Flavio-SJdeSouza-BiotecAnimal-1.pdf
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Manipulación genética de animales de laboratório parte I Conceptos y Técnicas en Biotecnología 2013 Flávio S. J. de Souza El ratón (Mus musculus) - principal modelo mamífero utilizado en investigación genética: - pequeño tamaño - rápida reproducción - disponibilidad de muchas cepas bien caracterizadas - existencia de muchos mutantes - disponibilidad de técnicas de manipulación genética transgénicos knockouts Origen del ratón de laboratorio Ancestral Mus musculus species 1 million years domesticus subspecies castaneus subspecies European ‘fancy’ mouse molossinus subspecies musculus subspecies East Asian ‘fancy’ mouse 2000 years 100 years Laboratory mouse Origen del ratón de laboratorio escritora infantil británica Beatrix Potter con su ratón mascota (1885) 35 w ee ks Ciclo de vida del ratón de laboratorio - ciclo de vida total: 63-77 días (c. 2 meses y 2 semanas) Ciclo de vida del ratón de laboratorio Reproducción del ratón de laboratorio oviducto división celular formación del blastocisto ovario ovulación implantación útero fertilización E2.5 = embryonic day 2.5 (2.5 días de desarrollo) Reproducción del ratón de laboratorio oocito de mamífero - arrestado en la meiosis II (metafase) hCG/LH meiosis I ovulation fertilisation meiosis II formation of pronuclei first division Blastocyst formation: early 8-cell stage compacted 8-cell stage morula (32-cell stage) inner cell mass blastocyst external cell compaction cavitation tigth junctions internal cell trophoblast cell blastocoel morula compaction blastocyst hatching Transgenesis zygotes (10-25 zygotes) microinjection microinjected zygotes Knock-out blastocysts geneticallymodified ES cells chimaeric blastocysts Blastocyst Fertilised oocyte trophoectoderm extraembryonic tissues inner cell mass extraembryonic & embryonic tissues morula Mouse development pre-implantación inner cell mass post-implantación gastrula gastrulación: diferenciación del ectodermo, mesodermo y endodermo embrionario inner cell mass germ cells trophoectoderm syncyotrophoblast endoderm primitive ectoderm primitive endoderm parietal yolk sac intestine, lungs, liver... ectoderm visceral yolk sac mesoderm chorion skin, nervous system... somites muscles, vertebrae, dermis extraembryonic mesoderm kidneys, heart, genital ridges... allantois, amnion Stem cell hierarchy: (puede originar todo el organismo) (ICM: puede originar las 3 capas germinales) (originan celulas de un linaje limitado) Embryonic stem cells: -Pluripotent cell lines derived from embryos: -ES cells: derived directly from inner cell mass (ICM) cells of blastocyst -Embryonic carcinoma (EC) cells : derived from teratocarcinomas after ICM cell transplant -Embryonic germ (EG) cells : derived from cultured primordial germ cells (PGC) Blastocyst chimaeric mouse 6.5-7.5 dpc 8.5 dpc primordial germ cells ES cells homologous recombination PGC culture EG cells Teratocarcinoma EC cells cannot originate germ cells Properties of pluripotent ES cells: -Derived from the inner cell mass of blastocyst. -Capable of unlimited divisions without differentiating (long-term self-renewal). -Maintain a stable, diploid, normal karyotype. -Can give rise to differentiated cell types that are derived from all three primary germ layers of the embryo (endoderm, mesoderm, and ectoderm), including the germ line. -Expresses the transcription factor Oct-4, which maintains ES cells in a proliferative, non-differentiating state. -Can be induced to continue proliferating or to differentiate. -Spend most of their time in the S phase of the cell cycle, during which they synthesise DNA. -Do not show X inactivation. Manipulaciones genéticas Ratones transgénicos -incorporación de un gen foráneo (transgen) en el ratón Ratones knockouts - deleción de un gen endógeno del ratón Manipulaciones genéticas Ratones knockouts Ratones transgénicos -incorporación de un gen foráneo (transgén) en el ratón -microinyección del transgén en el pronúcleo de cigotas de ratón -recombinación no homóloga -integración al azar en el genoma -múltiples cópias del transgén integradas Ratones transgénicos transgén: -3' UTR Gen de interés -promotor y -enhancer -intron pA -cDNA -gen con intrones/exones -reportero (GFP, lacZ) deteccíon de expresión: hibridación in situ : inmunohistoquímica (tag) : fluorescencia (GFP) : beta-gal staining (lacZ) Ratones transgénicos pipeta "holding" pronúcleo pipeta inyectora transgén cigota Microinyección pipeta inyectora pipeta holding Microinyección incubadora 37C/CO2 flujo laminar aparato de microinyección transgén hembras 4 w/o superovuladas microinyección pronuclear (100-200 cigotas) transferencia a hembra pseudopreñada (30 embriones/hembra) nacimiento de posibles transgénicos (20 días) genotipificación de los ratones destetados (20 días) PCR, Southern blot Ratones transgénicos expresión de lacZ (β-galactosidasa) en músculos esqueléticos - embrión de E13.5 con expresión de lacZ bajo el control del promotor de myf5 (factor de transcripción que controla desarrollo de los músculos) Patapoutian et al. 1993 M. Cerdán Enhancers neuronales de Pomc - transgénesis: 1 E nP EGFP Pomc 2 E nP neuronal enhancers promoter arcuate nucleus pituitary FSJ de Souza Enhancers neuronales de Pomc - transgénesis: 1 E nP EGFP 2 E nP neuronal enhancers ACTH immuno (endogenous POMC) Pomc promoter POMC-EGFP fluorescence R López-Leal Enhancers neuronales de Pomc - transgénesis: desarrollo embrionario E13.5 merge nPE1-tomato nPE2-EGFP merge Enhancers neuronales de Pomc - transgénesis: enhancers humanos - lacZ de Souza et al., 2005 Ratones knockout -deleción de un gen endógeno en el ratón -manipulación en cultivo de células ES de ratón (129X1/SvJ ) -recombinación homóloga -integración sítio-específica en el genoma -necesita un marcador de selección Ratones knockout: pasos • • • • • • • • Identificación y clonado del gén de interés Disrupción del gen de interés en un vector adecuado Introducción del gen mutado en células ES en cultivo Introducción de las células ES modificadas en blastocistos Transferencia del blastocisto a una madre receptora Identificación de crias con la modificación Retrocruza (backcross) por 10 generaciones Analisar fenotipo Ratones knockout gen salvaje (129X1/SvJ ES cell) 1 2 4 3 5’ 3’ recombinación homóloga 1 5’ 4 2 Neomycin Resistance Cassette vector 3’ Recombinación homologa en ES cells en cultivo Ratones knockout Inyección de ES cells modificadas (cepa 129) en blastocistos salvajes (cepa C57) 129X1/SvJ Stem Cell 129X1/SvJ Stem Cell C57BL/6J Blastocyst Generación de ratones knockout con ES cells modificadas non-chimaeric strong chimaera weak chimaera -129X1/SvJ = marrón -C57BL/6 = negra chimaera = "atigrada" BMP7 knockout kidney KO WT - ausencia de Bmp7 (proteina secretada señalizadora) causa subdesarrollo de los ojos y riñones Dickkopf-1 knockout - ausencia de dkk1 (factor secretado) causa la deleción del cerebro anterior (forebrain) Regiones regulatorias de Pomc - regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria 1 E nP 2 E nP neuronal enhancers Pomc promoter Regiones regulatorias de Pomc - regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria 1 E nP cassette de neor o) d a n o 2 leci E nP (de Pomc promoter regiones regulatorias también pueden ser knockeadas Regiones regulatorias de Pomc - regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria 1 E nP cassette de neor o) d a n o 2 leci E nP (de Pomc promoter Sistema Cre-LoxP - sistema para la creación de knockouts controlados por la expresión la recombinasa viral Cre - la recombinasa Cre reconoce sitios loxP en secuencias de DNA y excisa las secuencias flanqueadas por los sitios loxP (34 bp): ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT Sistema Cre-LoxP Neo Cassette exon X LoxP LoxP Cre Recombinase exon X LoxP = ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT LoxP 34 bp directional sequence exon Y exon Y Sistema Cre-LoxP exon X LoxP knockout condicional exon W LoxP Cre Recombinase exon X LoxP = ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT LoxP 34 bp directional sequence exon Y exon Y Sistema Cre-LoxP - lineas de ratones con cre bajo un promotor especifico permiten knock-outs espaciales y temporales Sistema Cre-LoxP - sistema Cre-loxP inducible: actividad de recombinasa Cre regulada por un ligando - Cre-ER: fusión de Cre con dominio de unión a estrógeno (mutado) - activación de Cre por inyección de tamoxifeno (análogo de estrógeno) inactivo ligand-binding domain activo agonista tamoxifeno: libera Cre-ER de HSP90 : Cre-ER entra al nucleo : recombinación HSP Sistema Cre-LoxP - inactivación controlada del gen Rax/Rx (factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo) DP Orquera, S Nasif, FSJ de Souza Sistema Cre-LoxP - inactivación controlada del gen Rax/Rx (factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo) Raxf/f; CreER injected E8.0 analysed E11.5 Raxf/f DP Orquera, S Nasif, FSJ de Souza Sistema Cre-LoxP - inactivación controlada del gen Rax/Rx (factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo) Raxf/f injected E9.5 analysed E11.5 Raxf/f; CreER Sistema Cre-LoxP - rescate de expresión de proopiomelanocortina (Pomc) en ratones adultos Bumaschny et al. (2012) JCI Sistema Cre-LoxP - rescate de expresión de proopiomelanocortina (Pomc) en ratones adultos Bumaschny et al. (2012) JCI Proyectos genoma terminados -Mus musculus (ratón) -Homo sapiens (humano) -Rattus norvegicus (rata) -Bos taurus (vaca) -Canis familiaris (perro) -Oryctolagus cuniculus (conejo) -Equus caballus (caballo) -Gallus gallus (gallina) en progreso -Sus scrofa (chancho) -Ovis aries (oveja) - otros... www.ensembl.org Proyectos genoma www.ensembl.org Mouse resources Genome sequence -Ensembl (www.ensembl.org) -UCSC genome browser (genome.ucsc.edu) Strain phenotypes -Mouse phenome (www.jax.org/phenome) Mutant distributors -Jackson Induced Mutant Resource (www.jax.org/imr/index.html) -Mutant Mouse Regional Resource Centers (www.mmrrc.org) Knockout lines -Knockout Mouse Project (www.komp.org) Manipulación genética molecular de animales de granja Transgénicos: microinyección pronuclear (cerdos, conejos, ovejas, cabras, vacas) Knockouts: imposible... Clonación Polly Dolly primero animal (rana Xenopus) clonado a partir de una célula adulta por transferencia nuclear Frog cloning - John Gurdon - clonación de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de células intestinales de renacuajos Premio Nobel Fisiología & Medicina 2012 (con S. Yamanaka) Frog cloning - John Gurdon - clonación de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de células intestinales de renacuajos Premio Nobel Fisiología & Medicina 2012 (con S. Yamanaka) primero mamífero clonado a partir de una célula fetal en cultivo Nature. 1996 Mar 07 fibroblastos fetales de oveja embriones reconstruidos ovejas clonadas (blancas) y madres nodrizas análisis por microsatélites 1. 2. donor cells (fresh or cultured) unfertilised egg/MII oocyte (fresh or usually from abbatoir) 3. enucleation 4. transfer donor nucleus 5. activation / fusion 6. culture gestation 7. transfer to surrogate primero mamífero clonado a partir de una célula adulta por transferencia nuclear Nature. 1997 Feb 27 - Dolly fue clonada a partir de una célula de mama (ubre) adulta Dolly the sheep Mamíferos clonados goat 1999 ferret 2006 cat 2002 mule 2003 sheep 1996 pig 2000 rabbit 2002 deer 2003 wolf 2007 cattle 1998 gaur 2000 banteng 2003 horse 2003 camel 2009 mouse 1998 mouflon 2001 rat 2003 dog 2005 ibex 2009 Manipulación genética molecular de mamíferos Aplicaciones potenciales - producción de proteinas recombinantes (p. ej: hormonas de mamifero en leche, etc) - mejoramiento de la calidad nutricional de carne o leche (p. ej: leche con más proteinas, carne de cerdo con omega-3 etc) - generación de mejores modelos de enfermedades humanas (p. ej: cerdos con fibrosis quistica, monos con enfermedad de Huntington) Transgenic sheep - generación de en fibroblastos fetales de oveja transgénicos: (factor IX de coagulación humano) factor IX de coagulación promotor de β-lactoglobulina para expresión en leche pA Transgenic sheep - generación de ovejas transgénicas por clonación es más eficiente que transgénesis por microinyección pronuclear Gene-targeted sheep Nature. 2000 Jun 29 - gene targeting en fibroblastos fetales de oveja COLT2 transgene: beta-lactoglobulin promoter (BLG) human a2-anti-trypsin (AAT) Nature. 2000 Jun 29 AAT humana en leche de oveja Nature. 2000 Jun 29 transgenes: beta-casein kappa-casein transfeccion de fibroblastos fetales bovinos fusion celular con ovocitos vacas transgenicas clonadas 8-20% mas beta-caseina 100% mas kappa-caseina en la leche de algunas vacas transgenicas - transfeccion de fibroblastos de fetos bovinos: lisostafina (hidrolasa de peptidoglicanos) con promotor de beta-lactoglobulina ovina - vacas transgénicas resistentes a la mastitis (Staphylococcus aureus) vacas PRNP -/- fibroblastos fetales de vacas: deleción de los alelos de PRNP (prion) por recombinación homóloga seguido de clonación α-1,3-galactosyl de celulas de chancho causan rechazo en primates en xenotransplantes - manipulación de fibroblastos fetales (knockout de α-1,3-Gal) seguida de clonación locus endogeno APRT: resistencia a G418 Bip: internal ribosomal entry site vector - modelo de fibrosis quística: knockout del gen CFTR en cerdos - deleción del exon 10 por un cassette de neo - manipulación de fibroblastos fetales seguido de clonación - cerdos tienen los mismos síntomas de humanos con fibrosis quística sintomas en humanos: - obstrucción del intestino - insuficiencia pancreatica - deformidades en el higado - inflamación crónica del pulmón modelos de ratón: - fenotipo suave cerdo modelo: - obstrucción del intestino - insuficiencia pancreatica - deformidades en el higado
