizado (“DNA fingerprint” o huella digital genética del ADN). La aplicación de estas herramientas en disciplinas relacionadas a la Fitopatología permite: La caracterización molecular de colecciones de aislamientos de especies patogé- nicas asociadas a cultivos de interés agrícola. El conocimiento del nivel de diversidad genética presente en poblaciones de patógenos, el análisis de la distribución de dicha diversidad y la estimación del grado de similitud genética existente entre los aislamientos que las componen. El estudio de la estructura genética de poblaciones de patógenos y plagas El desarrollo de sistemas de diagnóstico de patógenos e identificación de plagas Características de los marcadores moleculares Las técnicas moleculares ofrecen numerosas ventajas respecto a las técnicas tradicionales basadas en evaluaciones fenotípicas: (1) Son estables y pueden detectarse en todos los tejidos, independientemente de la etapa de diferenciación, desarrollo o crecimiento del organismo bajo estudio. (2) No están afectados por el ambiente (3) Generalmente carecen de efectos pleiotrópicos y epistáticos. Un marcador genético ideal debe cumplir con los siguientes requisitos: (1) Manifestar altos niveles de polimorfismo. Se prefiere, de ser posible, el empleo de marcadores multialélicos (2) Presentar alta heredabilidad, lo que implica que debe ser altamente reproducible en la progenie (3) Presentar segregación mendeliana y comportamiento co-dominante, esto es, la factibilidad de identificar las tres clases alélicas (AA, Aa y aa). (4) Ser abundantes y dispersos por todo el genoma (5) Ser fenotípicamente neutros y detectables en cualquier momento del desarrollo del individuo. Técnicas Numéricas Daniela Tosto, Cintia Acuña Las técnicas numéricas que se aplican a la taxonomía [utilizando cualquier tipo de marcador (morfométrico, bioquímico o molecular)], cuantifican la afinidad entre unidades taxonómicas, basándose en el estado de los caracteres que se eligen para ejecutar dicha tarea. Para el análisis de marcadores moleculares los caracteres están representados por los loci, o bien, por las bandas electroforéticas amplificadas. En el caso de marcadores moleculares dominantes como los AFLP y los RAPD, se asume que cada banda amplificada corresponde a un alelo dominante, para un locus determinado, y por lo tanto sólo pueden ser detectadas dos condiciones: la presencia de banda (que representa la presencia del locus en estado de heterocigosis u homocigosis, sin poder discriminar entre ellos) y la ausencia de banda (que representa la ausencia del locus o la presencia de alelos nulos). Por otra parte, cuando se analizan marcadores codominantes y multialélicos, como los microsatélites, cada banda amplificada (que corresponde a un alelo) es considerada como un carácter, y la presencia o ausencia del mismo, será considerada como el estado de dicho carácter. Las principales características de estas metodologías son: (a) Se efectúan considerando un gran número de ca(a) ( a ) Se efectúan considerando un gran número de caracteres, pudiendo ser éstos infinitos. (b) Todos los caracteres utilizados tienen la misma significación e importancia. (c) La similitud total entre dos entidades es la suma de la similitud en cada uno de los caracteres utilizados. (d) Las asociaciones de los organismos no reflejan necesariamente genealogía del grupo. 1. Elección de las unidades: los organismos a estudiar, definidos como OTUs (Unidades Taxonómicas Operativas) que pueden estar representadas por colección de aislamientos, colecciones de semillas, variedades, cultivares, etc). Dado que se evalúa el ADN del organismo, no interesa el estado fisiológico o de desarrollo del mismo. 2. Elección de los caracteres y registro del estado de cada uno de ellos (ej. presencia o ausencia de bandas electroforéticas de RAPD, AFLP o alelos de microsatélites). Carácter Estado Presencia Banda de determinado tamaño molecular Ausencia Ejemplo para Bandas de AFLP de distintos pesos moleculares, expresados en pares de bases (pb) 200 pb, 182pb, 165 bp, 140pb, 120 bp, 100 bp, 94 bp, 75pb En el caso de marcadores multilocus como los AFLP y los RAPD, cada locus determina un carácter. Cuando se trata de microsatélites, este tratamiento no puede realizarse. Se considera en cambio a cada alelo como un carácter con sus ventajas y desventajas, como se explica a continuación. Cuando los datos son del tipo cualitativo, con varios Página 8 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 estados (por ejemplo alelos de microsatélites) y no poseen una secuencia lógica o están desordenados, los mismos no pueden ser representados adecuadamente a través de números, pues se carece de fundamentos para establecer un orden determinado. En estos casos, se transforma a cada estado (ej. alelo de determinado tamaño) en presencia o ausencia. La desventaja de esta codificación es que al transformarse en varios caracteres independientes, aumenta su valor taxonómico en detrimento de los no codificados de esta forma. Ej: locus A Alelo 1=120 pb, Alelo 2= 130 pb, Alelo 3= 140 pb Codificación transformando los datos en doble estado (1 y 0) Alelo 1: presencia o ausencia Alelo 2: presencia o ausencia “ Alelo 3: presencia o ausencia En este caso, el locus A, posee 3 caracteres. En otros casos, como AFLP, cada banda es un carácter. Ejemplo de interpretación de bandas: calcular las similitudes o las diferencias a través de operaciones matemáticas. Estos coeficientes pueden ser clasificados en cuatro grupos: coeficientes de distancia, coeficientes de correlación, coeficientes de asociación y coeficientes de similitud probabilística. El tipo de estadístico aplicable a un grupo de datos, para el análisis de las relaciones genéticas entre OTUs, depende del tipo de datos evaluados. Específicamente, los coeficientes de asociación miden las coincidencias y diferencias en los estados de los caracteres entre dos OTUs. Esta medición exige caracteres de tipo doble estado. Al comparar dos OTUs para un carácter doble estado pueden presentarse cuatro posibilidades: que las dos OTUs presenten el carácter comparado (caso a), que sólo una u otra lo presenten (casos b y c), o bien que el carácter esté ausente en ambas (cado d). Los coeficientes de asociación más frecuentemente utilizados como medidas de similitud en análisis genéticos son: SM Simple matching: (a+d)/(a+b+c+d). DICE: 2a/(2a+b+c) (Dice (1945), Nei and Li, 1979) JACCARD: a /(a+b+c), Jaccard (1908) Estos coeficientes pueden variar entre un valor mínimo de 0 (cuando el par de individuos no tienen bandas en común) y un valor máximo de 1 (cuando todas las bandas presentes en un individuo están presentes en el otro). Dependiendo de cuál de estos coeficientes se utilice se acentúan distintos aspectos de la simi123456789 10 litud. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111111111 1 5. Construcción de una matriz de similitud entre 110101000 1 OTUs. 000111111 1 Esta matriz es triangular, de OTU x OTU (orde111011101 0 nadas de igual forma en cada eje). En cada celda 000100000 0 se indica el valor de similitud obtenido para 101001110 1 ese par de OTUs y por lo tanto se obtienen 000000010 1 valores iguales 1 en la diagonal, por tratarse de 110011111 0 la similitud con la misma OTU. 111111111 1 Es triangular, pues la similitud entre la OTU1 y la OTU2 por ejemplo, es igual que entre la OTU2 y la OTU1, y por lo tanto la matriz supe3. Construcción de la Matriz Básica de Datos (MBD) (organismos vs estados de los caracteres [1 y 0 según se rior resulta la imagen especular de la matriz inferior. trate de presencia o ausencia de una determinada banda Matriz de similitud (MS) obtenida para la MBD conselectroforética (AFLP)]. Pueden existir datos perdidos, truida en el paso (3), donde se aplicó el coeficiente de Jaccard, con presencia de datos perdidos: codificados en el ejemplo con el valor 5. OTU\pb 200 182 165 140 120 100 94 75 var1 1 1 0 0 0 0 0 5 var2 1 0 0 0 1 0 1 1 var3 0 1 0 5 0 1 1 0 var4 0 0 1 1 0 1 1 0 var5 5 0 0 5 1 1 0 0 4. Obtención de un Índice de similitud o asociación entre todos los pares de organismos (OTUs) Para expresar de manera cuantitativa el parecido entre distintas OTUs existen varios coeficientes de similitud (Jaccard, Dice, Simple Matching, entre otros), que permiten Var 1 Var 2 Var 3 Var 4 Var 5 Var 1 1 Var 2 0.25 1 Var 3 0.25 0.16 1 Var 4 0 0.14 0.5 1 Var 5 0 0.25 0.25 0.25 1 Índice de similitud de Jaccard (Sim J) entre var1 y var2=1/4 Sim J entre var 2 y var 3=1/6 Sim J entre var 3 y var 4=2/4 Sim J entre var 4 y var 5=1/4 Sim J entre var 2 y var 4=1/7 6. Conformación de grupos. Página 9 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Dado que la matriz de similitud es insuficiente para expresar las relaciones entre la totalidad de las OTUs (pues sólo expone similitudes entre pares de OTUs), se desarrollaron gran variedad de técnicas de análisis de matrices de similitud, con el objeto de sintetizar la información de dichas relaciones. La más utilizada es el análisis de agrupamiento; esta técnica forma grupos de OTUs que se asocian por su grado de similitud y en general se utilizan técnicas secuenciales: 6.1) Se busca en la matriz de similitud, el mayor valor (sin considerar los valores de la diagonal). Se identifican las OTUs involucradas y éstas constituirán el primer grupo 6.2) Se busca en la matriz, el próximo valor de mayor similitud y se une al grupo anterior 6.3) Se repite este proceso hasta que se unen todos los grupos 6.4) El agrupamiento de individuos puede observarse a través de una representación gráfica, mediante la construcción de diagramas arborescentes denominados fenogramas. Fenograma obtenido con la MS del paso (5) grupo con el valor de similitud promedio entre la misma y cada uno de los de las OTUs del grupo existente A BC 1 0.7 0.4 0.35 0.3 0 7. Medida de la distorsión del fenograma El método de ligamiento que se emplea para agrupar los individuos puede generar distorsiones en el fenograma respecto de los datos de similitud originales. La cuantificación de dicha distorsión se realiza mediante el cálculo de un coeficiente de correlación denominado “cofenético”, que consiste en correlacionar la Matriz de similitud original con una Matriz cofenética, que surge de las similitudes observadas entre los pares de individuos comparados, en este caso, a partir de los datos del fenograma. Esquema del Análisis de Agrupamiento con marcadores moleculares AFLP La incorporación de una OTU a un grupo existente puede realizarse de tres formas distintas. Ejemplo: Matriz de similitud: OTUA OTUB OTUC OTUA 1 0.7 0.4 OTUB 1 0.3 OTUC 1 A BC 1 0.7 0.4 0 Ligamiento simple: la nueva OTU se une al grupo con el valor de similitud máximo al de las OTUs del grupo existente Ligamiento completo: la nueva OTU se une al grupo con el valor de similitud mínimo al de las OTUs del grupo existente A BC 1 0.7 0.4 0.3 0 • Ligamiento promedio (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average o UPGMA): la nueva OTU se une al Página 10 de 27 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 GUIA PARA USAR EL NTSYS 1.7/1.8/2.0 El desarrollo de esta práctica tiene como objetivos: • La interpretación de datos provenientes de marcadores moleculares. • El uso de técnicas bioinformáticas (NTSys) para establecer relaciones fenéticas. • La visualización de la aplicación práctica de ambas herramientas para la evaluación comparativa de la diversidad genética Construcción de la Matriz Básica de Datos Construir la MBD [matriz de variables (bandas) x OTUs] con los siguientes requisitos: (1) Construcción de la MBD utilizando “Solo texto” de cualquier procesador de textos (2) Si la MBD se construye en Excel, guardar con extensión “csv” y controlar luegoque los datos estén separados por comas y no por puntos y comas. “Si se tienen muchos datos, tratar de que sea lo más angosta posible, si es necesario debe transponerse la matriz.” (3) Puede también construirse la MBD en Excel e importarla desde el editor de matrices del NTSYS versión pc Códigos de entrada de los datos Primer renglón: 1er n°: 1 si es matriz cuadrada o rectangular (no triangular) 2do n°: número de filas de la matriz. Si se aclaran los nombres se coloca L. 3er n°: número de columnas 4to n°: 1 si existen datos perdidos 5 to n°: número asignado para el dato perdido Segundo renglón: Identificación de las OTUs. La nomenclatura de cada OTU no debe contener signos y no debe superar los 8 caracteres. Se recomienda que los renglones que contengan los nombres no superen el ancho de la pantalla. Renglones sucesivos Se incorporan los datos binarios de cada fila y columna Ejemplo: Matriz básica de 5 variedades (filas) por 8 variables (columnas). Existen datos perdidos que se codifican con 5. Los 1 indican presencia de banda y los 0 indican ausencia de banda. 1 5L 8 1 5 var1 var2 var3 var4 var5 11000005 10001011 01050110 00110110 50051100 Una vez confeccionada la matriz en block de notas o bien programas de texto sin formato o Excel (csv), se recomienda comprobar que la matriz no tenga errores mediante el comando Output del menú GENERAL. Empleo del editor de matrices del NTSYS 1) Construcción de la MBD en Excel siguiendo los mismos pasos descriptos para su construcción en modo “solo texto”, exceptuando la identificación de las OTUs, renglón que debe dejarse vacío. También debe dejarse vacía la 1° columna, por debajo del 1° número en el primer renglón N° de columnas (en el ejemplo representan a las variables (bandas) Código para Matriz rectangular N° de filas (en el ejemplo representan a las OTUs (variedades) 1 5 8 5 1 1 0 0 5 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 5 1 5 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 5 1 0 0 0 Código utilizado para dato perdido 2) En el programa NTSYS, en la opción File, debe seleccionarse la opción Edit data file y abrir el archivo de Excel que contiene la MBD. En la pantalla de edición vacía, seleccionar File y luego las siguientes opciones: Import Excel ► using OLE…. y abrir nuevamente el mismo archivo de Excel que contiene la MBD De manera automática se edita la matriz, pudiéndose con la opción Row Labs identificar las diferentes OTUs. Puede observarse que el editor indica el tipo de matriz, número de filas y columnas y el valor asignado a los datos faltantes. 11 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 La matriz obtenida puede guardarse en File, opción Save file as… con la extensión “.NTS”. Se sugiere guardar la versión importada desde el Excel sin modificaciones. PASOS A SEGUIR PARA TODAS LAS VERSIONES DEL PROGRAMA: 1) Control de la Matriz Básica de Datos (MBD), o cualquier otra matriz generada por el programa En Menú Principal: General, opción Output Input file: ingresar el archivo (extensiones “.txt” o “.nts) Field width: dejar el valor predeterminado Decimal places: dejar el valor predeterminado o modificar según interés Page width: cambiar el valor predeterminado a un valor de 1000 Opción Compute para hacer correr la matriz Output: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatistics Inc. Date & time: 27/07/2004 11:09:15 a.m. ---------------------------------------- Input parameters Read input from file: A:\Var.nts Format: width=9 decimals=0 Page width: 80 Field width: 9 Decimal places: 0 Page width: 80 Matrix type =1(rectangular), size =5 by 8, missing value code =5 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 ------------------------------------------------------------1 | 1 1 0 0 0 0 0 5 2 | 1 0 0 0 1 0 1 1 3 | 0 1 0 5 0 1 1 0 4 | 0 0 1 1 0 1 1 0 5 | 5 0 0 5 1 1 0 0 • Los códigos de presencia/ausencia son distintos de 1/ 0, respectivamente. • El código utilizado para definir al dato perdido no es coincidente con los valores adjudicados en el cuerpo de la MBD y/o el primer renglón de la matriz (ver código de entrada de datos, pág.8) • Excesivo número de columnas, en cuyo caso se sugiere transponer la matriz 2) Construcción de la Matriz de Similitud (MS) En Menú Principal: Similarity Errores que no permiten visualizar la matriz • Códigos erróneos para la entrada de datos (error en el número de filas y/o columnas. • El número de caracteres por “label” supera los 8 caracteres permitidos. 12 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 opción SimQual (Similarity measures Qualitative) Input file: ingresar el archivo (extensiones “.txt” o “.nts) By rows?: la construcción de la MS entre filas o columnas depende de cuales sean las OTUs y cuales las variables, en el ejemplo las OTUs están dispuestas en las filas. Coefficient: elección del coeficiente de similitud a aplicar, en el ejemplo J (Jaccard) Output file: nombre del archivo donde se va a crear la MS Positive code: predeterminado Negative code: predeterminado Opción Compute para obtener la matriz 3) Aplicación del Método de agrupamiento En Menú Principal: Clustering opción SAHN (Sequential Agglomerative Hierarical nested cluster Analysis) Input file: ingresar el archivo de la MS Output tree file: nombre del archivo que va a guardar el fenograma Clustering method: elección del método de agrupamiento de las OTUs, en el ejemplo UPGMA In case of ties: La opción WARN elige sólo uno de los posibles árboles y lo muestra, la opción FIND permite ver más de un fenograma en caso de empate. Opción Compute para ejecutar el agrupamiento Permite observar el fenograma obtenido según la opción WARN 13 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 4) Visualización del Fenograma En Menú Principal: Graphics opción Tree plot Input file: ingresar el archivo del fenograma Opción Compute para el dibujo del fenograma Luego de la obtención del feno- grama, dentro de Options la opción Plot options permite el agregado del Título y subtítulo, modificaciones en el tamaño y tipo de letras, definir el grosor de los brazos del fenograma y definir las es- calas, entre otras posibles. El fenograma puede copiarse mediante la opción Edit, luego copy bitmap y pegarse en programas de texto (ej. Word) y diseño gráfico (ej. Power Point) 5) Obtención de la Matriz Cofenética En Menú Principal: Clustering opción Coph Input tree file: ingresar el archivo del fenograma Output coph. file: nombre del archivo que va a guardar la Matriz Cofenética Opción Compute para la obten- ción de la Matriz 6) Cálculo del Coeficiente de correlación Cofenético (CCC) En Menú Principal: Graphics opción MxComp Input file 1: ingresar el archivo de la Matriz de Similitud Input file 2: ingresar el archivo de la Matriz Cofenética Normalize Mantel stat?: permite normalizar la prueba de Mantel Number Opción Compute para la obtención del CCC y prueba de Mantel MxComp: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatistics Inc. Date & time: 28/07/2004 04:26:28 p.m. ---------------------------------------- Input parameters Read X input from file: A:\Var Sim.nts Read Y input from file: A:\Var Cof.nts Mantel statistic will be normalized. 1000 random permutations will be performed. Comments: SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J by Rows, += 1.00000, -= 0.00000 Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) Comments: SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J by Rows, += 1.00000, -= 0.00000 14 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 SAHN: input=A:\Var Sim.nts, method=UPGMA, tie=WARN COPH: tree=A:\Var Fen.nts Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) N = 8 Mean X = 0.2574 SSx = 0.0805 Mean Y = 0.2237 SSy = 0.1099 Tests for association: Matrix correlation: r = 0.91409 (= normalized Mantel statistic Z) Approximate Mantel t-test: t = 2.7043 Prob. random Z < obs. Z: p = 0.9966 Out of 1000 random permutations: 994 were < Z, 6 were = Z, and 0 > Z (The observed comparison is not included in these counts.) The one-tail probability is: p[random Z >= observed Z] = 0.0080 Representación gráfica de la correlación cofenética entre la Matriz de Similitud y la Matriz Cofenética Bibliografía Crisci, J.V. y López Armengol, M.F.1983. Introducción a la teoría y práctica de la taxonomía numérica. Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos. Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Washington D.C.(Serie de Biología, n°26). 132 pp. Dice, L. R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology, 26: 297-302. Jaccard, P. 1908. Nouvelles rescherches sur la distribution florale. Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat., 44:223-270. Johnson, S.C. 1967. Hierarchical clustering schemes. Psychopmetrica. 32: 241-254. Rohlf, F.J. 1998. NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariate analysis System, Version 2.0. Exeter Software, Setauket., N.Y. TP 4: Cuantificación por PCR en tiempo real de secuencias diagnósticas Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La Reacción en Cadena de la polimerasa es una reacción de biología molecular extremadamente sensible y altamente específica. Esta metodología permite la detección, cuantificación e identificación específica de secuencias blanco de interés presentes en el genoma o muestra a analizar. En la actualidad es un método sumamente utilizado en diferentes áreas. El fundamento de la PCR consiste en la multiplicación in vitro de un fragmento de ADN, mediante un proceso denominado amplificación, con el fin de aumentar su concentración hasta obtener una cantidad de copias de ADN que permita ser detectado. Este proceso de amplificación es fundamental porque las secuencias de ADN a detectar se encuentran en muy baja proporción con respecto al ADN total de la muestra analizada. Para la reacción de PCR se requieren, además del ADN en estudio, los 4 nucleótidos (unidades constitutivas del ADN), una enzima denominada Taq ADN polimerasa, que es la encargada de sintetizar las millones de copias de un mismo fragmento de ADN y por último un par de cebadores (primers en inglés) que son pequeñas secuencias de ADN de simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se encargan de indicarle a la enzima donde iniciar la síntesis de nuevas copias de ADN. La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad de los cebadores para reconocer por complementaridad de bases una secuencia particular de ADN y para ello es necesa- Paula Fernández rio conocer, al menos parcialmente, la secuencia del ADN que se quiere detectar para diseñar los primers adecuados. La reacción ocurre en un equipo denominado termociclador que regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La reacción tiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y elongación. Etapa de desnaturalización, donde se produce la separación de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94ºC o 95ºC. Etapa de hibridación (annealing en inglés) donde ocurre el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias complementarias. Esta etapa se realiza a una temperatura que resulta la óptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura varía de acuerdo al diseño de los primers y se encuentra dentro de un rango que va desde los 50 ºC hasta los 70 ºC. En esta etapa sólo se produce la hibridación si el ADN de la muestra que se estudia contiene las secuencias buscadas. Si ellas no están presentes, no habrá unión y por lo tanto, no habrá amplificación. Etapa de elongación, donde ocurre la síntesis de dos nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la acción de la enzima Taq polimerasa. Esto se desarrolla a una temperatura de alrededor de 72º C, que es la temperatura óptima de acción de la enzima. Estas tres etapas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se repiten de 30 a 50 veces. 15 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Se busca la presencia o ausencia de bandas de un determinado peso molecular que se corresponden con el tamaño del fragmento amplificado. La lectura del producto de amplificación ocurre en la fase de plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultado obtenido es cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de interés) o semicuantitativos (en rangos de concentración). Para la obtención de resultados de tipo cuantitativo por PCR convencional es necesario realizar el análisis individual de distintos conjuntos de muestras y tener en cuenta consideraciones estadísticas para el armado y cantidad de conjuntos a analizar. Esquema de la amplificación www.porquebiotecnologia.com.ar por PCR. Cinética de la Reacción La cinética de la reacción de PCR tiene tres momentos o fases: La fase inicial, donde se encuentran pocas moléculas de secuencias blanco (target) y alta concentración de los reactivos de PCR. La fase exponencial, donde la eficiencia de la síntesis de las nuevas cadenas es máxima debido a que hay abundancia de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la relación entre producto de PCR formado y el número inicial de moléculas de ADN presentes en la muestra es directamente proporcional. La fase de plateau, donde los reactivos de PCR se agotan y existe un exceso de producto amplificado. Allí la eficiencia de síntesis decae. PCR en tiempo real Gráfico de la Cinética de reacción de la PCR. Fotografía de los resultados por PCR en punto final. Gel de agarosa. www.porquebiotecnologia.com.ar PCR en tiempo Real La técnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa a la PCR en tiempo final que permite la obtención de resultados cuantitativos. La denominación de “tiempo real” se debe a que el ADN amplificado puede ser detectado durante todo el proceso de amplificación y no al final del mismo, como sucede con la PCR convencional. La PCR en tiempo real combina el uso de un termociclador, un sistema de detección de fluorescencia y una computadora. El termociclador tiene acoplado un sistema para la detección de fluorescencia. A medida que transcurre la reacción el equipo toma señales de la fluorescencia generada y las analiza (en "tiempo real"). La señal de fluorescencia recolectada es analizada por la computadora. La señal generada es directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la fase exponencial de la reacción, se obtiene así una cuantificación más adecuada y precisa del producto amplificado. Esta metodología, siempre que sea adecuadamente diseñada y puesta a punto, permite obtener una mayor sensibilidad y especificidad. Dado que la amplificación y la detección ocurren al mismo tiempo, el análisis es más rápido que en la PCR en punto final. Además, como no es necesario, manipular los productos de PCR se reduce la posibilidad de contaminación con estos productos. Dentro de la metodología de PCR hay dos modalidades que son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo final y PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un termociclador. La diferencia que presentan estas dos modalidades es la forma y fase en la cual se produce la detección del producto de amplificación y por lo tanto, en el tipo de resultados obteniEntre las desventajas que presenta frente a la PCR en tiempo dos. final se pueden señalar su mayor costo, tanto en el equipo como en los reactivos utilizados, así como la complejidad del PCR en tiempo final En la PCR en tiempo final una vez concluida la reacción, los diseño de los primers y sondas, que en muchos casos resultan fragmentos amplificados son separados mediante electrofo- más exigentes. resis en gel de agarosa y visualizados bajo luz ultravioleta por medio de un colorante fluorescente (bromuro de etidio). 16 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Fluorescencia Ciclo de PCR Esquema de una corrida de PCR. Lectura de Fluorescencia en función del ciclo de PCR para diferentes concentraciones de target. Para la medición de la fluorescencia dos son las modalidades más utilizadas: las sondas fluorescentes y los agentes intercalantes de ADN. Las sondas son secuencias de oligonucleótidos que reaccionan por complementariedad de bases con un pequeño fragmento de la secuencia a amplificar. Estas sondas están marcadas con moléculas que emiten fluorescencia cuando se produce la amplificación específica. Las sondas se colocan en la reacción de PCR junto con los otros reactivos y solamente se detecta fluorescencia, si la secuencia de interés está presente en la muestra y hay amplificación. Entre las ventajas de estas sondas podemos mencionar la alta especificidad de la reacción, debido a que sólo se genera fluorescencia si la reacción específica de la PCR ha ocurrido y la posibilidad de detectar y cuantificar múltiples targets en una única reacción de PCR mediante el uso de varias sondas distintas en la misma reacción. Entre las desventajas que presentan podemos señalar el diseño de las sondas que deben resultar específicas y no interferir con los primers; la necesidad de sintetizar una sonda distinta para cada target que se quiere detectar; y por último el mayor costo de la PCR debido a la incorporación de estas moléculas marcadas. Existen distintos modelos de sondas. Las más utilizadas son las sondas que se hidrolizan (sondas Taqman). Además se pueden mencionar las sondas conformacionales (Molecular beacons, Scorpions, donde lo marcado y diseñados especialmente son los primers) y las sondas de hibridación. El otro formato ampliamente utilizado son los agentes intercalantes de ADN. El mas empleado es el SYBR Green. El SYBR Green es una molécula que presenta la característica de no emitir fluorescencia cuando se encuentra en solución. En presencia de ADN doble cadena, el SYBR Green se intercala entre las cadenas de ADN emitiendo así una señal fluorescente. Este fluorocromo se agregar a la reacción de PCR junto con los otros reactivos. Si en la reacción de PCR hay amplificación, el SYBR Green se une al ADN de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo y va generando un aumento en la señal de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto generado durante la amplificación. Hay que tener en cuenta que esta reactivo no es específico de una secuencia determinada y por lo tanto se intercala con el ADN doble cadena que puede corresponder tanto a productos de amplificación específicos como inespecíficos. Para evitar la generación de señal inespecífica, que llevará a resultados equivocados, es muy importante la optimización de la reacción de PCR de manera tal de evitar la formación de productos inespecíficos de PCR. Entre las ventajas que presenta con respecto a las sondas se pueden mencionar que dado que no necesita la síntesis de sondas marcadas es un método más económico. Por otro lado, puede ser utilizado para la detección y cuantificación de diferentes secuencias sin necesidad de sintetizar sondas diseñadas específicamente para ello. Entre las desventajas, en comparación con las sondas fluorescentes, podemos mencionar su menor especificidad y el hecho de que no es posible la cuantificación de diferentes targets en una única PCR. Si bien generalmente se menciona en la bibliografía sobre el tema que la especificidad es menor a la que se obtiene utilizando sondas fluorescentes, es posible lograr alta especificidad. Para ello algunas de las estrategias a utilizar son: La optimización de la reacción de PCR para la amplificación de un único producto, asegurándose la ausencia de productos inespecíficos. El análisis de los productos de amplificación a través de la lectura de la temperatura de fusión (melting point). Esta temperatura (Tm) es aquella en la cual la mitad de las cadenas de ADN están como doble cadena y la otra mitad están desnaturalizadas. Es propia y específica de cada producto de amplificación, dado que dependen del tamaño del producto amplificado y de la composición de las bases del mismo. Para llevar a cabo este análisis, al final de la PCR se programa el equipo para realizar un paso más. Este consiste en aumentar la temperatura muy despacio desde una temperatura baja (60ºC) a una temperatura alta (95ºC). Durante todo el proceso se monitorea constantemente la fluorescencia generada y esta señal es recolectada por el equipo. A bajas temperaturas todos los productos de PCR están en la conformación de doble cadena, por lo tanto el SYBR Green se une a ellos y la emisión de fluorescencia es máxima. A altas temperaturas, los productos se encuentran desnaturalizados resultando en un rápido descenso en la señal de fluorescencia. Al llegar a la temperatura de fusión, se produce un brusco descenso en la señal de fluorescencia. Este descenso es detectado por el equipo y graficado. Así, se obtiene un grafico de fluorescencia en función de la temperatura, donde se observa un pico (en la primera derivada de este gráfico) que corresponde a la temperatura de fusión del producto. Si la reacción ha sido puesta a punto de manera adecuada, solo se espera ver la presencia de un pico que corresponde al producto de interés. Con el método de SYBR Green y analizando las curvas de melting, es posible diferenciar los aporte a la señal de fluorescencia generada por los distintos productos (sean estos específicos o inespecíficos). Generalmente los productos inespecíficos formados presentan temperaturas de fusión (Tm), menores a la del producto específico. Cuantificación Absoluta Determina la cantidad absoluta de muestra (expresado como número de copias o concentración) Se determina utilizando estándares externos. Estos estándares poseen secuencias que 17 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 son iguales o muy similares a la secuencia target y los sitios de unión al primer son también idénticos. Esto asegura eficiencias de amplificación equivalentes de las moléculas estándar y target. La curva estándar es generada utilizando diluciones seriadas de los estándares. Comparando los CT (ciclo umbral, ciclo en el cual se detecta por primera vez fluorescencia) de cantidades desconocidas de templado con los de la curva estándar permite el cálculo de la cantidad inicial de templado usado en la real-time PCR. inespecíficos y resultara en un inadecuado análisis de las curvas de melting, ya que estas se llevan a cabo una vez completada la corrida. Controles del proceso Dada la alta sensibilidad de la técnica de PCR, es necesario siempre descartar la ausencia de contaminación. Para ello se utilizan controles negativos para el control de contaminación de reactivos o de la matriz a analizar, así como para chequear la ausencia de falsos positivos productos de reacciones inesCuantificación Relativa pecíficas. Para ello, se utilizarán como controles de la reacDetermina la relación entre la cantidad de muestra blanco y ción de PCR: la molécula de referencia, usualmente un gen de referencia. Este valor normalizado puede ser utilizado para comparar Control negativo de PCR. Este control contiene todos los expresión diferencial de genes en muestras diferentes. El componentes de la reacción excepto el templado (ADN). caso de aplicación más común de este método es el análisis Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación de la expresión génica o la determinación de la abundancia específica). Se lo utiliza para descartar la contaminación en de RNA. El nivel de expresión de las moléculas de referen- los reactivos de PCR utilizados. cia, como un gen de referencia de expresión estable, no debe Control negativo de matriz. Este control es una muestra variar bajo ninguna condición experimental, o aún en dife- que no presenta la secuencia target. Esta muestra sigue el rentes estadios del mismo tejido (por ejemplo enfermedad vs. mismo proceso que las muestras a detectar. Su resultado Muestras normales). Por lo tanto el nivel es utilizado como debe indicar ausencia de amplificación específica. Se la utiliun valor de referencia para la cuantificación. za para descartar la presencia de contaminación desde la extracción de ADN hasta la PCR. Consideraciones generales útiles en PCR Diseño de primers Además de los controles negativos se incluyen siempre controles positivos. Ellos permiten la evaluación al final del Longitud 18-30 nucleotidos proceso de la eficiencia, la especificidad y la sensibilidad de Contenido 40-60% la reacción. Asimismo, permiten detectar la presencia de de GC sustancias inhibidoras que afectan la reacción de PCR. Se Tm= 2ºC x (nº de [ A+T] + 4ºC x ( nº de[ utilizan muestras que contienen la matriz y la secuencia de C+G] ) ADN a determinar. Ellas son incluídas desde el comienzo de Tm La temperatura óptima de annealing debe ser unos grados por debajo de la Tm (alrede- la reacción y acompañan todo el proceso. dor de 5ºC) Generación de curvas estándar Longitud ideal del producto entre 100- Para generar una curva estándar para PCR en tiempo real, se 150 pb. necesitan al menos 5 concentraciones conocidas y la canti Evitar la complementariedad de 2 o más dad de la muestra desconocida debe caer dentro de ese ranbases en los extremo 3´ de los pares de go. Los estándares deben poseer el mismo sitio de unión al primers para reducir la formación de díme- primer, la misma secuencia entre los sitios de unión al priros. mer, y las mismas secuencias río arriba y río abajo de la se Evitar seguidillas de 3 o más Guaninas en cuencia a amplificar que la muestra a ser cuantificada. Secuencia el extremo 3´. Evitar que el extremo 3´ termine con Objetivos del TP demostrativo: Timina ya que tienen una alta tolerancia a Entender el procedimiento, técnica y exigencia en el diseño los missmatch. de una reacción o experimento basado en la tecnología de Evitar la complementariedad de secuen- qPCR. cias dentro de la secuencia del primer y Conocer la metodología de análisis de una qPCR cuantitativa entre los pares de primer. y cualitativa. Interpretar curvas y analizar resultados de experimentos de qPCR. Número de ciclos Por lo general los programas constan de 35 a 45 ciclos, pero Conocer la complejidad, costo y rigurosidad de la técnica se pueden llevar a cabo hasta 55 ciclos. Sin embargo, llevar a para poder decidir su aplicación en el futuro. cabo tantos ciclos aumentará el background de productos Ejemplo: Grafico de la corrida de PCR (Equipo LightCycler de Roche) - Metodología: SYBR Green - Análisis: Detección del Promotor 35S en muestras de maíz. Cuantificación absoluta 18 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 TP 5 DETECCIÓN DE Sclerotinia sclerotiorum EN CAPÍTULOS DE GIRASOL Federico Ehrenbolger requiere de un método de extracción técnicamente senPARTE I: Extracción y cuantificación de cillo, rápido y eficaz. ADN S. sclerotiorum es un hongo necrotrófico. Se han reportado alrededor de 400 especies susceptibles a este patógeno. Algunos hospedadores son: girasol, soja, colza, tomate, lechuga y cítricos entre otros. La podredumbre húmeda del capítulo (PHC) es causada por la fase sexual del hongo, a partir de fructificaciones conocidas como apotecios que producen ascoesporas. Este hongo también produce en la Argentina la podredumbre basal del tallo (PBT) desde los esclerocios, que germinan y producen un micelio blanco que invade los tejidos de las raíces superficiales y la base del tallo. Esta fase no alcanza el nivel de importancia de la podredumbre del capítulo. La etapa de mayor sensibilidad para el inicio de la infección que conduce a la PHC es la floración, si las esporas llegan y se depositan en el disco floral coincidiendo con condiciones favorables (al menos dos días con humedad ambiental de 100%), germinan produciendo un micelio blanco que comienza a desarrollarse entre las flores, penetra a través de ellas, invade el capítulo y continúa hasta receptáculo. Dentro del receptáculo el hongo puede o no desarrollarse. A medida que el micelio avanza va consumiendo tejido y pudriendo zonas del receptáculo. Cuando ya no queda material fácilmente asimilable para el hongo, el micelio comienza el proceso de concentración e inicia la producción de esclerocios de resistencia. Los esclerocios vuelven al suelo como fuente de nuevo inóculo. La aparición de un micelio blanco algodonoso del hongo en el frente del capítulo es el primer signo de la presencia de la enfermedad, aunque no siempre es visible. Alrededor de 15 días post infección, pueden verse manchas de color marrón claro localizadas en la parte trasera del receptáculo. Estas manchas tienen de 3 a 7 cm de diámetro y en ellas un dedo puede introducirse fácilmente ya que hay pudrición blanda. Si la enfermedad avanza los síntomas de la podredumbre pueden abarcar todo el capítulo y provocar la caída total o parcial, dejando en la parte superior del tallo sólo fibras aisladas en forma de escoba. Detección del patógeno fungíco: Debido a las dificultades que se encuentran para identificar síntomas a tiempos cortos post-inoculación artificial, se han desarrollado técnicas basadas en PCR para identificar la presencia o ausencia del hongo en un capítulo de girasol. Se han desarrollado primers para amplificar por PCR una región microsatélite que generan fragmentos específicos para S. sclerotiorum y no generan productos inespecíficos, ni siquiera contra el hongo filogenéticamente más cercano, Botrytis cinérea. Extracción de ADN El primer paso en el diagnóstico basado en técnicas de detección a nivel de ADN es la purificación de esta molécula de los otros componentes de la muestra. Generalmente, en este tipo de estudios el número de muestras a analizar es muy grande y, por lo tanto, se En la literatura se encuentran descriptos distintos métodos de extracción de ADN que varían principalmente en la clase de material del cual se parte (especie determinada, medio de cultivo, etc) y en la calidad del mismo (tejido fresco; tejido liofilizado; etc.). Pero, los protocolos son básicamente similares con algunas modificaciones tratando de resolver los problemas específicos de la especie bajo estudio. Electroforesis La técnica de electroforesis fue desarrollada hace unos 50 años, ganando fuerte aceptación a partir de la década del 60. La técnica se basa en el movimiento de moléculas (proteínas –como isoenzimas- ácidos nucléicos) a través de una matriz soporte (almidón, agarosa, acrilamida) con un buffer (TBE, TAE, etc.). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas de acuerdo con su tamaño y carga eléctrica neta que poseen al ser sometidas a un campo eléctrico. En el caso de los ácidos nucléicos, el grupo fosfato es responsable de la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. Como la carga eléctrica neta de los fragmentos es negativa, la separación ocurrirá sólo en base al tamaño de los mismos. Es posible verificar la separación de fragmentos de ADN de entre 100 pb a 60 kb utilizando agarosa (una forma refinada del agar extraído de las algas marinas). El proceso de separación de fragmentos de ADN por electroforesis depende básicamente del tamaño de los fragmentos, de la concentración de la agarosa y del voltaje aplicado. Durante la electroforesis, como la agarosa actúa como si fuese un filtro separando los fragmentos de diferentes tamaños, se observa que los fragmentos menores migrarán más rápidamente en la dirección del polo positivo, en tanto que los fragmentos de mayor tamaño lo harán más lentamente. Así, fragmentos de diferentes tamaños son separados a lo largo del gel. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo de la matriz, permitiendo obtener una mayor separación de los fragmentos de menor tamaño. Por otro lado, una reducción en la concentración de agarosa, favorece la separación de fragmentos mayores. Un incremento del voltaje, aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos a lo largo de la matriz. De esta forma, conociendo estas variables se pueden adecuar las condiciones ideales para proceder a la separación de fragmentos de ADN de distintos tamaños. Actualmente, se disponen de kits comerciales para realizar extracciones de todo tipo. Estos productos comerciales permiten la obtención de extracciones de alta pureza y reducen los tiempos de trabajo en gran medida, razón por la cual conviene evaluar la disponibilidad de recursos y la reducción de tiempos. Cuantificación de ADN 19 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 Existen varias técnicas utilizadas en la cuantificación del ADN. Algunas dependen del empleo de equipamientos costosos, como espectrofotómetros, mientras que otras, menos precisas, son simples y económicas. La elección de uno u otro método depende básicamente de la disponibilidad de equipamiento y de los objetivos del experimento a realizar con ese ADN. Una técnica simple utilizada para la cuantificación del ADN es el análisis comparativo de muestras coloreadas con bromuro de etidio en geles de agarosa. Para lo cual se requiere disponer de un ADN patrón de concentración conocida (como por ejemplo, ADN del fago lambda). La técnica consiste en la utilización de una secuencia ascendente de concentraciones de solución patrón de ADN, pipeteadas lado a lado en un gel de agarosa en el cual también se cargan las muestras de concentración desconocida. Luego de someter el gel a electroforesis, éste se colorea con una solución de bromuro de etidio y se estima la concentración de las muestras estudiadas por observación comparativa con la banda de ADN patrón, mediante visualización con luz ultravioleta. De esta forma, se estima la concentración desconocida del ADN en cuestión. Asimismo, esta técnica permite controlar que el ADN aislado sea de alto peso molecular y no se encuentre degradado. El ADN nativo debe migrar como una banda nítida y compacta de alto peso molecular ya que se obtiene ADN de girasol junto con el ADN de Sclerotinia sclerotiorum. Objetivo del TP: Extracción de ADN a partir de tejido de girasol infectados con ascoesporas de Sclerotinia sclerotiorum. A su vez, detectar presencia o ausencia del hongo en los distintos tratamiento (inoculado y no inoculado).. Protocolo experimental NucleoSpin® Plant II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) 1) Agregue 200 ul de Buffer PL1 y 10 ul de RNase A en un eppendorf de 2 ml. Rotular el tratamiento del material. 2) A partir de capítulos macerados de girasol inoculados artificialmente con esporas del hongo, tome 20 mg del mismo. Coloque el tejido en el tubo que posee el Buffer PL1. 3) Vortexear la mezcla durante algunos segundos. 4) Incubar a 65ºC durante 30-60 min. 5) Centrifugar el lisado crudo a 11.000 rpm durante 5 mins a temperatura ambiente. 6) Transferir el sobrenadante a un tubo colector de 2 ml nuevo que contenga un filtro violeta provisto por el kit. Evitar llevarse el lisado precipitado. 7) Agregar 450 ul del Buffer Pc y mezclar varias veces pipeteando. 8) Poner un filtro verde en un tubo colector de 2 ml nuevo y pasar 700 ul de la muestra. 9) Centrifugar a temperatura ambiente por 1 min a 11.000 rpm y descartar elución. 10) Repetir desde paso 8: agregar 700 ul hasta agotar muestra. 11) Agregar 400 ul de solución PW1 al filtro verde y centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución. 12) Agregar 700 ul de solución PW2 al filtro verde y centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución. 13) Agregar 200 ul de solución PW2 al filtro verde y centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución. 14) Centrifugar durante 2 mins a 11.000 rpm el filtro y la columna para secar completamente la membrana de silica. 15) Pasar el filtro verde a un eppendorf de 1,5 ml nuevo. 16) Agregar 50 ul de buffer de Elución PE a 65ºC y centrifugar a temperatura ambiente por 60 segs. 11.000 rpm. 17) Repetir una nueva elución con 50 ul de Buffer PE a 65ºC. 18) Decartar filtro verde y guardar el ADN extraido a 20ºC hasta su utilización. Electroforesis 1) Arme un minigel de electroforesis (0,8% agarosa en TAE 1X): derrita la agarosa en el horno de microondas, mezclando un par de veces durante este proceso. Enfríe a 55°C aproximadamente. Selle los extremos de la cama con cinta adhesiva de papel, acomode el peine y vuelque la agarosa. Elimine toda burbuja. Deje solidificar (20 minutos, aproximadamente). Retire el peine y la cinta adhesiva. Coloque la cama que contiene al gel en una cuba de electroforesis. Coloque suficiente buffer TAE 1X como para llenar la cuba, cubriendo unos 0,5 cm el gel. 2) Cargue un volumen de cada muestra (a la que se le habrá adicionado buffer de carga, azul de bromofenol) en los pocillos del gel (wells). La decisión sobre cuántos microlitros cargar en el gel dependerá básicamente del tamaño de los pellets obtenidos, de la viscosidad de la solución de ADN y de la experiencia anterior con el material. Comúnmente, se carga de 1 a 5 μl de la solución de ADN extraído. Lado a lado con las muestras siembre cantidades conocidas del ADN patrón, procurando tener una franja de concentraciones en las cuales las muestras extraídas se encuentren. Generalmente, con esta minipreparación se obtienen concentraciones de 10 a 200 ng/μl. Por lo tanto, es interesante cargar cantidades crecientes como 10, 50, 100 y 200 ng del ADN de referencia. 3) Corra las muestras a voltaje constante (3 V/cm2) hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado 2 cm aproximadamente. 4) Retire la cama de la cuba y tiña el gel en una solución de bromuro de etidio 1 μg/ml durante 20 minutos con agitación constante. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante la manipulación del gel. 5) Enjuague el gel en dH2O por 10 minutos (se pueden evitar los pasos de tinción y enjuague si se agrega el bromuro de etidio a la agarosa ya derretida, antes de volcarla en la cama). Coloque el gel sobre un transiluminador de luz UV y fotografíe. 20 Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente dañina para los ojos. Para minimizar la exposición, asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también mutagénica y carcinogénica. 10X TAE Buffer: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7 mM EDTA STOCK 1 litro Tris Base (PM=121,10) 48,40 g NaOAc (PM=82,03) 4,10 g Na2EDTA (PM=380,20) 2,92 g ddH2O a volumen Ajustar el pH en 8,0 con ácido acético glacial. 6) Observando la fotografía, estime la concentración de ADN extraído por comparación con el ADN patrón de concentración conocida. DETECCIÓN DE SCLEROTINIA SCLEROTIORUM EN MUESTRAS CAPÍTULOS DE GIRASOL PARTE II: Detección de secuencias específicas de Sclerotinia sclerotiorum mediante PCR Consideraciones generales Mediante la metodología de PCR, se amplificará un fragmento de la secuencia microsatélite M13, con un tamaño de 253 pb para S. sclerotiorum. Como control positivo de la extracción del ADN se amplificará la secuencia de la actina de girasol. Figura 1: Esquema de la amplificación mediante la técnica de PCR. Los primers se destacan como rectángulos negros) Objetivo del TP: Detectar mediante la técnica de PCR una secuencia específica de Sclerotinia sclerotiorum en DNA extraído de capítulos de girasol inoculados artifi- Reactivos H2O MilliQ Buffer 10X MgCl2 50 mM dNTPs 10 mM Iniciador F 10 M Iniciador R 10 M Taq plat.(10 U/l) ADN X l Concentración final ---1X 4 mM 100 M 2,5 M 2,5 M 0,05 U/l 15-30 ng totales Volúmen final Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente con Vortex, aplicar un spin de centrífuga y enfriar en hielo. 4) Agregar 23 l de la Premix a cada tubo que ya tiene el ADN. Tapar bien. Dejar los tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador. PRECAUCIÓN: Una vez que la Taq polimerasa fue cialmente con el hongo necrotrófico o inoculados con agua. Protocolo experimental a) Material Cada grupo partirá del ADN extraído en la práctica anterior. b) Protocolo experimental b.1.) Reacción de amplificación Se llevará a cabo el siguiente procedimiento: 1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con marcador de alcohol, (utilizar uno para cada ADN y uno para el control negativo). 2) Pipetear 2ul de ADN (20-30 ng) en los tubos correspondientes y 2 l de H2O en el tubo “control negativo”. 3) Realizar una mezcla de reacción para cada uno de los pares de primers a evaluar (Premix) según la siguiente tabla: Volúmen x1 (l) 18,125 2,5 0,75 0,5 0,5 0,5 0,12 2 Volúmen total l l l l l l l (por tubo) 25 agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya que la enzima pierde irreversiblemente actividad a temperatura ambiente. El programa de amplificación es el siguiente: 1 ciclo 95 C, 5 min (desnaturalización inicial) 40 ciclos 94 C, 45 sec (desnaturalización) 21 57 C, 45 sec (hibridación) 72 C, 45 sec (hibridación) 1 ciclo 72 C, 10 min (extensión final) 16 C, infinito (conservación de las muestras) 5) Una vez terminado el programa, agregar a la muestra 5 l de Buffer de Carga y guardar en freezer a -20C hasta el momento de la visualización de los resultados. b.2) Visualización de los productos de amplificación Los productos de amplificación serán resueltos por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Para ello, se procederá de la siguiente manera: 6) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria de agarosa en el volúmen apropiado de buffer TAE (Tris-Acetato -EDTA) 1X para obtener una concentración final de 1,5%. 7) Colocar la mezcla de agarosa en el horno microondas y calentar a baja potencia hasta el primer hervor. 8) Una vez fundida la mezcla, agregar el volúmen necesario de una solución de bromuro de etidio para obtener una concentación final de 0,5 g/ml en el gel. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante la manipulación del gel. 9) 10) Volcar la solución en la cama electroforética (ésta debe estar apropiadamente nivelada y tener el peine colocado). Eliminar toda burbuja. Esperar a que gelifique completamente antes de usar. Sumergir la cama junto con el peine en la cuba Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 6) electroforética, la cual debe poseer buffer TAE 1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Retirar cuidadosamente el peine y proceder a la siembra de las muestras (5-15 l por calle). La corrida electroforética se llevará a cabo a voltaje constante (8 V/cm) y los productos de amplificación se visualizarán bajo luz UV. PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente dañina para los ojos. Para minimizar la exposición, asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también mutagénica y carcinogénica. 7) Observe los patrones de amplificación obtenidos, detecte presencia o ausencia de la banda específica esperada y analice los resultados. c) Soluciones empleadas TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM EDTA Tris base (PM=121,10) 48,40 g/l Na2EDTA (PM=380,2) 2,92 g/l NaOAc (PM=82,03) 4,10 g/l Ajustar el pH en 8,0 con Ácido acético glacial Buffer de carga Azul de Bromofenol Ó xylen cyanol Glicerol 2 mg/ml 40% (v/v) TP 6: Silenciamiento génico como sistema de defensa contra virosis Gabriela Conti, A. Venturuzzi El objetivo del Trabajo Practico es demostrar el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) de un transgén a nivel local y la supresión del mismo proceso por la actividad de una proteína viral (supresor) en hojas de Nicotiana benthamiana de genotipo silvestre (wt) y en hojas de N. benthamiana de la línea 16C transgénicas para GFP. Esquema general del proceso a nivel molecular p35S pBin61-GFP Transcripción pBic- dsGFP GFP RNAdc Cap GFP mRNA PolyA GFP Traducción GFP siRNAdc P19 pBin61-HcPro GFP siRNA Esquema de los vectores utilizados Con estos plásmidos: pBin61-GFP pBic-dsGFP KanR 50 ug/ml pBin61-HcPro se transforma Agrobacterium thumefaciens GV3101 RifR 100 ug/ml, GentR 40 ug/ml 22 p35S LB Fitopatología Molecular Julioo-Agosto 2014 GFP/dsGFP/P19 t35S tnos pBin61/pBic Ntp II pnos RB Ntp II ori V Preparación de las bacterias para infiltrar 1) Estriar en una placa de LB agar con los antibióticos apropiados las bacterias portando los distintos plásmidos. Incubar durante dos días a 28C. LB agar + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml 2) Inocular con una colonia aislada 3 ml de LB líquido en un tubo de cultivo con los antibióticos apropiados. Incubar con agitación (200 r.p.m) a 28C ON. LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml 3) Inocular con los 3 ml del cultivo obtenido 30 ml de LB líquido e incubar con agitación (200 r.p.m) ON a 28C. LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml Acetosiringona 20 µM 4) Centrifugar el cultivo de bacterias durante 10 minutos a 4.000 r.p.m y a 4C. Resuspender las bacterias en Solución de MES. Llevar a OD600=1. Incubar las bacterias a temperatura ambiente al menos durante 2 horas (puede ser ON). Para las co-infiltraciones se realizan mezclas de partes iguales de la agrobacterias portando los distintos plásmidos. Solución de MES + acetosiringona 100 µM Nota: Al resuspender las bacterias con la solución de MES utilizando el mismo volumen que el de LB utilizado para crecerlas (en este caso 30 ml) se obtiene una suspensión bacteriana de OD600 ≈ 1. 5) Agroinfiltrar hojas en la cara abaxial con la suspensión bacteriana utilizando una jeringa. Material Vegetal Plantas de N. benthamiana wt y de la línea 16 C de aproximadamente un mes de edad. Deben ser plantas saludables en etapa vegetativa de un estado intermedio de desarrollo. Esquema de agroinfiltración (Expresión de GFP vista al UV después de 4 días post-agroinfitlración) pBin61-GFP pBic- dsGFP pBin61-GFP pBic- dsGFP pBin61-GFP + pBic-dsGFP pBin61-GFP + pBic-dsGFP + pBin61-HcPro pBin61-GFP + pBin61-HcPro pBic-dsGFP + pBin61-HcPro N. benthamiana wt N. benthamiana 16C Tejido expresando GFP 23 Fitopatología Molecular Julio-Agosto 2014 Medios, soluciones necesarias y antibióticos necesarios LB Extracto de levadura 5 g/L Bactotriptona® 10 g/L NaCl 10 g/L Agua csp 1 L Ajustar a pH 7,5 con NaOH 5 M LB – Agar: Agregar a 1L de LB Solución de MES MES (ácido N-morpholinoetanesulfonico) 10 mM MgCI2 10 mM Agua bidestilada Autoclavar la solución. Rifampicina [100 mg/ml] Disolver 100 mg de rifampicina en 1 ml de Metanol, esterilizar la solución por filtrado (filtro de 0,22 micrones). Consevar a 20C (la rifampicina es fotosensible por lo que es conveniente envolver el eppendorf con papel de aluminio) Gentamicina [25 mg/ml] y kanamicina [50 mg/ml] Disolver la cantidad adecuada de antibiótico en agua bidestilada, esterilizar la solución por filtración y conservar a -20C. Acetosiringona [200 mM] Disolver 40 mg de acetosiringona en 1 ml de DMSO. Conservar a -20C. Referencias Vazquez Rovere, C.; Bazzini, A.; Rodríguez, C.; Almasia, N; Asurmendi, S. Métodos para generar y analizar diversidad. Usos del Silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II - V. Echenique, C. Rubinstein, E. Hopp y L. Mroginski (eds), Editorial INTA, 2010, en prensa. Bazzini A.A, Mongelli V.C, Hopp H.E, Del Vas M, Asurmendi S (2007) A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10 (2), 178-190. yectos de genomas de organismos complejos. Hoy, con la difusión de mas de 1000 genomas completos de diversos organismos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio de otros tantos, con más de 150 billones de pares de bases depositadas en GenBank, estamos transitando la era post genómica, iniciada a mediados de la década del 2000. Actualmente el énfasis esta puesto no solo en la secuenciación de genomas de especies aun no descifrados total o parcialmente sino en la resecuenciación de genomas conocidos, para la identificación de variantes alélicas asociadas a diversidad fenotípica, en distintas especies de importancia económica, con importantes avances para el genoma humano (The International HapMap Consortium, 2003, 2005; The ENCODE Project Consortium, 2004). Esto es posible gracias al desarrollo de diferentes tecnologías e instrumental en continuo proceso de actualización (ver ej. en Tabla 1). La secuenciación capilar con equipos como el Applied Biosystems Incorporated (ABI) 3130 que se utilizará en esta práctica, permite la lectura simultánea de distintas muestras (16, para este equipo), con muy buena resolución y lecturas largas de hasta 800 bp, utilizando distintos fluoróforos. Los fluoróforos mas comúnmente usados son los basados en el colorante rhodamine (R110, REG, TAMRA and ROX) que son excitados a una longitud de onda de 488 nm y emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (Figura 1a). ABI desarrolló un sistema de terminadores llamados “Big Dye terminators” que son utilizados en la secuenciación automática (Figura 1b) Figura 1a TP Nº 7: Secuenciación por Electroforesis Capilar de Fragmentos Fluorescentes Andrea Puebla Las estrategias de secuenciación basadas en el método de terminación de la cadena por incorporación de nucleótidos dideoxi (ddNTPs) desarrollado por Sanger mas de 30 años atrás han sufrido un proceso de cambio y superación continuo desde la detección de moléculas radioactivas en geles hasta la actual detección fluorescente mediante secuenciación en paralelo en microcapilares o las estrategias de secuenciación en fase sólida basada en chips (Tabla 1). La incorporación de sistemas de detección fluorescerente en la década del 80 permitió el inicio de la secuenciación genómica y la entrada, en la década del 90, en la era genómica, con los reportes de los primeros genomas completos de E.coli y C. elegans y el inicio del proyecto Genoma Humano cuyo borrador fue liberado en 2001 y finalizado oficialmente en Abril 2003. El desarrollo de secuenciadores automáticos basados en electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los sistemas de detección fluorescentes y el desarrollo de herramientas de análisis de secuencias a gran escala posibilitaron el desarrollo de estrategias de secuenciación mas eficientes con el consiguiente abaratamiento de costos unitarios, y el concomitante desarrollo de números pro- Parte A: Ensayo de secuenciación de ADN con Terminadores fluorescentes y secuenciador automático Objetivo: Cuantificar ADN por fotometría y fluorometría (Spectra Max Gemini EM) Realizar una reacción de secuenciación de ADN utilizando diferentes templados (plásmidos, productos de PCR y BAC/COS). Purificar por precipitación las reacciones de secuenciación. 24 Fitopatología Molecular Julio-Agosto 2014 Preparar las muestras manualmente y con estación de trabajo para análisis en secuenciador automático. Realizar la electroforesis capilar de los productos de secuenciación en secuenciador automático (Genetic Analyzer 3130xl, Applied Biosystems) Materiales: ADN (distintos templados). Iniciadores universales y específicos para cada templado particular. Fluoróforo para cuantificación por fluorometría (Hoechst en buffer TNE) ADN control de timo de ternera para la curva estándar. Kit de secuenciación con terminadores fluorescentes (Big Dye Terminador v3.1, Applied Biosystems). EDTA 125 mM, etanol absoluto y etanol 70% para precipitación. Formamida HiDi. Polímero comercial para la electroforesis capilar de fragmentos de ADN. Buffer con EDTA para electroforesis capilar. Equipamiento: Espectrofotómetro: Nanodrop ND-1000 (Thermoscientific). Espectrofluorómetro: Spectra Max Gemini EM. Termociclador de 96 pocillos: GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) Sistemas automatizados para manejo de líquidos: Biomek FX (Beckman Coulter). Secuenciador automático de 16 capilares: Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems) Equipamiento general de biología molecular Curva Std Promedio Actividades 1) Cuantificación de ADN [cc] 15 27 57 116 150 215 305 Reacción ¼ X BDT v3.1 5 x Seq Buffer Primer 5 mM (5 pmol) Templado (conc. vs) Agua calidad ultrapura Volúmen 1 ul 1.5 ul 2ul hasta 10ul VF Elongación en termociladores 96°C 1 min. 25 ciclos 96°C 10 seg. 50°C 5 seg. 60°C 4 min. Purificación por precipitación Agregar: 2,5 l EDTA 125mM + 30 l Etanol absoluto. Centrifugar 45 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión. Agregar: 120 l Etanol 70%. Centrifugar 15 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión. Secar precipitados a 37ºC por 30 min. 3) Preparación de muestras para electroforesis en secuenciador automático con sistemas automatizados para manejo de líquidos F 19 106 193 428 542 842 1197 Tipo de templados y concentración requerida: Templado Concentración Productos de PCR 100-200 pb 5 ng/ul 200-500 pb 15 ng/ul 500-1000 pb 30 ng/ul 1000-2000 pb 60 ng/ul mayor a 2000 pb 75 ng/ul ADN doble cadena 200 ng/ul ADN simple cadena 100 ng/ul BAC/Cósmidos 200 ng/ul Cuant HOECHST - SEQ#08y09 - 20/01/2009 y = 0,2591x R2 = 0,9954 350 300 cc 250 200 150 100 2) Reacción de secuenciación y purificación 50 Preparación de la Mix de seq 0 0 200 400 600 800 F 1000 1200 1400 25 Fitopatología Molecular Julio-Agosto 2014 TABLA 1 (adaptada de Mitchelson et al 2007. En: New High throughthput Technologies for DNA sequencing and Genomics. Ed K. Mitchelson , Elservier, UK) 1 C15 C27 C57 C116 C150 C215 C305 C0 2 C15 C27 C57 C116 C150 C215 C305 C0 3 Muestra1 Muestra2 Muestra3 Muestra4 Muestra5 Muestra6 Muestra7 Muestra8 4 Muestra9 Muestra10 Muestra11 Muestra12 Muestra13 Muestra14 Muestra15 Muestra16 Electroforesis capilar en secuenciador automático con sistemas automatizados para manejo de líquido PARTE B: Análisis de Secuencias de ADN utilizando el programa Sequencing Analysis 5.1 Sequencing Analysis Objetivo: Analizar los resultados de las corridas electroforéticas de secuencias de ADN provenientes de distintos tipos de templados, editar los resultados obtenidos y discutir la calidad de los mismos. Materiales: Archivos de las corridas electroforéticas de secuencias de ADN realizadas en el secuenciador autómatico ABI 3130 xl con el programa Data Collection 3.0 (CD). Computadora con el programa Sequencing Análisis 5.1 Actividades PROYECTO 1 1. Adicionar muestras al programa en Sample Manager. 2. Setear Analysis Protocol para este proyecto: a. General: Nombre Seq File Format: Write Standard Chromatogram Format File b. c. d. Basecalling: a. b. c. d. e. KB.bcp POP7.BDTv3.mob True Profile Ending base: After 1000bp Quality Threshold: Do not assign N’s to Basecalls. Mixed Bases: Desactivado Clear Range: Desactivado 3. Apply to all Samples Done 4. Indicar analisis de Base Calling (BC) ANALIZAR 5. Revisar: Raw EPT Annotation: o Sample Name o Capillary 26 o o o Bases detected Average Signal Intensity Simple Store Sequence View: Barras de Calidad e Indice de Phred Electropherogram View: editar bases GUARDAR PROYECTO 2 Y 3: Cambiar seteo: Base calling: Quality Threshold: Assign N’s to Basecalls. Mixed Bases Clear Range Reanalizar los datos y discutir diferencias. Algunas Reglas Básicas de Higiene y Seguridad en Laboratorios Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja. 1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionar alarmas, etc. 2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse. 3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas. 4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 8. No se permitirá pipetear con la boca. 9. No se permitirá correr en los laboratorios. 10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto. 11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación. 12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deberá estar adecuadamente etiquetado. 13. No se permitirán instalaciones eléctricas precarias o provisorias. Se dará aviso inmediato a la Secretaría Técnica en caso de filtraciones o goteras que puedan afectar las instalaciones o equipos y puedan provocar incendios por cortocircuitos (Interno 355). 14. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc. Fitopatología Molecular Julio-Agosto 2014 15. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana. 16. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llamas directa o cerca de las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y de autoignición del producto. 17. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al taller. 18. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces. 19. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos. Consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275). 20. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5 litros.) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para el material en cuestión. 21. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente más pequeño, realice una conexión con una cadena del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente de manera de igualar potenciales y eliminar la posible carga estática. 22. Al almacenar sustancias químicas considere que hay cierto número de ellas que son incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones peligrosas. Ante dudas consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275). 23. No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, hágalo en estantes bajo mesadas y en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro de lo posible en bandejas de material adecuado. 24. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posición vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulación, protegidos de la humedad y fuentes de calor, de ser posible en el exterior. 25. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 26. Se informará al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten dejar equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio. 27. Se anotará en un lugar visible desde el exterior los teléfonos de los responsables de cada laboratorio para que puedan ser consultados en caso de alguna anomalía verificada por el personal de Seguridad y Control en su recorrida fuera de los horarios habituales de trabajo. Procedimientos ante emergencias Emergencias médicas Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, se deberá proceder : 1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios. 2. Simultáneamente se tomará contacto con el Servicio Médico (Interno 482), o al Servicio Médico de Deportes (784-4351 / 3948) 3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarán asistencia de la Secretaría Técnica (interno 380) para que envíen personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad y Control o Servicios Generales según correspondan. 4. El Jefe de Departamento notificará el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad para su evaluación e informe, donde se determinarán las causas y se elaborarán las propuestas para modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones. -------------------------------------------------------CUPÓN PARA ENTREGAR AL DOCENTE Fecha: El/La alumno/a ............................................. de la materia Fitopatología Molecular ha leído minuciosamente la guía de Normas de Seguridad que acompaña esta guía. -------------------------------------------------------27