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Biología molecular de la interacción H-P. Silenciamiento, microRNAs Sebastian Asurmendi Los patógenos son biotrofos, necrotrofos o hemibiotrofos Biología molecular y genética de la Interacción H-P Necrotrófico Biotrófico Hemibiotrófico Estrategia de ataque Secretan enzimas degradativas, toxinas, o ambas Mayor contacto intracelular Fase inicial biotrófica y luego necrotrófica Características específicas de la interacción Primero muere el tejido vegetal y luego es colonizado por el patógeno Las células vegetales permanecen vivas y con daños mínimos Células vegetales vivas en la etapa inicial. Extensivo daño posterior Rango de hospedante Amplio Específico Intermedio Algunos conceptos generales •Interacción compatible: la planta resulta hospedante para el patógeno. • Interacción incompatible: la planta es no hospedante para ese patógeno particular. Esto ocurre en la mayoría de los casos, aún en condiciones que favorecen la infección. Por lo tanto, cada especie vegetal es susceptible a un número relativamente pequeño de patógenos específicos. * Las plantas poseen respuestas defensivas - preformadas - inducibles •Se produce enfermedad cuando: • Las defensas preformadas son inadecuadas. • La planta no detecta al patógeno y por ende no se producen respuestas defensivas inducidas (o se producen tardíamente). El triangulo de la enfermedad Plants are exposed to countless microbes, but very, very few of these interactions lead to disease. Why? The pathogen must be able to overcome plant defenses The disease triangle (it takes three) Environment The host plant must be susceptible to the pathogen The environment must tip the balance in favor of the pathogen Mecanismos de Defensa Las defensas de las plantas no son tan complejas como en los animales pero de todas formas son muy exitosas. Incluyen: Estructuras de defensa preformadas Factores que inciden en la contención de los patógenos: • Calidad y cantidad de las ceras en la superficie de hojas y frutos • Cantidad de pelos en la superficie de tallos y hojas • Grosor de las cutículas • Estructura y grosor de la pared externa de las células epidermales • Tamaño, forma y regimen de estomatas y lenticelas • Presencia de tejidos con paredes celulares engrosadas (haces de células esclerenquimatosas, xilema, haces de la vaina vascular, venas, etc.) • Compuestos químicos exudados o en vacuola: fenólicos, inhibidores del desarrollo, enzimas hidrolíticas, etc. La interacción hospedante patógeno produce masivos cambios de la expresión génica Resistomica : Estudio del conjunto de genes que participan en la defensa organizada ante el ataque de patógenos Inmunología molecular de plantas Sistemas activos de Defensa en Plantas (Inmunidad) •Inmunidad Innata/Defensa Basal •Defensa mediada por RNA Controlada por genes R Involucra una compleja serie de reacciones defensivas Tiene en primer instancia una respuesta rápida y localizada. Generalmente implica la muerte de la región del tejido invadida por el patógeno (Respuesta Hipersensible) Es un proceso coordinado temporal y espacialmente para reclutar sólo a las células necesarias en un rol defensivo Resulta en el desarrollo de condiciones desfavorables para el crecimiento y la reproducción del patógeno y en la detoxificación de enzimas y toxinas producidas por éste Sistema de Inmunidad Innata En la defensa a nivel de genes R se conocen 4 mecanismos: 1. El producto del gen R (dominante) inactiva una toxina producida por el patógeno que normalmente induce necrosis. Ej.:Hm1de maíz inactiva la toxina HC producida por al hongo Cochliobolus carbonum. 2. El producto del gen R es blanco de patogenicidad: su ausencia provoca resistencia. Ej.: T-urf13 mitoc de maíz es susceptible a la toxina T producida por el hongo Bipolaris maydis. 3. El producto del gen R prepara a la planta para respuestas defensivas. El único ej.: Mlo de cebada es un regulador negativo de las defensas. Su alelo mutado (recesivo mlo) confiere resistencia. Estructura de la proteína Mlo de cebada. El gen mlo confiere resistencia a Erysi-phe graminis f.sp. hordei y podría codificar a un receptor unido a una proteína G 4. El producto del gen R media el reconocimiento específico de un patógeno que expresa un gen de avirulencia (Avr) correspondiente. El reconocimiento específico del producto elicitor por el producto del gen R activa una cascada de respuesta que involucra PK, ROS, transcripción de genes de defensa (defensa inducida) como PR, y lleva a la HR. Factores de patogenicidad: imprescindibles para generar la enfermedad; no determinan los síntomas en forma directa Factores de virulencia: Factores de virulencia: Responsables de la sintomatología; modulan la gravedad de la enfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas degradadoras, fitohormonas) Factores de avirulencia: Requeridos para el reconocimiento del patógeno por parte de la planta Como los patógenos son reconocidos? Patrones de reconocimiento Bacterial pathogen Fungal or oomycete pathogen PRRs recognize pathogens outside the cell and initiate defense responses Many PRRs have an extracellular leucinerich repeat domain that recognizes conserved microbial elements….. ….and an intracellular kinase domain They are leucine-rich repeat receptor kinases (LRR-RKs) PRRs Reconocen PAMPs (pathogenassociated molecular patterns) Only a few PRR / PAMP pairs have been identified PAMPS Pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) also known as microbe-associated molecular patterns (MAMPS) Flagellin EF-Tu Pattern recognition receptors (PRRs) FLS2 EFR Ax21 unknown XA21 Other LRR-RKs PRRs Leucine-rich repeat receptor kinases chitin unknown CERK1 Other LysM PRRs LysM receptor proteins Adapted from Segonzac, C. and Zipfel, C. (2011). Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 14: 54-61. El reconocimiento del patogeno dispara la respuesta de defensa Calcium ion influx Reactive oxygen production Kinase cascade leading to transcriptional responses Defense responses This response is called pattern triggered immunity (PTI) Patógenos producen efectores que aumentan sus virulencia Plant proteins Calcium ion influx Kinase cascade leading to transcriptional responses Reactive oxygen production Microbial effectors suppress the plant’s immune response and / or contribute to the pathogen’s viability Proteínas de resistencia ( R) effector R protein R protein Defense responses R proteins recognize effectors intracellularly Note – no R genes that confer resistance to necrotrophs have been identified; this is a biotroph-specific type of resistance…. La activación de las proteínas R promueven la inmunidad disparada por efectores: ETI effector R protein Defense responses ETI is faster, stronger and more prolonged than PTI Transcription responses El modelo del ZIG Zag de la interacción planta patógeno Amplitude of defense High Pathogen effectors suppress defense response: Effector Triggered Susceptibility Defense responses Effector is “recognized”: Effector Triggered Immunity Pathogen is recognized: Pattern Triggered Immunity Low Defense responses Adapted from Jones and Dangl (2006) The plant immune system. Nature. 444: 323-329. Proteínas R Canónicas PRR Receptorlike kinase R proteins NBS-LRR eLRR TM KIN TIR NBS LRR CC NBS LRR NBS Nucleotide binding site LRR Leucine rich-repeat Canonical R proteins have a leucine-rich repeat (LRR), similar to the PRR extracellular domain (eLRR) The LRR domain confers specificity to the binding interaction eLRR TIR Toll interleukin receptor PK Protein Kinase CC Coiled coil effector LRR TM Transmembrane Slide courtesy Shunyuan Xiao Wang, C.-I.A., et al and Kobe, B. (2007). Crystal structures of flax rust avirulence proteins AvrL567-A and -D reveal details of the structural basis for flax disease resistance specificity. Plant Cell. 19: 2898-2912. Estructura de Proteínas R conocidas R type NBS-LRR-encoding genes are very diverse and abundant • Arabidopsis has ~ 149 NBS-LRR genes • Rice, poplar and potato have > 400 NBS-LRR genes • R genes are variable even between close relatives Integrated map of R loci in related grasses Rice Luo, S., Zhang, Y., Hu, Q., Chen, J., Li, K., Lu, C., Liu, H., Wang, W. and Kuang, H. (2012). Dynamic nucleotide-binding site and leucine-rich repeat-encoding genes in the grass family. Plant Physiol. 159: 197-210. El modelo del gen por gen (Harold Flor, ca. 1940) Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. Si estos genes se tornan recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad) Interacción entre proteínas R y Avr: directa o indirecta? • A pesar de la co-localización de las proteínas R y Avr respectiva, no se ha demostrado su interacción directa. • 3 observaciones dan evidencia de interacción indirecta: 1. Los ensayos de binding utilizando los ‘elicitors’ muestran afinidad con proteínas que no siempre son productos de genes R. 2. Por medio de 2-H se encontró interacción directa entre Pto (STK sin dominio LRR) y AvrPto. 3. Estudios de inmunoprecipitación revelaron co-inmunoprecipitación de complejos que contenían a las proteínas R más sus elicitores. Modelo Guardia Modos de accion de los Receptores R effector R protein In some cases the R protein binds the effector directly In some cases effector modifies the real binding partner of the R protein In some cases effector and another factor are recognized by the R protein Reprinted by permission of Macmillan Publishers Ltd. From Dodds, P.N. and Rathjen, J.P. (2010). Plant immunity: towards an integrated view of plant–pathogen interactions. Nat Rev Genet. 11: 539-548. Modelo de acción del receptor N resistencia a TMV Model for the Activation of N. Plant Cell. 2006 February; 18(2): 491–501.doi: 10.1105/tpc.105.037234. El modelos mas actual habla de que los genes R “vigilan”hubs Plant proteins were identified that interact with R proteins and effectors from the biotrophic oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis and Pseudomonas syringae. The results suggest that R proteins guard cellular proteins targeted by effectors Common target effector Rather than recognizing the effector, some R proteins recognize changes to its cellular targets R protein Reprinted from Mukhtar, M.S., et al. and Dangl, J.L. (2011). Independently evolved virulence effectors converge onto hubs in a plant immune system network. Science. 333: 596-601 with permission from AAAS. NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 11 | AUGUST 2010 Modelo del zigzag de la respuesta Inmune PTI: Inmunidad disparada por PAMPs ETI: Inmunidad disparada por Efectores Jonathan D. G. Jones1 & Jeffery L. Dangl2 NATUREjVol 444j16 November 2006 Vías de disparo de acciones mediadas por proteínas R Defense pathways intersect with other signaling pathways Defense responses reduce growth rate. Drought stress and abscisic acid (ABA) accumulation suppresses responses to pathogens Take home message: lots of information is integrated to determine the appropriate response Reprinted from Spoel, S.H., and Dong, X. (2008) Making sense of hormone crosstalk during plant immune responses. Cell Host Microbe 3: 348-351 with permission from Elsevier. Hormonas y respuesta Rajendra Bari and Jonathan D. G. Jones Plant Mol Biol (2009) 69:473–488 RESPUESTAS ACTIVADAS POR LOS GENES DE RESISTENCIA Los genes de resistencia activan distintas rutas de señalización en forma simultánea Estas rutas downstream incluyen kinasas, fosfatasas, factores inhibidores y activadores de la transcripción, formas reactivas de oxígeno, etc. La respuesta resultante se conoce como Respuesta Hipersensible (HR) Las respuestas no son específicas contra un determinado patógeno; incluyen el desarrollo posterior de la Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) Estas respuestas incluyen: Deposición de callosa Deposición de lignina Producción de fitoalexinas Producción de PRs Síntesis de ácido salicílico Muerte celular programada Callosa, ROS y phytoalexinas pueden frenar el ataque del patogeno Pathogen Spore Callose Cell wall Callose Plasma membrane Perception Golgimediated callose secretion Signal Production of phytoalexins, reactive oxygen species, and other defense compounds Reactive oxygen Callose, a polysaccharide, acts as a barrier, and ROS and phytoalexins are toxic to pathogens Mellersh, D.G. and Heath, M.C. (2001). Plasma membrane –- cell wall adhesion is required for expression of plant defense responses during fungal penetration. Plant Cell. 13: 413-424. La respuesta Hipersensible (HR) • Respuesta defensiva caracterizada por un rápido colapso del tejido vegetal (muerte celular) y el desarrollo de múltiples respuestas defensivas • Expresa componentes programados genéticamente. Se observa transcripción y traducción de novo • Mediada por distintas moléculas de señalización cuyas rutas interaccionan entre sí • Los sitios de HR constituyen puntos focales para la inducción de respuestas defensivas en las células vecinas No está claro aún si: • la HR confiere resistencia deprivando de nutrientes a los patógenos invasores o liberando compuestos antimicrobianos de las células afectadas. También podría operar matando simultáneamente a la célula y al patógeno • la muerte celular de la HR es un proceso genéticamente programado (suicidio) o si es una consecuencia de de la acción de productos tóxicos producidos por el patógeno La respuesta Hipersensible (HR) ROS is generated in the apoplast, in chloroplasts, and mitochondria ROS and SA act synergisticly Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd. Coll, N.S., Epple, P., and Dangl, J.L. (2011). Programmed cell death in the plant immune system. Cell Death Differ 18: 1247-1256; Torres, M.A., Jones, J.D.G. and Dangl, J.L. (2006). Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant Physiol. 141: 373-378.. Distintos tipos de respuestas inducibles A: Respuesta hipersensible. Célula de mesófilo de lechuga penetrada por haustorias de Bremia lactucae B: H2O2 en paredes célulares de lechuga infectadas por Pseudomonas syringae C: Formación de papilas en hojas de cebada infectadas por Erysiphe graminis D) Acumulación de HRGP en pecíolo de Brassicae infectado por Xhantomonas. campestris E: Deposición de calosa en hojas de Arabidopsis infectadas con P. parasitica F: Formación de lesiones en hojas de tabaco infectadas por TMV G: Lignificación en hojas de colza infectadas por Lethosphaeria maculans H: Formación de tilosas en xilema de cacao infectado por Verticillium dahlia I: Inducción del promotor de glucanasa en hojas de tomate infectadas por Cladosporium fulvum Respuestas inmediatas de las células invadidas Generación de especies reactivas de oxigeno Síntesis de oxido nítrico Apertura de canales iónicos Fosforilación/defosforilación de proteínas Reareglos del citoesqueleto Muerte celular hipersensible (HR) Inducción de la expresión génica Respuestas locales y activación génica Alteraciones en las rutas del metabolismo secundario Arresto del ciclo celular Síntesis de proteínas relacionadas con patogénesis (PR) Acumulación de ácido benzoico y de ácido salicílico Producción de etileno y ácido jasmónico Fortalecimiento de las paredes celulares (lignina, PGIPs, HRGPs) Respuestas sistémicas y activación génica Glucanasas (13) Quitinasas Peroxidasas Síntesis de otras proteínas PR Respuesta sistémica Señal???? Vista esquemática de los eventos asociados a la replicación y el movimiento de TMV. Vista dinámica de mecanismos de modulación de la inmunidad mediada por las diferente proteínas de TMV. Mecanismo de defensa mediada por ARN Manipulación de la expresión de la chalcone synthase para modificar la pigmentación Chalcone Synthase (CHS) Wild-type petunia producing purple anthocyanin pigments Chalcone synthase (CHS) is the enzyme at the start of the biosynthetic pathway for anthocyanins Anthocyanins Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. (2008) BMC Biotechnology 8: 25. Expectation – sense RNA production would enhance pigmentation... Endogenous gene Protein translated mRNA PRO ORF Transgene Sense construct: PRO ORF mRNA Extra protein translated Sense RNA mRNA mRNA ..and antisense RNA production would block pigmentation Endogenous gene Protein translated mRNA PRO ORF Transgene Sense construct: PRO mRNA Extra protein translated Sense RNA ORF mRNA mRNA Transgene Antisense construct: ORF PRO Antisense RNA Sense-antisense duplex forms and prohibits translation Surprisingly, both antisense and sense gene constructs can inhibit pigment production Plants carrying CHS transgene Sense OR CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : CHS Antisense Photo credit Richard Jorgensen Co-suppression is a consequence of siRNA production Wild-type Protein translated mRNA PRO ORF mRNA Endogenous gene Co-suppressed transgenic PRO ORF Co-suppression Sense RNA Sense construct PRO ORF siRNA produced mRNA Endogenous gene De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965–1970. El fenómeno de co-supresión del gen de la chalcona sintetasa en Petunia se debe al PTGS Parental Transgénicas Tomado de: Napoli et al., The Plant Cell, 1990. Silenciamiento genico 1990 Jorgensen : Introduction of transgenes homologous to endogenous genes often resulted in plants with both genes suppressed! Called Co-suppression Resulted in degradation of the endogenous and the transgene mRNA 1995 Guo and Kemphues: -injection of either antisense or sense RNAs in the germline of C. elegans was equally effective at silencing homologous target genes Contd…. 1998 Mello and Fire: -extension of above experiments, combination of sense and antisense RNA (= dsRNA) was 10 times more effective than single strand RNA Definition: the ability of double-stranded RNA (dsRNA) to suppress the expression of the gene which corresponds to the dsRNA sequence. Short history of post-transcriptional gene silencing Definition: the ability of exogenous double-stranded RNA (dsRNA) to suppress the expression of the gene which corresponds to the dsRNA sequence. (PTGS) siRNAS Genes Blanco Biogenesis de sRNAs RNA DOBLE CADENA ES EL INICIO DEL SILENCIAMIENTO Dicer and Dicer-like proteins In siRNA and miRNA biogenesis, Dicer or Dicer-like (DCL) proteins cleave long dsRNA or foldback (hairpin) RNA into ~ 21 – 25 nt fragments. Dicer’s structure allows it to measure the RNA it is cleaving. Like a cook who “dices” a carrot, Dicer chops RNA into uniformly-sized pieces. From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi Biogenesis de sRNAs Argonaute proteins ARGONAUTE proteins bind small RNAs and their targets. The Arabidopsis ago1 mutant and the octopus Argonauta argo ARGONAUTE proteins are named after the argonaute1 mutant of Arabidopsis; ago1 has thin radial leaves and was named for the octopus Argonauta which it resembles. Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS. Biogenesis de sRNAs Pequeños RNAs? Mecanismo en Animales y plantas RDR Amplification processes Transitivity effect El silenciamiento se propaga sistemicamente Movimiento sistemico Datos aun controversiales siRNAs – Genomic Defenders • siRNAs protegen el genoma de: La de virus invasores Transcripciones aberrantes Transposones y elementos repetitivos siRNAs también mantienen algunos genes en un estado epigenético Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato , N., and Lawton, M. (2001) Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: 848-853. Copyright 2001. Los mutantes para genes con rol en el silenciamiento son mas susceptibles a virus Tobacco Rattle Virus (TRV) silencing in wild-type Arabidopsis plants prevents disease symptoms. Mutants deficient in Dicer activity are unable to suppress viral infection. Double mutant of dcl2dcl4 inoculated with TRV WT Arabidopsis inoculated with TRV From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68–71. Reprinted with permission from AAAS. Silenciamiento como mecanismo de defensa antiviral RNA DOBLE CADENA? Gen Blanco ? → Genoma Viral Degradación Genoma Viral → no hay enfermedad El silenciamiento es un mecanismo de defensa antiviral Los virus poseen proteínas capaces de reducir el silenciamiento denominadas Supresores de silenciaminto RdRP By interfering with RNA silencing, the viral suppressor proteins can interfere with the plant’s viral defense mechanism. Suppressors can act at any step of the process. Mecanismo de Contra defensa: Supresores del silenciamiento Supresores Modo de Accion Chapman et al Estabilización de dúplex P19 y HcPro Degradación de AGO1 mediado por P0 Antiviral Immunity Directed by Small RNAs Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet RNA as Supressor CaMV Leader seq. Múltiples modos/sitios de acción de los supresores Antiviral Immunity Directed by Small RNAs Shou-Wei Ding and Olivier Voinnet El PTGS es un mecanismo de defensa frente a las infecciones virales 1. La infección natural de virus desencadena el silenciamiento. 2 La replicación viral puede ser suprimida si se induce el silenciamiento experimentalmente. 3 Los virus de plantas codifican para una gran variedad de supresores de silenciamiento. 4. Algunos componentes que participan del silenciamiento son regulados positivamente durante la infección por virus y viroides. 5 Las mutaciones en genes que codifican componentes que participan del silenciamiento inducen mayor susceptibilidad a las infecciones virales. Sistema inmune: Modelo del ZIGZAG Virus Regulación mediada por ncRNAs Estructuralmente muy parecidos aunque de Biogénesis y Función diferente Clase* Descripción Biogénesis y origen genómico Función miRNA Micro RNAs Regulación post-transcripcional de los transcriptos de un amplio rango de genes siRNAs primarios sRNAs pequeños interferentes Transcriptos de genes miRNAs forman estructuras secundarias de RNA doble cadena que son procesados por Dicer o por RNAsas tipo III Procesamiento de RNA doble cadena o de estructuras secundarias Por miembros de la familia Dicer siRNAs secundarios sRNAs pequeños interferentes tasi RNAs ( Trans acting siRNAs) natsi RNAs ( natural antisense transcriptderived siRNAs) Unión a RNAs targets complementarios, guía para la iniciación de siRNas secundarios Se forman por la actividad de RNA Regulación post transcripcional de polimerasas RNA dependientes, las los transcriptos, formación y cuales generan RNAs doble cadena mantenimiento de la heterocromatina. sRNAs que Transcriptos de genes TAS son Regulación post transcripcional de actúa en trans clivados por un mecanismo los transcriptos. dependiente de miRNAs, luego son convertidos en RNA doble cadena por RdRP, seguido del procesamiento por Dicer siRNAs Pares de transcriptos sense y Regulación post transcripcional de derivados de antisense son procesados por Dicer la expresión de genes transcriptos involucrados en mecanismos de antisentidos defensa y respuesta a stress naturales piRNAs RNAs que ( Piwi- interaccionan interacting con Piwi siRNAs) El mecanismo de biogénesis no se conoce completamente, sería dependiente de argonauta e independiente de Dicer Supresión de transposones y retroelementos en líneas germinales de moscas y de mamíferos. sRNAs clasificación por Tamaño • • • • • 21-22 bases siRNAs tasRNAs miRNAS Asociados a silenciamiento posttrasncripcional • 24-26 bases • sRNAs heterocromaticos • sRNAs provenientes de zonas repetitivas • Asociados a silenciamiento trasncripcional miRNAs y tasRNAs Biogenesis Complejo Risc Contiene Ago 1, 2, 7, ? Modo de Acción de los miRNAs Biogenesis de microRNAs Overview of miRNA processing pathways in plants and animals. Bologna N G et al. Briefings in Functional Genomics 2013;12:37-45 © The Author 2012. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com Structural determinants in animal and plant miRNA precursors. Bologna N G et al. Briefings in Functional Genomics 2013;12:37-45 © The Author 2012. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com Rol de los miRNAs Regulación post trasncripcional miRNAs are endogenous genes regulators/modulators Plantas C. elegans Allison C Mallory & Hervé Vaucheret Nature Genetics 38, S31–S36 (2006) Targets of some conserved miRNAs miRNA gene family Target gene family Function 156 SPL transcription factors Developmental timing 160 ARF transcription factors Auxin response, development 165/6 HD-ZIPIII transcription factors Development, polarity 172 AP2 transcription factors Developmental timing, floral organ identity 390 TAS3 (tasiRNA) which acts on ARF transcription factors Auxin response, development 395 Sulfate transporter Sulfate uptake 399 Protein ubiquitination Phosphate uptake Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511.. miRNAs and stress Virus infection alters miRNAs level Y. Watanabe‘s group SINTOMAS Virus and miRNAs pathway “Direct interaction” PTGS Suppressors alters miRNA. Chapman et.al miRNA alteration is a side effect of counter-defense suppressor activity Silencing (PTGS) as defense mechanism, PTGS suppressors as virus counter-defense NO todo los datos coinciden en todos los casos para explicar síntomas Acción INDIRECTA de sRNAs en la interacción viral microArray of miRNAs Profiling the whole miRdatabase along 3 time points after the infection (5,15, 22 dpi) Sample Inoculate ALTERACION DE NIVEL DE miRS ANTES DE QUE HAYA SUPRESOR HORMONAS Y DEFENSA Rajendra Bari and Jonathan D. G. Jones Plant Mol Biol (2009) 69:473–488 INTERACION INDIRECTA Vias superpuestas Cross talk: ABA, JA y SA Efectos no queridos = Sintomas miRs Promoter Analysis HAN-HUA LIU et al, RNA (2008), 14:836–843. miRNAs involved on the bacterial defense genes reprograming TuMV induced miR1885 Target Genes R like TIR-NBS-LRR sRNAs participate in the plant virus interaction in a complex way ‘host induced gene silencing’ (HIGS) sRNAs and Immunity Las plantas tienen RNA polimerasas adicionales que contribuyen al silenciamiento Complex Distribution Function RNA Polymerase I All eukaryotes Production of rRNA RNA Polymerase II All eukaryotes Production of mRNA, microRNA RNA Polymerase III All eukaryotes Production of tRNA, 5S rRNA RNA Polymerase IV Land plants Production of siRNA RNA Polymerase V Angiosperms Recruitment of AGO to DNA Most siRNAs are produced from transposons and repetitive DNA Chromosome Centromere Abundance of small RNAs Abundance of transposon/ retrotransposons Most of the cellular siRNAs are derived from transposons and other repetitive sequences. In Arabidopsis, as shown above, there is a high density of these repeats in the pericentromeric regions of the chromosome. Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57. Transcriptional gene silencing Small RNAs can initiate gene silencing through covalent modifications of the DNA or its associated histone proteins, interfering with transcription. Transcription Histone proteins DNA Silencing This form of silencing is frequently associated with stably silenced DNA including centromeres and transposons, but also occurs at genes. siRNAs can target DNA for silencing by cytosine methylation or by histone modification NH2 N O NH2 CH3 N N O N ~ ~ cytosine 5-methylcytosine The precise mechanisms by which siRNAs target DNA for silencing are not known, but involve the action of two plant-specific RNApolymerase complexes, RNA Polymerase IV (Pol IV) and RNA Polymerase V (Pol V). DNA methyltransferase DNA can be covalently modified by cytosine methylation, carried out by DNA methyltransferases. Histone modification DNA methylation Activated transposons in ddm mutantsAfterinduce mutations one After three After five Wild-type generation generations generations After DDM inactivation, plants become more and more abnormal as they accumulate transposon-induced mutations. Kakutani, T., Jeddeloh, J.A., Flowers, S.K., Munakata, K., and Richards, E.J. (1996) Developmental abnormalities and epimutations associated with DNA hypomethylation mutations. PNAS 93: 12406-12411. Copyright (1996) National Academy of Sciences, U.S.A. Epigenetic silencing of transposons by DNA methylation is necessary to maintain genomic integrity. Este fenotipo es producido por: Metilasas y Diferentes actores del sistema de silenciamiento (Pol IV) Kakutani, T., Jeddeloh, J.A., Flowers, S.K., Munakata, K., and Richards, E.J. (1996) Developmental abnormalities and epimutations associated with DNA hypomethylation mutations. PNAS 93: 12406-12411. Copyright (1996) National Academy of Sciences, U.S.A. Rol de los transposones? Generar variabilidad genética o Parte de una maquinaria de regulación genetica ? AMBAS? Epigenetic reprogramming in plants Large-scale epigenetic changes have been observed in the endosperm and in the vegetative nucleus of the male gametophyte. El estrés es una causa importante de reprogramación epigenética, esto incluye al estrés biotico Biotic or Abiotic Stress Hormones Stress signalling may or may not involve hormones Many stressresponsive genes are epigenetically regulated The stress-responsive phenotype is usually not transmitted to progeny, but chromatin changes can be heritable Reprinted from Gutzat, R. and Mittelsten Scheid, O. (2012). Epigenetic responses to stress: triple defense? Curr. Opin. Plant Biol. 15: 568-573, with permission from Elsevier. © 2013 American Society of Plant Biologists Estrés Genómico • En el hombre el 25% de los promotores tiene una porción de transposon o un “rastro” derivados de los mismos. • Regulación Coordinada? • Producción de epialelos? Nueva Capa de regulación? Impacto en el perfil de sRNAs endógenos luego de la infección viral
